螺旋藻多糖抗癌作用的实验研究
作者：曲显俊 崔淑香 解砚英 侯金玲 周玲 董强
单位：曲显俊 崔淑香 解砚英 侯金玲 周玲 董强(山东省医学科学院药物研究所，济南 250062)
关键词：螺旋藻多糖，抗癌作用，免疫作用
中国海洋药物000403
摘要 本实验对螺旋藻多糖的抗癌作用进行了体内外实验研究和作用机理探讨。以0.3～1.5g.L-1对B37乳腺癌细胞的抑制率最高可达68.0%，对K562白血病细胞抑制率为46.0%，对两细胞的IC50分别为1.48和1.56g.L-1。当螺旋藻多糖以300，150和75mg.kg-1灌胃给药时，对小鼠S180肉瘤的抑瘤率分别为55.2%，44.6%和33.8%；对H22小鼠肝癌的抑瘤率分别为47.1%，36.4%和31.0%；对EAC小鼠腹水癌的抑瘤率分别为56.9%，44.7%和22.8%，同时具有明显提高荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的作用。以MTT法检测螺旋藻多糖的荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化和对NK细胞活性的影响，也显示具有提高淋巴细胞转化率和促进NK细胞杀伤靶细胞的作用。测定螺旋藻多糖对脾淋巴细胞TNF-α诱生作用，大剂量组上清液可达75×10-3IU.L-1(对照组34×10-3IU.L-1)，并有较好的剂量-效应关系。PSP治疗后的荷瘤小鼠其脾淋巴细胞产生白细胞介素-2(rIL-2)的功能增强。另外，口服螺旋藻多糖还具有一定提升或恢复因使用环磷酰胺所致动物外周血白细胞降低的作用。
, 百拇医药
螺旋藻多糖具有广泛的生物学活性。以往研究多集中于抗衰老，提高免疫作用等方面。近年来其在抗肿瘤方面的作用又引起了人们的重视。由于它是天然化合物，且具有无毒，高效的特点，明显不同于常用细胞毒类抗癌药，因此，有必要系统地研究其抗癌疗效和作用机理。本文以钝顶螺旋藻提取多糖并对该多糖在体内外的抗癌活性和作用机理进行了研究。
ANTITUMOR STUDIES ON THE POLYSACCHRIDES SPIRULINA PLATENSIS
Q
Xianjun，Cui Shuxiang，Xie Yanying，Hou Jinling，Zhou ling，Dong Qiang
(Dept.Pharmacology,Institute of Medica Materia,Shandong Academy of Medical Science,Jinan 250062)
, 百拇医药
ABSTRACT The antitumor effects of polysacchrides Spirulina Platensis (PSP) were studied in vivo and vitro.In vitro tests,the highest inhibited rates on B37 mamma carcinoma cells and K562 leukemic cells were 68.0% and 46.0% respectively when the concentration was 0.3～1.5g.L-1.In vivo tests,when the dosage were 300,150,and 75mg.kg-1 p.o,the inhibited rates were 55.2%,44.6% and 33.8%;47.1%,36.4% and 31.0% and 56.9%,44.7% and 22.8% respectively on the transplanted tumor cells of Sarcinoma 180,H22 Hepatic tumor and EAC tumor cells in mice.PSP is biological activated substance which has widely immune effect.It had the effects of increasing the weight of spleen and thymus and of increasing proliferation of activated NK cell activity and TNF-α levels from 34×10-3 to 75×10-3IU.L-1 and of having function of activated splenocyte to produce interleukin-2(rIL-2) in tumor-bearing mice.It is suggested that PSP has the ability to inhibit tumor and mechanism is partly to enhance immunity in tumor-bearing imce.In addition,enhancing or recovering the number of WBC which reduced by CTX is also important function in treatment of tumor.