APP17肽对糖尿病小鼠脑Tau蛋白的影响
作者：赵志炜 赵咏梅 姬志娟 盛树力 王蓬文
单位：赵志炜 赵咏梅 姬志娟 盛树力(首都医科大学宣武医院脑老化研究实验室)；王蓬文(首都医科大学病理学教研室)
关键词：糖尿病脑病；Tau蛋白；APP17肽；免疫组化
首都医科大学学报000404 提要：应用免疫组化方法，观察对照组、糖尿病组和糖尿病APP17肽治疗组小鼠脑内Tau蛋白的分布，以探讨APP17肽对糖尿病小鼠脑神经元Tau蛋白表达的影响。结果：用 Tau-1单染，正常小鼠脑及 APP17肽治疗的糖尿病小鼠脑压后颗粒皮质及海马阳性反应神经元数目多。糖尿病小鼠只有用蛋白磷酸酯酶(PP-2B) 脱磷酸后阳性反应神经元数目及染色程度才与正常组接近。提示：糖尿病小鼠脑内正常Tau蛋白表达障碍，有过度磷酸化，而APP17肽可改善Tau蛋白过度磷酸化。
中图分类号：R32
, 百拇医药
Effect of APP17mer Peptide on Tau Protein in Murine Diabetic Brain
Zhao Zhiwei,Zhao Yongmei,Ji Zhijuan,Sheng Shuli
(Beijing Brain Aging Research Laboratory,Xuanwu Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Wang Pengwen
(Faculty of Pathology,Capital University of Medical Sciences)
Abstract:The distribution of tau protein in the brain was studied in the groups of the healthy,controled mice,diabetic mice,and diabetic mice treated with APP17mer peptide,in order to examine the effect of APP17mer peptide on phosphorylation of tau protein and its potential to treat neurodegeneration.The diabetic mouse model was created with STZ.APP17mer peptide was used for treatment.Four weeks later,cryostat sections of the brain was prepared for immunohistochemical study with Tau-1 monoclonal antibody and after dephosphorylation with phosphatase PP-2B.On staining with Tau-1 the brain of the healthy mice and the diabetic mice treated with APP17mer peptide showed numerous immunopositive cells in the granular layer of the cortex,and in the hippocampus.The staining was dark (P<0.05).Only after dephosphorylation with PP-2B did the number and staining of immunopositive neurons in diabetic mice reach the level in healthy mice.The results demonstrate that tau protein is phosphorylated at Ser202/Ser205 in diabetic mice.APP17mer peptide can prevent the phosphorylation of tau protein at these sites.
, 百拇医药
Key words:diabetic encephalopathy;tau protein;APP17mer peptide;immunohistochemistry
糖尿病病人常存在认知功能障碍[1]，国外学者研究发现糖尿病和痴呆密切相关，但这一关系的分子基础未见报道。神经纤维缠结(NFT)是老年性痴呆患者病理上的一大特征[2]。NFT是Tau蛋白过度磷酸化形成的。Tau蛋白为磷蛋白，磷酸化程度决定Tau蛋白与微管蛋白结合的能力。每分子正常Tau蛋白含2～3个磷酸基，能与微管蛋白结合形成细胞存活所必需的微管。Tau蛋白过度磷酸化时则不能与微管蛋白结合，而是互相结合或与正常的Tau蛋白结合形成成对螺旋细丝(PHF)，进一步发展可形成 NFT[3]。APP17肽(β-淀粉样肽前体蛋白 319-335)能促进神经轴突生长和突触形成。1999年1月至7月，我们应用APP17肽给糖尿病脑病小鼠进行治疗，观察Tau蛋白在正常小鼠、糖尿病小鼠及糖尿病用APP17肽治疗组小鼠脑内的分布及其磷酸化的程度，以探讨APP17肽对糖尿病小鼠脑神经元Tau蛋白表达的影响，开拓其防治神经元退变疾病的可能性。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物及动物模型建立
