灭活前后HIV-1包膜基因变异的研究
作者：樊卫平 李敬云 王红霞 鲍作义 陈向伟
单位：樊卫平(山西医科大学微生物免疫学教研室，太原 030001)；李敬云(军事医学科学 院微生物流行病学研究所)；王红霞(军事医学科学 院微生物流行病学研究所)；鲍作义(军事医学科学 院微生物流行病学研究所)；陈向伟(山西医科大学微生物免疫学教研室，太原)
关键词：HIV；病毒，灭活；变异(遗传学)
山西医科大学学报000403 摘要：目的 深入了解HIV在灭活因素作用下包膜基因变异。方法 对HIV-1B3亚型毒株在S/D法及低pH法灭活作用前后的样品，套 式 PCR扩增其包膜基因C2～C3区564 bp 的核酸片段，进行核苷酸序列测定和分析。 结果 两种方法灭活前后，包膜基因变异均不显著，核苷酸同源性均为98%。结论 S/D法及低pH法灭活作用前后HIV包膜基因变异不显著。体外传代 HIV包膜基因趋于稳定。
, 百拇医药
中图分类号：R392.2 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)04-0294-03
Variation of HIV-1 env gene by inactiv ators
FAN Wei-ping LI Jing-yun WANG Hong-xia et al
(Dept.of Mi crobiology and Immunology, Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)
Abstract:Objective To thoroughly understand the variation of HIV-1 env gene under inactivators.Methods Taking the HIV befo re and after S/D,acid's exerting as the objects, en v gene C2-C3 region 564 bp fragment of these HIV was obtained by nest PCR, then sequenced and analyzed.Results Before and after the two inactivators exerting,all the env gene variation was indistinctive,necle otide homogeneity was all 98%.Conclusion Before and after the two inactivators exerting, the variation of HIV-1 env gene is indi stinctive. Serial passaged HIV env gene tends to stablility.
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Key words:HIV；virus,inactivated;variation (genetics)
溶剂/去污剂(solvent/detergent, S/D)法及低pH 法是常用的血制品灭活病毒的有效方法。在评价S/D法及低pH法灭活HIV试验中，发现不病变 样品经盲目传代可以传出病变，说明HIV在灭活因素作用下发生变异。我们曾用不同方式体 外 连续传代培养HIV，包括在MT4细胞自然传代培养，在MT4及HeLaCD4+细胞间反复更换宿主 细胞传代培养，多次冻融，间断使用传代培养，分析这些样品HIV包膜基因变异及生物学性 状改变，获得体外传代HIV包膜基因变异不显著，随着传代数的增加包膜基因核苷酸趋于稳 定 ，变异株趋于单纯化，生物学性状稳定的结论[1]。为了进一步了解灭活作用下体 外HIV(human immunodeficiency virus,HIV)包膜基因变异及生物学性状改变，了解是否象 齐多夫定(zidovudine,AZT)作用下编码逆转录酶的第219位[2]，215[3]位 氨基酸发生氨基酸替代一样，S/D法及低pH法作用下也存在包膜基因变异的选择作用位点， 我们取体外自然传代的第21代样品施以S/D及低丙球等灭活因素进行了下述研究。
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1 材料和方法
1.1 病毒、细胞、培养基 病毒为HIV-1B3亚型(引自美国)经实验室传至21代， 毒力为8. 0 TCID50/ml，细胞采用MT4细胞，系携HTLV的传代人T淋巴细胞(引自日本)，细胞培 养基为补加10%热灭活新生牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，含100 U/ml青霉素 ，100 mg/L 链霉素和5 mol/L Hepes。
1.2 低pH法和S/D法灭活HIV，获取待检样品 低丙球(pH 4)和S/D试剂的配制及灭活实验 见文献[4，5]。对低pH灭活2 h，S/D灭活30 min后不引起MT4细胞病变但经传代后 引起MT4 细胞病变的HIV样品，由细胞培养孔转种细胞培养瓶扩大培养，同时培养灭活前对照HIV样品 (第21代)，于第4 d 大多数细胞出现病变时，取沉积细胞提取核酸。