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Polysacchrides Spirulina Platensis(PSP),Antitumor effect,Immune effect
1 材料
1.1 螺旋藻(Spirulina platensis)多糖(PSP) 作者自己提取，白色粉末状结晶，纯度86.9%，将另文发表。
1.2 动物 Balb/c小鼠，体重19-22g，昆明种小鼠，体重19～22g，山东医科大学实验动物中心提供。
1.3 化学药品和试剂 rIL-2,每瓶2×106IU，上海华新生物高新技术公司产品，批号970305；TNF-α和TNF-α单克隆抗体，由中国军事医学科学院邦定生物公司提供；放线菌素D(Actinomycin D),每支5mg，Fluka产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)和CoA,Sigma 公司产品；济南假单胞菌苗(Pseudomonas Jinanese Vaccine 简称PJV)，5-呋喃氟脲嘧啶(简称FT-207)，齐鲁制药厂产品；96孔培养板，NUNCLON公司产品。
, 百拇医药
1.4 肿瘤细胞株 S180小鼠肉瘤；HepA小鼠肝癌，EAC小鼠腹水瘤，B37乳腺癌细胞，K562白血病细胞，L929TNF敏感细胞，CTLL-2 rIL-2依赖细胞均由本室保存。
1.5 仪器 DG 3022A型酶联免疫检测仪，南京华东电子管厂出品；Forma 311 型CO2孵箱，Forma公司产品；GB 303型电子分析天平，METTLER公司产品。
2 方法
2.1 PSP体外对B37和K562细胞的生长抑制作用观察
分别取对数生长期细胞，胰酶消化后以含10%FCS的RPMI 1640培养液稀释细胞，按每孔10000加入96孔培养板中，每孔0.2mL,4h后加入不同稀释度的PSP，并以阿霉素(0.3mg.L-1)作阳性对照，每个浓度设3个复孔，置37℃ 5%CO2孵箱中连续培养72h,培养结束前4h各孔加入MTT 10μL(5g.L1)。经离心，洗涤加入DMSO充分震荡混匀后于酶标仪570nm处测A值。
, 百拇医药
2.2 PSP对小鼠移植性肿瘤的抑制作用
无菌取传代后5d的瘤细胞悬液，经生理盐水稀释计数后调整细胞至2×1010～6×1010/L，接种于小鼠右侧腋下部位，每只0.2mL。次日随机分组，每组10只，对照组动物数为试验组鼠数×组数，分别为PSP大剂量组(300mg.kg-1)中剂量组(150mg*kg-1)，小剂量组(75mg*kg-1)，FT207对照组(120mg*kg-1)灌胃给药，每只0.8mL，每日1次，连续10d，同时设立PJV对照组(20mg*kg-1,隔日皮下注射)。第11d处死小鼠取瘤块称重，计算抑瘤率，脾指数和胸腺指数。
2.3 PSP促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化实验[1，2]
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取Balb/c小鼠按上述方法接种S180瘤细胞并分组给药10d。无菌取脾制成单细胞悬液，经NH3 CI-Tris溶解、Hank′s液洗涤红细胞后以含10% FCS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度1×1010/L，加入96孔板中，每孔0.1mL,设加CoA (0.1mL,10mg*L-1)孔和不加CoA(加0.1mL培养基)对照孔，置5%CO2 37℃孵箱中培养72h，同2.1测A值，以各组加CoA孔OD值与不加CoA对照孔A值比较，计算淋巴细胞转化率。
2.4 NK细胞活性测定[1，2]
同2.3处理动物和制备脾细胞。取经CoA激活72h的脾细胞作效应细胞，洗去CoA后，调整细胞浓度至1×1010/L，每孔0.1mL, 入培养板中，即每孔1×106，另取K562细胞作为靶细胞，每孔加入2×108/L，效应细胞，靶细胞＝50：1与上述不同药物处理的脾细胞作混合培养10h。同2.1测A值，以各组混合培养孔A值减去该组效应细胞培养孔A值，并与靶细胞孔A值之比得杀伤率(%)。