昆明小鼠，雄性，体质量32～37 g，鼠龄8周，购自中国医学科学院药物研究所。分为正常对照组(C组)、糖尿病组(DM组)和APP17肽治疗组(APP17P+DM组)3组。APP17肽由本室合成。链尿佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，用枸橼酸缓冲液溶解STZ，DM组小鼠和APP17P+DM组小鼠按200 mg/kg 剂量腹腔一次性注射STZ溶液，C组小鼠注射相应剂量的枸橼酸缓冲液。4 d后测尾部非禁食血糖，大于15 mmol/L被认为糖尿病模型建立。成模后DM组小鼠11只，APP17P+DM组12只，C组小鼠13只。APP17P+DM组于糖尿病造模2周后皮下注射APP17肽，每次0.35 μg/只，1次/d，共注射2周。
1.2 实验动物取材
注射STZ 4周后，用4%中性多聚甲醛灌注固定，取出动物大脑投入30%蔗糖中性多聚甲醛中后固定。
, 百拇医药
1.3 免疫组化染色
取固定后鼠脑中段行冰冻切片，厚40 μm，从3组中各选相同部位、相同数量的切片作Tau-1、蛋白磷酸酶-2B(PP-2B)脱磷酸化后Tau-1免疫组化染色[4]。PP-2B酶、Tau-1抗体由美国Iqbal K教授赠送。SP试剂盒购自Zymed Laboratories公司，实验步骤按说明进行，阴性对照一抗以正常血清替代。
1.4 免疫组化结果观察及定量分析
结果经显微镜下形态学观察，半定量分析。每组动物于相应的海马部位连续切片，每隔2张取1张，共取18张切片。在10倍物镜下1个白细胞计数板下计算海马和压后颗粒皮质的阳性细胞数目。用奔腾Visilog 5.0图像分析软件随机选取胞质着色处，测OD值，以反映染色强度。染色深度与所测数值成反比，即片子着色越深，灰度比例OD值越小，每张切片测6个值，共108个值。
, http://www.100md.com
数据处理：采用 SPSS 软件，计数资料用均数±标准差表示，用方差分析法进行显著性检验。
2 结果
2.1 形态学观察
C组及APP17P+DM组小鼠用Tau-1单染，海马和压后颗粒皮质可见阳性反应神经元，数目多，染色深，高倍镜下见其胞核基本不着色，胞质和突起深染，可见到2～3级树突分枝。DM组这2个区域的阳性反应神经元数目比C组及APP17P+DM组小鼠明显减少，染色淡，高倍镜下见其细胞轮廓不清晰，胞质着色淡，见不到明显的树突分枝。将DM组脑组织进行PP-2B酶脱磷酸处理后再用Tau-1单抗染色，可见阳性染色神经元数目及染色程度与C组接近。
2.2 Tau-1、脱磷酸后Tau-1分布观察
3组Tau-1及脱磷酸后Tau-1染色阳性细胞位于海马及压后颗粒皮质。APP17肽治疗组与C组阳性反应神经元数量相似，明显多于DM组。DM组脱磷酸后Tau-1染色阳性神经元数量才与正常组接近，结果见表1。
, 百拇医药
表1 3组小鼠脑组织海马和压后颗粒皮质免疫组化染色阳性细胞数比较 组别
n
海马
压后颗粒皮质
Tau-1
脱磷酸后Tau-1
Tau-1
脱磷酸后Tau-1
C
13
18.3±4.7*
18.0±4.3
, 百拇医药
24.00±9.4* *
24.87±6.0
DM
11
6.5±3.1
16.4±3.5△ △
12.40±3.7
24.40±4.0△ △
APP17P+DM
12
16.6±4.5*
, 百拇医药
17.8±5.4
23.50±6.5* *
27.57±4.3
与DM组比较*P<0.05，* *P<0.01；与同一部位DM组比较△ △P<0.012.3 Tau-1、脱磷酸后Tau-1染色深浅测量
C组Tau-1染色深，OD值小。APP17P+DM组与C组相似。DM组染色浅，OD值大，与C组、APP17P+DM组比较差异显著。脱磷酸后Tau-1染色DM组染色深浅才与正常组接近，结果见表2。
表2 3组小鼠脑组织海马和压后颗粒皮质免疫组化染色阳性细胞灰度比例OD值比较
组别
n
, http://www.100md.com
海马
压后颗粒皮质
Tau-1
脱磷酸后Tau-1
Tau-1
脱磷酸后Tau-1
C
13
87.1±7.4*
80.2±13.0
90.1±5.6*
90.4±5.5
, http://www.100md.com
DM
11
102.2±8.1
83.1±10.0
127.2±7.8
91.2±5.7
APP17P+DM
12
88.5±7.5*
82.5±10.2
89.9±5.7*
89.6±4.5
, 百拇医药
*与DM组比较P<0.053 讨论
用链尿佐菌素诱导糖尿病动物模型已被广泛应用于糖尿病的研究。糖尿病引起周围神经系统及其他系统并发症已有很多报道，其引起中枢神经系统病变报道虽少，但结果是肯定的[5]。
本实验以STZ诱导小鼠糖尿病模型，用Tau-1单抗免疫组化染色可见正常小鼠脑组织皮质、海马内出现多量阳性反应细胞；而DM组小鼠脑组织只有用PP-2B脱磷酸后Tau-1阳性染色才与C组相似，因为Tau-1单抗不能与Ser202/Thr205位点磷酸化的Tau蛋白起反应，因此说明糖尿病小鼠脑内出现了Tau蛋白Ser202/Thr205 位点过度磷酸化。而通过皮下注射APP17肽治疗组的染色结果与正常组相似，说明APP17肽可防止糖尿病小鼠Tau蛋白在Ser202/Thr205位点磷酸化。文献报道由α分泌酶水解的可溶性APP(sAPPα)对神经元的损伤有保护作用，此作用与C端结合区有关[6]。我们的实验表明应用APP17肽可使Tau蛋白不出现过度磷酸化，从而改变神经元的超微结构、神经递质的传递，改善鼠学习、记忆功能，为APP17肽在其他神经元退变疾病的防治提供了重要的参考价值。
, 百拇医药
参考文献
1，Ott A,Stolk P P,Hofman A,et al.Association of diabetes mellitus and dementia:The rotterdam study.Diabetologia,1996,11:1392
2，Beffert U,Poirier J.Apolipoprotein E,plaques,tangles and cholinergic dysfunction in Alzheimer′s disease.Ann N Y Acad Sci,1996,777:166