1.3 PCR扩增HIV前DNA包膜基因 取沉积的细胞用酚-氯仿抽提法提取带毒MT4细胞核酸； 依据文献[6]合成外侧引物ED3-ED14及内侧引物ED33-ED31，分别进行第一轮、第二 轮PCR扩增出HIV前DNA包膜基因C2～C3区及其附近的500 bp 左右核酸片段。1.5%琼脂 糖凝胶电泳确证扩增产物正确。
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1.4 核苷酸序列测定和分析 低融点胶回收纯化1.3中的PCR产物，连接于pGEM质粒载体( 美国Promeg公司)，转化XL-1Blue菌，筛选阳性克隆，扩大培养提取质粒(用美国Qiagen公司 质粒提取试剂盒)，酶切鉴定质粒后送大连宝生物公司用ABIPRISMTMQD 377 DNA全自 动测序仪测序，测序结果用GoldKey, Clustawl软件分析比较。
2 结果
2.1 各样品C2～C3区PCR扩增结果 见图1。由图1可知各样品PCR产物与DNA标准分子量的 616 bp接近而低于616 bp，说明扩增结果正确。
2.2 核苷酸序列变异分析 见表1。由表1可知，灭活作用前后两样品核苷酸同源性均为 98%，灭活作用后两样品与11代间的核苷酸同源性均为94%，与21代经体外自然传代所得的31 代间的核苷酸同源性也为98%。而灭活作用后两样品相互间的核苷酸同源性为99%。
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2.3 氨基酸序列比较结果 见图2。
3 讨论
由各样品核苷酸同源性比较结果可知，两法作
表1 灭活前后核苷酸同源性比较 (%)
11代
21代
S/D
低丙球
31代
11代
100
21代
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94
100
S/D
94
98
100
低丙球
94
98
99
100
31代
94
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98
98
100
注：“S/D”及“低丙球”代表相应灭活法作用后的样品。灭活前的样品(2 1代)系由11代体外自然传代而得，31代由21代体外自然传代得，详见文献[1]。
1.DNA标准分子量(pBR322/TagI)； 2.阴性(水)对照； 3. 标准质粒B3； 4.灭活前(21)代样品；
5.S/D灭活后样品； 6.酸灭活后样品
图1 PCR扩增结果图
用前后核苷酸同源性均为98%，说明S/D法或酸灭活法作用 前后，HIV包膜基因变异均不显著。而灭活作用后两样品相互间的核苷酸同源性为99%,与11 代间的核苷酸同源性均为94%低于与21代及31代间的98%的同源性。这说明无论灭活因素施加 与否体外HIV包膜基因变异性下降，核苷酸总是趋于稳定。结果明显支持此前不同方式体外 连续传代培养HIV获得的结论[1]。可以认为体外传代培养HIV，不论是在MT4细 胞自然传代，在MT4及HeLa细胞间反复更换宿主细胞传代，还是反复冻融，间断使用传代， 亦或 施加灭活因素传代，HIV包膜基因变异均不显著，包膜基因核苷酸趋于稳定，变异株趋于单 纯化[1]。这些结果与Delwart等用外周血单个核细胞体外培养 HIV获得的结果一 致[7]，却不同与以往HIV体内感染研究认为HIV具有高度变异性的结果[8] 。可能与体外培养环境单纯，缺乏免疫压力有关，也证明免疫压力是HIV变异的主要驱动力 [9]。
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图2 氨基酸序列比较图(“-”代表与上相同，11代因 出现终止密码子而 未能释译出氨基酸，斜体表示V3区)
关于S/D及低pH法灭活作用下HIV变异及其包膜基因突变的选择性作用位点 ，尚未见有报道。本研究发现除外体外自然传代也可能出现的包膜基因氨基酸替代[1 ]，最易发生变异的V3区无氨基酸替代发生，而两灭活法作用前后C2区第2位均由丙氨酸 替 代缬氨酸。C3区最末位丝氨酸替代天门冬氨酸，此外S/D法尚有V3环肽前约第18位的蛋氨酸 替 代苏氨酸，C3区末第6位的天门冬酰胺替代谷氨酸。具体突变选择作用位点尚待进一步证实 。也可能这两种灭活因素选择作用位点在包膜基因C2-C3区之外，而上述包膜基因变异只是 象 体外自然传代一样存在随机变异[1]。
本研究有待于对两灭活法作用后的变异株 再施以同样的灭活因素，观察其是否确已对相应的灭活因素产生耐受，并进一步分析其核苷 酸及氨基酸序列，后续工作尚在进行中。
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作者简介：樊卫平，女，1967年4月生，硕士，讲师.0001)
参考文献：
[1]樊卫平，李敬云，王红霞，等. HIV-1包膜基因变异的体外研究[J]. 中国病毒学， 2000，15 (2)： 127～135.