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2.5 PSP对荷瘤小鼠TNF-α的诱生作用测定[3、4]
2.5.1 TNF-α的诱生
动物分组及治疗方法同2.4制备培养脾细胞上清液。
2.5.2 制备TNF-α标准曲线及各组上清液测定
以96孔培养板加入不同浓度的TNF-α标准品50μL(终浓度分别为20×10-3，40×10-3，60×10-3和80×10-3IU*L-1)，制定标准曲线。在另一区域，加入不同浓度的各组脾细胞诱导上清液50μL，共同加入终浓度为1mg*L的Act-D 50μL，最后加入L929细胞50μL,置37℃，5%CO2孵箱中孵育20h。
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2.5.3 TNF-α中和试验
按(2.5.3)方法在96孔板中加入不同稀释浓度的TNF-α单克隆抗体50μL(终浓度1mg*L-1)，混匀置37℃ 5%CO2孵箱中。45min后再依次加入Act-D和细胞，同上培养20h。同2.1测A值。
2.6 PSP对荷瘤小鼠脾淋巴细胞rIL-2水平的影响[3、4]
2.6.1 rIL-2诱生
动物处理方法同2.3制备脾细胞悬液，培养基稀释至5×109/L，加入24孔板中，每孔1mL，再加入含CoA的培养液1mL(5mg*L-1)，置37℃，5%CO2的孵箱中培养24h，取上清液离心后-20℃备用。
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2.6.2 标准rIL-2活性的标定及各组诱导上清液的测定
将CTLL-2依赖细胞洗涤2次后稀释至4×109/L，接种于96孔培养板中，每孔0.1ml(含4×108/L)，然后加入不同稀释浓度rIL-2的培养基0.1mL及待测上清0.1mL,置37℃，5%CO2孵箱中培养48h。培养结束同上处理测A值。以细胞最高存活孔A值为100%，计算各稀释浓度及待测样品稀释浓度的细胞存活率，并以各稀释度对数值为横坐标，以细胞存活率为纵坐标，做每个样品及标准品的剂量反应曲线，通过曲线回归，计算50%细胞存活率对应的稀释度，以其倒数表示本次试验条件下的实验单位(LU)，再按下式计算每个测定样品的参考单位(RU)。
参考单位(RU)＝(样品的LU)/(标准品的LU)×标准品RU(IU/ml)
2.7 PSP对小鼠外周血白细胞的影响
, 百拇医药
取昆明种小鼠，一次性皮下注射CTX 80mg*kg-1。第3d尾静脉取血检查随机分组，灌胃给药10d后取血查外周血白细胞。
3 结果
3.1 体外PSP在0.3～1.5g*L-1时对B37和K562白血病细胞的最大抑制率分别为68.0%和46.0%(见图1)，对两细胞的IC50分别为1.48和1.56g*L-1，显示PSP体外直接抑制细胞作用较弱。
图1.PSP体外对B37和K562细胞的抑制作用
3.2 PSP在75～300mg*kg-1的剂量范围对小鼠S180肉瘤，EAC小鼠腹水瘤和H22小鼠肝癌均有一定的抑制作用，其中对S180肉瘤抑制作用较强，实验结果平均在33.8%～55.2%之间，对H22的抑瘤率为31.0%～47.1%，对EAC腹水瘤的抑制率为22.8%～56.9%。同时对荷瘤小鼠具有明显增加脾指数和胸腺指数的作用，不伴有降低体重或其他毒副作用，见表1。
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表1 PSP对S180，HepA和EAC小鼠肿瘤抑制作用结果(%，
±s) 组别
S180
HepA
EAC
抑瘤率
脾指数
胸腺指数
抑瘤率
脾指数
胸腺指数
抑瘤率
, 百拇医药
脾指数
对照组
大剂量
中剂量
小剂量
FT207
PJV
55.2
44.6
33.8
56.5
35.2
0.61±0.13
, 百拇医药
0.88±0.14
0.95±0.15
0.75±0.16
0.65±0.16
1.10±0.03
0.40±0.14
0.72±0.12
0.56±0.10
0.48±0.07
0.37±0.04
0.81±0.03
47.1
, 百拇医药
36.4
31.0
63.1
41.2
0.66±0.15
1.06±0.16
1.12±0.09
0.80±0.05
0.63±0.13
1.15±0.09
0.38±0.12
0.57±0.08
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0.52±0.11
0.45±0.03
0.31±0.07
0.78±0.03
56.9
44.7
22.8
39.0
47.2