3，盛树力,裴进京.老年痴呆的临床和分子学基础.北京:科学技术文献出版社,1998.14
4，Pei J J,Serson E,Iqbal K,et al.Expression of protein phosphatases(PP-1,PP-2A,PP-2B and PP-1B)and protein kinase(MAP kinase and P43cdc2)in the hippocampus of patients with Alzheimer′s disease and normal aged individuals.Brain Res,1994,655:70
, 百拇医药
5，Sinclair A J,Allard I,Bayer A.Observation of diabeties care in longterm institutional settings with measures of cognitive function and dependency.Diabeties Care,1997,5:778
6，Furukawa K,Sopher B L,Rydel R E,et al.Increased activity-regulating and neuroprotective efficacy of alpha-secretase-derived secreted amyloid precursor protein conferred by a c-terminal heparin-binding domain.J Neurochem,1996,67:1882
收稿日期：1999-11-30, 百拇医药
单位：赵志炜 赵咏梅 姬志娟 盛树力(首都医科大学宣武医院脑老化研究实验室)；王蓬文(首都医科大学病理学教研室)
关键词：糖尿病脑病；Tau蛋白；APP17肽；免疫组化
首都医科大学学报000404 提要：应用免疫组化方法，观察对照组、糖尿病组和糖尿病APP17肽治疗组小鼠脑内Tau蛋白的分布，以探讨APP17肽对糖尿病小鼠脑神经元Tau蛋白表达的影响。结果：用 Tau-1单染，正常小鼠脑及 APP17肽治疗的糖尿病小鼠脑压后颗粒皮质及海马阳性反应神经元数目多。糖尿病小鼠只有用蛋白磷酸酯酶(PP-2B) 脱磷酸后阳性反应神经元数目及染色程度才与正常组接近。提示：糖尿病小鼠脑内正常Tau蛋白表达障碍，有过度磷酸化，而APP17肽可改善Tau蛋白过度磷酸化。
中图分类号：R32
, 百拇医药
Effect of APP17mer Peptide on Tau Protein in Murine Diabetic Brain
Zhao Zhiwei,Zhao Yongmei,Ji Zhijuan,Sheng Shuli
(Beijing Brain Aging Research Laboratory,Xuanwu Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Wang Pengwen
(Faculty of Pathology,Capital University of Medical Sciences)
Abstract:The distribution of tau protein in the brain was studied in the groups of the healthy,controled mice,diabetic mice,and diabetic mice treated with APP17mer peptide,in order to examine the effect of APP17mer peptide on phosphorylation of tau protein and its potential to treat neurodegeneration.The diabetic mouse model was created with STZ.APP17mer peptide was used for treatment.Four weeks later,cryostat sections of the brain was prepared for immunohistochemical study with Tau-1 monoclonal antibody and after dephosphorylation with phosphatase PP-2B.On staining with Tau-1 the brain of the healthy mice and the diabetic mice treated with APP17mer peptide showed numerous immunopositive cells in the granular layer of the cortex,and in the hippocampus.The staining was dark (P<0.05).Only after dephosphorylation with PP-2B did the number and staining of immunopositive neurons in diabetic mice reach the level in healthy mice.The results demonstrate that tau protein is phosphorylated at Ser202/Ser205 in diabetic mice.APP17mer peptide can prevent the phosphorylation of tau protein at these sites.