[2]Btendan AL,Katem EC，Sharon DK, et al.Zidovudine-resistant human immunodeficiency virus selected by passage in cell culture[J]. J Virol, 1991， 65 (10): 5232～5236.
[3]Cecilio LG, Jose MR, Rafael N,et al.Characterization of g enetic variation and 3′-azido-3′deoxythymidine resistance mutations of human i mm unodeficiency virus by the RNase amidmatchcleavage method[J]. Proc Natl Acad Sci (USA), 1991， 88 (10): 4280～4284.
, http://www.100md.com
[4]周铁群，邱平，王剑锋，等.对血液制品S/D病毒灭活方法的验证[J] . 中国生物制品学杂志， 1995， 8 (3)： 107～109.
[5]周铁君，邱平，王剑锋，等，对10厂家低PH静脉注射用人丙种球蛋白病 毒灭活工艺的验证[J]. 中国生物制品学杂志， 1999， 12 (2)： 106.
[6]Delwart EL,Herring B,Rodrigo AG,et al.Gentic subtyping of human immunodeficiency virus using a heteroduplex mobility assay[J]. PCR Meth Appl, 1995，4(Suppl)： 202～216.
[7]Delwart EL, Sheppard HW,Walker BD,et al.Human Immunodefici ency virus type 1 Evolution in vivo tracked by DNA heteroduplex mobility ass ays[J]. J Virol, 1994， 68 (10): 6672～6683.
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[8]Sakai KS,Dewhurst XM, Voisky DJ.Differences incytopathog enicit y and host cell range among infectious molecular clones in human immunodeficienc y virus type 1 simultaneously isolated from an individual[J]. J Virol, 1988， 62: 4078～4085.
[9]Yodhifs K,Nsksmuts M, ohno T. Muartions of the HIV type 1 V3 l oop under selection pressure with neutralizing monoclonal antibody NM-01[J]. AIDS Res Hum Retrovir, 1997， 13: 1283～1290.
收稿日期：2000-03-28, 百拇医药
单位：樊卫平(山西医科大学微生物免疫学教研室，太原 030001)；李敬云(军事医学科学 院微生物流行病学研究所)；王红霞(军事医学科学 院微生物流行病学研究所)；鲍作义(军事医学科学 院微生物流行病学研究所)；陈向伟(山西医科大学微生物免疫学教研室，太原)
关键词：HIV；病毒，灭活；变异(遗传学)
山西医科大学学报000403 摘要：目的 深入了解HIV在灭活因素作用下包膜基因变异。方法 对HIV-1B3亚型毒株在S/D法及低pH法灭活作用前后的样品，套 式 PCR扩增其包膜基因C2～C3区564 bp 的核酸片段，进行核苷酸序列测定和分析。 结果 两种方法灭活前后，包膜基因变异均不显著，核苷酸同源性均为98%。结论 S/D法及低pH法灭活作用前后HIV包膜基因变异不显著。体外传代 HIV包膜基因趋于稳定。
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中图分类号：R392.2 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)04-0294-03
Variation of HIV-1 env gene by inactiv ators
FAN Wei-ping LI Jing-yun WANG Hong-xia et al
(Dept.of Mi crobiology and Immunology, Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)
Abstract:Objective To thoroughly understand the variation of HIV-1 env gene under inactivators.Methods Taking the HIV befo re and after S/D,acid's exerting as the objects, en v gene C2-C3 region 564 bp fragment of these HIV was obtained by nest PCR, then sequenced and analyzed.Results Before and after the two inactivators exerting,all the env gene variation was indistinctive,necle otide homogeneity was all 98%.Conclusion Before and after the two inactivators exerting, the variation of HIV-1 env gene is indi stinctive. Serial passaged HIV env gene tends to stablility.