0.56±0.13
0.89±0.06
0.80±0.01
, 百拇医药
0.67±0.07
0.48±0.12
0.94±0.14
P<0.05 vs对照组
3.3 PSP具有明显促进荷瘤Balb/c小鼠脾淋巴细胞转化作用(见图2)并有较好的剂量-效应关系。
3.4 PSP能促进荷瘤小鼠脾NK细胞对靶细胞的细胞毒作用(图3)，S180荷瘤对照组小鼠脾NK细胞活性明显低于正常对照组。
图2 PSP对荷瘤小鼠淋巴细胞转化率的影响(%)
, 百拇医药
图3 PSP对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
3.5 PSP对小鼠脾淋巴细胞TNF-α活性的诱导作用，TNF-α活性与L929敏感细胞的生存关系见图4，得到各对应组脾淋巴细胞TNF-α的浓度，并由TNF-α单克隆抗体中和实验得到证实，见表2。
图4 TNF-α活性与L929细胞存活率之间的关系
表2 各组小鼠脾淋巴细胞培养上清TNF-α测定结果 组别
TNF-α(IU/ml)
TNF-α单抗中和前
TNF-α单抗中和后
, 百拇医药
对照
S180对照
大剂量
中剂量
小剂量
PJV
34
24
75
63
42
54
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0
0
20
22
0
18
P<0.05 vs S180对照组，P<0.05 vs正常对照组
3.6 PSP治疗后各剂量组脾细胞rIL-2水平见图4，计算方法参考图5。
图5 PSP对荷瘤小鼠IL-2水平的影响
, 百拇医药
图6 IL-2与细胞存活率之间的关系及IL-2计算方法
3.7 PSP具有明显升高小鼠外周血白细胞的功能，同时不同程度的增加脾指数和体重作用，见表3。
表3 PSP对各组小鼠外周血白细胞的提升作用 组别
体重(g)
脾指数(%)
胸腺指数(%)
WBC(×109/L)
正常对照
对照
大剂量
, 百拇医药
中剂量
小剂量
P.J.V.
23.45±1.07
18.26±1.14*
22.38±1.46
21.00±1.11*
20.15±1.63*
19.20±1.82*
0.72±0.30
0.49±0.16*
, 百拇医药
0.80±0.18
0.71±0.24
0.65±0.15
1.04±0.10
0.43±0.09
0.22±0.16*
0.45±0.18
0.48±0.14
0.40±0.20
0.42±0.26
10.74±0.85
, 百拇医药
7.31±0.92*
9.83±1.60
9.87±1.21
8.74±1.12*
7.88±0.87*
*P<0.05 vs 正常对照组
3 讨论
对螺旋藻多糖的研究已有报道，以往的研究多集中于螺旋藻抗衰老，提高免疫功能等保健方面，少有直接观察其抗癌作用及机理的研究。本实验中，以PSP 75mg时即有较明显的抑瘤作用，并有剂量效应关系。这种抗癌作用的特点是不伴有明显的毒副作用，还能治疗或预防CTX对外周血白细胞的毒性作用。有报道PSP有治疗放射线对正常细胞的毒性作用[5、6]，显然，这种独特的双重作用有利于肿瘤病人的综合治疗和康复。PSP体外对肿瘤细胞的直接抑制作用较弱，虽然刘力生也观察到其对肿瘤细胞DNA，RNA和蛋白质有一定的抑制作用，但是报道结果差异较大，还需进一步证实，结合本实验观察到的现象，说明PSP对肿瘤细胞的直接杀伤或抑制并不起主要作用。
, 百拇医药
目前认为，肿瘤所引起的免疫反应的增强和减弱的变化过程，虽然在一定条件下，肿瘤越大对机体免疫系统的刺激越强，但是，荷瘤小鼠脾活性的淋巴细胞增殖能力却显著下降，也可以认为是肿瘤抑制了机体的免疫力。本实验荷瘤小鼠对照组动物免疫活性显著下降也说明这个问题，因而提高机体免疫学水平是抗癌作用的主要机理之一。在证实PSP具有良好抗癌效果的基础上，探讨了PSP增强荷瘤动物免疫活性的作用机理。首先观察了PSP对两个主要免疫学器官脾脏和胸腺的增重作用，并显示呈剂量依赖性关系，说明确与抑瘤作用有关。经体外对脾细胞以CoA刺激后转化率升高，这是提高机体特异与非特异免疫学作用的基础。
越来越多的证据表明：NK细胞在机体肿瘤非特异免疫中具有重要作用，有直接细胞毒作用和分泌淋巴因子功能[7、8]。本实验荷瘤小鼠体内NK细胞活性显著降低，而经PSP治疗组均不同程度地提高NK细胞活性，并与瘤重的大小一致。白细胞介素-2也是参入提高机体免疫应答的核心物质，尤其增加对细胞毒T淋巴细胞，NK细胞和LAK细胞等使其杀伤活性增加，进而清除体内癌细胞。PSP增强rIL-2活性的还可能增进抗体和干扰素的分泌，T细胞受到激活也能提高TNF-α的水平。PSP促进荷瘤小鼠分泌TNF，无疑是提高抗肿瘤活性的基础，其功能除具有直接杀伤肿瘤细胞外，也能增强NK细胞活性，刺激T淋巴细胞诱导γ-干扰素和淋巴因子的分泌，调节MHCⅡ型抗原的表达等功能，所以，TNF与其他淋巴因子，可溶性免疫分子之间互相诱生，共同参与肿瘤免疫调节作用[9～11]。本实验提示PSP主要是通过增强和恢复机体的免疫网络功能来达到杀灭肿瘤细胞的。肿瘤的放射治疗和化学治疗都存在着抑制机体免疫功能等严重的毒副作用，PSP在具有良好抑瘤效果的同时，还具有较强地逆转或弥补这些药物的不足之功能，适合于联合用药，所以，PSP在免疫化疗中有相当好的应用前景。