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Key words:diabetic encephalopathy;tau protein;APP17mer peptide;immunohistochemistry
糖尿病病人常存在认知功能障碍[1]，国外学者研究发现糖尿病和痴呆密切相关，但这一关系的分子基础未见报道。神经纤维缠结(NFT)是老年性痴呆患者病理上的一大特征[2]。NFT是Tau蛋白过度磷酸化形成的。Tau蛋白为磷蛋白，磷酸化程度决定Tau蛋白与微管蛋白结合的能力。每分子正常Tau蛋白含2～3个磷酸基，能与微管蛋白结合形成细胞存活所必需的微管。Tau蛋白过度磷酸化时则不能与微管蛋白结合，而是互相结合或与正常的Tau蛋白结合形成成对螺旋细丝(PHF)，进一步发展可形成 NFT[3]。APP17肽(β-淀粉样肽前体蛋白 319-335)能促进神经轴突生长和突触形成。1999年1月至7月，我们应用APP17肽给糖尿病脑病小鼠进行治疗，观察Tau蛋白在正常小鼠、糖尿病小鼠及糖尿病用APP17肽治疗组小鼠脑内的分布及其磷酸化的程度，以探讨APP17肽对糖尿病小鼠脑神经元Tau蛋白表达的影响，开拓其防治神经元退变疾病的可能性。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物及动物模型建立
昆明小鼠，雄性，体质量32～37 g，鼠龄8周，购自中国医学科学院药物研究所。分为正常对照组(C组)、糖尿病组(DM组)和APP17肽治疗组(APP17P+DM组)3组。APP17肽由本室合成。链尿佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，用枸橼酸缓冲液溶解STZ，DM组小鼠和APP17P+DM组小鼠按200 mg/kg 剂量腹腔一次性注射STZ溶液，C组小鼠注射相应剂量的枸橼酸缓冲液。4 d后测尾部非禁食血糖，大于15 mmol/L被认为糖尿病模型建立。成模后DM组小鼠11只，APP17P+DM组12只，C组小鼠13只。APP17P+DM组于糖尿病造模2周后皮下注射APP17肽，每次0.35 μg/只，1次/d，共注射2周。
1.2 实验动物取材
注射STZ 4周后，用4%中性多聚甲醛灌注固定，取出动物大脑投入30%蔗糖中性多聚甲醛中后固定。
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1.3 免疫组化染色
取固定后鼠脑中段行冰冻切片，厚40 μm，从3组中各选相同部位、相同数量的切片作Tau-1、蛋白磷酸酶-2B(PP-2B)脱磷酸化后Tau-1免疫组化染色[4]。PP-2B酶、Tau-1抗体由美国Iqbal K教授赠送。SP试剂盒购自Zymed Laboratories公司，实验步骤按说明进行，阴性对照一抗以正常血清替代。
1.4 免疫组化结果观察及定量分析
结果经显微镜下形态学观察，半定量分析。每组动物于相应的海马部位连续切片，每隔2张取1张，共取18张切片。在10倍物镜下1个白细胞计数板下计算海马和压后颗粒皮质的阳性细胞数目。用奔腾Visilog 5.0图像分析软件随机选取胞质着色处，测OD值，以反映染色强度。染色深度与所测数值成反比，即片子着色越深，灰度比例OD值越小，每张切片测6个值，共108个值。
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数据处理：采用 SPSS 软件，计数资料用均数±标准差表示，用方差分析法进行显著性检验。
2 结果
2.1 形态学观察
C组及APP17P+DM组小鼠用Tau-1单染，海马和压后颗粒皮质可见阳性反应神经元，数目多，染色深，高倍镜下见其胞核基本不着色，胞质和突起深染，可见到2～3级树突分枝。DM组这2个区域的阳性反应神经元数目比C组及APP17P+DM组小鼠明显减少，染色淡，高倍镜下见其细胞轮廓不清晰，胞质着色淡，见不到明显的树突分枝。将DM组脑组织进行PP-2B酶脱磷酸处理后再用Tau-1单抗染色，可见阳性染色神经元数目及染色程度与C组接近。
2.2 Tau-1、脱磷酸后Tau-1分布观察
3组Tau-1及脱磷酸后Tau-1染色阳性细胞位于海马及压后颗粒皮质。APP17肽治疗组与C组阳性反应神经元数量相似，明显多于DM组。DM组脱磷酸后Tau-1染色阳性神经元数量才与正常组接近，结果见表1。
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表1 3组小鼠脑组织海马和压后颗粒皮质免疫组化染色阳性细胞数比较 组别
n
海马
压后颗粒皮质
Tau-1
脱磷酸后Tau-1
Tau-1
脱磷酸后Tau-1
C
13
18.3±4.7*
18.0±4.3
, 百拇医药
24.00±9.4* *
24.87±6.0
DM
11
6.5±3.1
16.4±3.5△ △
12.40±3.7