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Key words:HIV；virus,inactivated;variation (genetics)
溶剂/去污剂(solvent/detergent, S/D)法及低pH 法是常用的血制品灭活病毒的有效方法。在评价S/D法及低pH法灭活HIV试验中，发现不病变 样品经盲目传代可以传出病变，说明HIV在灭活因素作用下发生变异。我们曾用不同方式体 外 连续传代培养HIV，包括在MT4细胞自然传代培养，在MT4及HeLaCD4+细胞间反复更换宿主 细胞传代培养，多次冻融，间断使用传代培养，分析这些样品HIV包膜基因变异及生物学性 状改变，获得体外传代HIV包膜基因变异不显著，随着传代数的增加包膜基因核苷酸趋于稳 定 ，变异株趋于单纯化，生物学性状稳定的结论[1]。为了进一步了解灭活作用下体 外HIV(human immunodeficiency virus,HIV)包膜基因变异及生物学性状改变，了解是否象 齐多夫定(zidovudine,AZT)作用下编码逆转录酶的第219位[2]，215[3]位 氨基酸发生氨基酸替代一样，S/D法及低pH法作用下也存在包膜基因变异的选择作用位点， 我们取体外自然传代的第21代样品施以S/D及低丙球等灭活因素进行了下述研究。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 病毒、细胞、培养基 病毒为HIV-1B3亚型(引自美国)经实验室传至21代， 毒力为8. 0 TCID50/ml，细胞采用MT4细胞，系携HTLV的传代人T淋巴细胞(引自日本)，细胞培 养基为补加10%热灭活新生牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，含100 U/ml青霉素 ，100 mg/L 链霉素和5 mol/L Hepes。
1.2 低pH法和S/D法灭活HIV，获取待检样品 低丙球(pH 4)和S/D试剂的配制及灭活实验 见文献[4，5]。对低pH灭活2 h，S/D灭活30 min后不引起MT4细胞病变但经传代后 引起MT4 细胞病变的HIV样品，由细胞培养孔转种细胞培养瓶扩大培养，同时培养灭活前对照HIV样品 (第21代)，于第4 d 大多数细胞出现病变时，取沉积细胞提取核酸。
1.3 PCR扩增HIV前DNA包膜基因 取沉积的细胞用酚-氯仿抽提法提取带毒MT4细胞核酸； 依据文献[6]合成外侧引物ED3-ED14及内侧引物ED33-ED31，分别进行第一轮、第二 轮PCR扩增出HIV前DNA包膜基因C2～C3区及其附近的500 bp 左右核酸片段。1.5%琼脂 糖凝胶电泳确证扩增产物正确。
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1.4 核苷酸序列测定和分析 低融点胶回收纯化1.3中的PCR产物，连接于pGEM质粒载体( 美国Promeg公司)，转化XL-1Blue菌，筛选阳性克隆，扩大培养提取质粒(用美国Qiagen公司 质粒提取试剂盒)，酶切鉴定质粒后送大连宝生物公司用ABIPRISMTMQD 377 DNA全自 动测序仪测序，测序结果用GoldKey, Clustawl软件分析比较。
2 结果
2.1 各样品C2～C3区PCR扩增结果 见图1。由图1可知各样品PCR产物与DNA标准分子量的 616 bp接近而低于616 bp，说明扩增结果正确。
2.2 核苷酸序列变异分析 见表1。由表1可知，灭活作用前后两样品核苷酸同源性均为 98%，灭活作用后两样品与11代间的核苷酸同源性均为94%，与21代经体外自然传代所得的31 代间的核苷酸同源性也为98%。而灭活作用后两样品相互间的核苷酸同源性为99%。
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2.3 氨基酸序列比较结果 见图2。
3 讨论
由各样品核苷酸同源性比较结果可知，两法作
表1 灭活前后核苷酸同源性比较 (%)
11代
21代
S/D
低丙球
31代
11代
100
21代
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94
100
S/D
94
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低丙球
94
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31代
94
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注：“S/D”及“低丙球”代表相应灭活法作用后的样品。灭活前的样品(2 1代)系由11代体外自然传代而得，31代由21代体外自然传代得，详见文献[1]。
1.DNA标准分子量(pBR322/TagI)； 2.阴性(水)对照； 3. 标准质粒B3； 4.灭活前(21)代样品；
5.S/D灭活后样品； 6.酸灭活后样品
图1 PCR扩增结果图