, 百拇医药
参考文献
[1]徐叔云.药理实验方法学，人民卫生出版社，1991，11：1208
[2]王红蓓.硫酸软骨素A对正常人及慢性乙肝患者NK，ADCC活性影响的体外实验.中国免疫学杂志，1993，9(6)：361
[3]杨益大.肿瘤坏死因子的诱生及检测.中国实验临床免疫学杂志，1991，3(5)：1
[4]刘杰麟.枸杞多糖对S180荷瘤小鼠的免疫抑瘤作用.中国免疫学杂志，1996，12(2)：115
[5]张成武.钝顶螺旋藻多糖和藻蓝蛋白对小鼠急性放射病的防护作用.营养学报，1996，18(3)：327
[6]范平.螺旋藻多糖的抗辐射及抗化学突变作用.中国药业，1997，4：15
, 百拇医药
[7]徐伟.自然杀伤细胞的细胞毒信号的激活通路与抑制通路.国外医学，免疫学分册，1998，21(4)：201
[8]Hercencl T ,Characteristics and use of natural killer cells.Immunology Today,1998,9(10):291.
[9]石文芳.TNF-α的细胞毒效应及其信号传导.国外医学，免疫学分册，1998，21(1)：20
[10]陈淳媛，肿瘤坏死因子系统的免疫网络机制极其在风湿热中的应用。国外医学，免疫学分册，1998，21(5)：255
[11]邓安梅.TH细胞分化研究进展，国外医学，免疫学分册，1998，21(3)：161
(收稿日期：2000-03-10), 百拇医药
单位：曲显俊 崔淑香 解砚英 侯金玲 周玲 董强(山东省医学科学院药物研究所，济南 250062)
关键词：螺旋藻多糖，抗癌作用，免疫作用
中国海洋药物000403
摘要 本实验对螺旋藻多糖的抗癌作用进行了体内外实验研究和作用机理探讨。以0.3～1.5g.L-1对B37乳腺癌细胞的抑制率最高可达68.0%，对K562白血病细胞抑制率为46.0%，对两细胞的IC50分别为1.48和1.56g.L-1。当螺旋藻多糖以300，150和75mg.kg-1灌胃给药时，对小鼠S180肉瘤的抑瘤率分别为55.2%，44.6%和33.8%；对H22小鼠肝癌的抑瘤率分别为47.1%，36.4%和31.0%；对EAC小鼠腹水癌的抑瘤率分别为56.9%，44.7%和22.8%，同时具有明显提高荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的作用。以MTT法检测螺旋藻多糖的荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化和对NK细胞活性的影响，也显示具有提高淋巴细胞转化率和促进NK细胞杀伤靶细胞的作用。测定螺旋藻多糖对脾淋巴细胞TNF-α诱生作用，大剂量组上清液可达75×10-3IU.L-1(对照组34×10-3IU.L-1)，并有较好的剂量-效应关系。PSP治疗后的荷瘤小鼠其脾淋巴细胞产生白细胞介素-2(rIL-2)的功能增强。另外，口服螺旋藻多糖还具有一定提升或恢复因使用环磷酰胺所致动物外周血白细胞降低的作用。
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螺旋藻多糖具有广泛的生物学活性。以往研究多集中于抗衰老，提高免疫作用等方面。近年来其在抗肿瘤方面的作用又引起了人们的重视。由于它是天然化合物，且具有无毒，高效的特点，明显不同于常用细胞毒类抗癌药，因此，有必要系统地研究其抗癌疗效和作用机理。本文以钝顶螺旋藻提取多糖并对该多糖在体内外的抗癌活性和作用机理进行了研究。
ANTITUMOR STUDIES ON THE POLYSACCHRIDES SPIRULINA PLATENSIS
Q
Xianjun，Cui Shuxiang，Xie Yanying，Hou Jinling，Zhou ling，Dong Qiang(Dept.Pharmacology,Institute of Medica Materia,Shandong Academy of Medical Science,Jinan 250062)
, 百拇医药