24.40±4.0△ △
APP17P+DM
12
16.6±4.5*
, 百拇医药
17.8±5.4
23.50±6.5* *
27.57±4.3
与DM组比较*P<0.05，* *P<0.01；与同一部位DM组比较△ △P<0.012.3 Tau-1、脱磷酸后Tau-1染色深浅测量
C组Tau-1染色深，OD值小。APP17P+DM组与C组相似。DM组染色浅，OD值大，与C组、APP17P+DM组比较差异显著。脱磷酸后Tau-1染色DM组染色深浅才与正常组接近，结果见表2。
表2 3组小鼠脑组织海马和压后颗粒皮质免疫组化染色阳性细胞灰度比例OD值比较
组别
n
, http://www.100md.com
海马
压后颗粒皮质
Tau-1
脱磷酸后Tau-1
Tau-1
脱磷酸后Tau-1
C
13
87.1±7.4*
80.2±13.0
90.1±5.6*
90.4±5.5
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DM
11
102.2±8.1
83.1±10.0
127.2±7.8
91.2±5.7
APP17P+DM
12
88.5±7.5*
82.5±10.2
89.9±5.7*
89.6±4.5
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*与DM组比较P<0.053 讨论
用链尿佐菌素诱导糖尿病动物模型已被广泛应用于糖尿病的研究。糖尿病引起周围神经系统及其他系统并发症已有很多报道，其引起中枢神经系统病变报道虽少，但结果是肯定的[5]。
本实验以STZ诱导小鼠糖尿病模型，用Tau-1单抗免疫组化染色可见正常小鼠脑组织皮质、海马内出现多量阳性反应细胞；而DM组小鼠脑组织只有用PP-2B脱磷酸后Tau-1阳性染色才与C组相似，因为Tau-1单抗不能与Ser202/Thr205位点磷酸化的Tau蛋白起反应，因此说明糖尿病小鼠脑内出现了Tau蛋白Ser202/Thr205 位点过度磷酸化。而通过皮下注射APP17肽治疗组的染色结果与正常组相似，说明APP17肽可防止糖尿病小鼠Tau蛋白在Ser202/Thr205位点磷酸化。文献报道由α分泌酶水解的可溶性APP(sAPPα)对神经元的损伤有保护作用，此作用与C端结合区有关[6]。我们的实验表明应用APP17肽可使Tau蛋白不出现过度磷酸化，从而改变神经元的超微结构、神经递质的传递，改善鼠学习、记忆功能，为APP17肽在其他神经元退变疾病的防治提供了重要的参考价值。
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参考文献
1，Ott A,Stolk P P,Hofman A,et al.Association of diabetes mellitus and dementia:The rotterdam study.Diabetologia,1996,11:1392
2，Beffert U,Poirier J.Apolipoprotein E,plaques,tangles and cholinergic dysfunction in Alzheimer′s disease.Ann N Y Acad Sci,1996,777:166
3，盛树力,裴进京.老年痴呆的临床和分子学基础.北京:科学技术文献出版社,1998.14
4，Pei J J,Serson E,Iqbal K,et al.Expression of protein phosphatases(PP-1,PP-2A,PP-2B and PP-1B)and protein kinase(MAP kinase and P43cdc2)in the hippocampus of patients with Alzheimer′s disease and normal aged individuals.Brain Res,1994,655:70
, 百拇医药
5，Sinclair A J,Allard I,Bayer A.Observation of diabeties care in longterm institutional settings with measures of cognitive function and dependency.Diabeties Care,1997,5:778
6，Furukawa K,Sopher B L,Rydel R E,et al.Increased activity-regulating and neuroprotective efficacy of alpha-secretase-derived secreted amyloid precursor protein conferred by a c-terminal heparin-binding domain.J Neurochem,1996,67:1882
收稿日期：1999-11-30, 百拇医药