用前后核苷酸同源性均为98%，说明S/D法或酸灭活法作用 前后，HIV包膜基因变异均不显著。而灭活作用后两样品相互间的核苷酸同源性为99%,与11 代间的核苷酸同源性均为94%低于与21代及31代间的98%的同源性。这说明无论灭活因素施加 与否体外HIV包膜基因变异性下降，核苷酸总是趋于稳定。结果明显支持此前不同方式体外 连续传代培养HIV获得的结论[1]。可以认为体外传代培养HIV，不论是在MT4细 胞自然传代，在MT4及HeLa细胞间反复更换宿主细胞传代，还是反复冻融，间断使用传代， 亦或 施加灭活因素传代，HIV包膜基因变异均不显著，包膜基因核苷酸趋于稳定，变异株趋于单 纯化[1]。这些结果与Delwart等用外周血单个核细胞体外培养 HIV获得的结果一 致[7]，却不同与以往HIV体内感染研究认为HIV具有高度变异性的结果[8] 。可能与体外培养环境单纯，缺乏免疫压力有关，也证明免疫压力是HIV变异的主要驱动力 [9]。
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图2 氨基酸序列比较图(“-”代表与上相同，11代因 出现终止密码子而 未能释译出氨基酸，斜体表示V3区)
关于S/D及低pH法灭活作用下HIV变异及其包膜基因突变的选择性作用位点 ，尚未见有报道。本研究发现除外体外自然传代也可能出现的包膜基因氨基酸替代[1 ]，最易发生变异的V3区无氨基酸替代发生，而两灭活法作用前后C2区第2位均由丙氨酸 替 代缬氨酸。C3区最末位丝氨酸替代天门冬氨酸，此外S/D法尚有V3环肽前约第18位的蛋氨酸 替 代苏氨酸，C3区末第6位的天门冬酰胺替代谷氨酸。具体突变选择作用位点尚待进一步证实 。也可能这两种灭活因素选择作用位点在包膜基因C2-C3区之外，而上述包膜基因变异只是 象 体外自然传代一样存在随机变异[1]。
本研究有待于对两灭活法作用后的变异株 再施以同样的灭活因素，观察其是否确已对相应的灭活因素产生耐受，并进一步分析其核苷 酸及氨基酸序列，后续工作尚在进行中。
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作者简介：樊卫平，女，1967年4月生，硕士，讲师.0001)
参考文献：
[1]樊卫平，李敬云，王红霞，等. HIV-1包膜基因变异的体外研究[J]. 中国病毒学， 2000，15 (2)： 127～135.
[2]Btendan AL,Katem EC，Sharon DK, et al.Zidovudine-resistant human immunodeficiency virus selected by passage in cell culture[J]. J Virol, 1991， 65 (10): 5232～5236.
[3]Cecilio LG, Jose MR, Rafael N,et al.Characterization of g enetic variation and 3′-azido-3′deoxythymidine resistance mutations of human i mm unodeficiency virus by the RNase amidmatchcleavage method[J]. Proc Natl Acad Sci (USA), 1991， 88 (10): 4280～4284.
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[4]周铁群，邱平，王剑锋，等.对血液制品S/D病毒灭活方法的验证[J] . 中国生物制品学杂志， 1995， 8 (3)： 107～109.
[5]周铁君，邱平，王剑锋，等，对10厂家低PH静脉注射用人丙种球蛋白病 毒灭活工艺的验证[J]. 中国生物制品学杂志， 1999， 12 (2)： 106.
[6]Delwart EL,Herring B,Rodrigo AG,et al.Gentic subtyping of human immunodeficiency virus using a heteroduplex mobility assay[J]. PCR Meth Appl, 1995，4(Suppl)： 202～216.
[7]Delwart EL, Sheppard HW,Walker BD,et al.Human Immunodefici ency virus type 1 Evolution in vivo tracked by DNA heteroduplex mobility ass ays[J]. J Virol, 1994， 68 (10): 6672～6683.
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[8]Sakai KS,Dewhurst XM, Voisky DJ.Differences incytopathog enicit y and host cell range among infectious molecular clones in human immunodeficienc y virus type 1 simultaneously isolated from an individual[J]. J Virol, 1988， 62: 4078～4085.
[9]Yodhifs K,Nsksmuts M, ohno T. Muartions of the HIV type 1 V3 l oop under selection pressure with neutralizing monoclonal antibody NM-01[J]. AIDS Res Hum Retrovir, 1997， 13: 1283～1290.
收稿日期：2000-03-28, 百拇医药