ABSTRACT The antitumor effects of polysacchrides Spirulina Platensis (PSP) were studied in vivo and vitro.In vitro tests,the highest inhibited rates on B37 mamma carcinoma cells and K562 leukemic cells were 68.0% and 46.0% respectively when the concentration was 0.3～1.5g.L-1.In vivo tests,when the dosage were 300,150,and 75mg.kg-1 p.o,the inhibited rates were 55.2%,44.6% and 33.8%;47.1%,36.4% and 31.0% and 56.9%,44.7% and 22.8% respectively on the transplanted tumor cells of Sarcinoma 180,H22 Hepatic tumor and EAC tumor cells in mice.PSP is biological activated substance which has widely immune effect.It had the effects of increasing the weight of spleen and thymus and of increasing proliferation of activated NK cell activity and TNF-α levels from 34×10-3 to 75×10-3IU.L-1 and of having function of activated splenocyte to produce interleukin-2(rIL-2) in tumor-bearing mice.It is suggested that PSP has the ability to inhibit tumor and mechanism is partly to enhance immunity in tumor-bearing imce.In addition,enhancing or recovering the number of WBC which reduced by CTX is also important function in treatment of tumor.
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KEY WORDS Polysacchrides Spirulina Platensis(PSP),Antitumor effect,Immune effect
1 材料
1.1 螺旋藻(Spirulina platensis)多糖(PSP) 作者自己提取，白色粉末状结晶，纯度86.9%，将另文发表。
1.2 动物 Balb/c小鼠，体重19-22g，昆明种小鼠，体重19～22g，山东医科大学实验动物中心提供。
1.3 化学药品和试剂 rIL-2,每瓶2×106IU，上海华新生物高新技术公司产品，批号970305；TNF-α和TNF-α单克隆抗体，由中国军事医学科学院邦定生物公司提供；放线菌素D(Actinomycin D),每支5mg，Fluka产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)和CoA,Sigma 公司产品；济南假单胞菌苗(Pseudomonas Jinanese Vaccine 简称PJV)，5-呋喃氟脲嘧啶(简称FT-207)，齐鲁制药厂产品；96孔培养板，NUNCLON公司产品。
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1.4 肿瘤细胞株 S180小鼠肉瘤；HepA小鼠肝癌，EAC小鼠腹水瘤，B37乳腺癌细胞，K562白血病细胞，L929TNF敏感细胞，CTLL-2 rIL-2依赖细胞均由本室保存。
1.5 仪器 DG 3022A型酶联免疫检测仪，南京华东电子管厂出品；Forma 311 型CO2孵箱，Forma公司产品；GB 303型电子分析天平，METTLER公司产品。
2 方法
2.1 PSP体外对B37和K562细胞的生长抑制作用观察
分别取对数生长期细胞，胰酶消化后以含10%FCS的RPMI 1640培养液稀释细胞，按每孔10000加入96孔培养板中，每孔0.2mL,4h后加入不同稀释度的PSP，并以阿霉素(0.3mg.L-1)作阳性对照，每个浓度设3个复孔，置37℃ 5%CO2孵箱中连续培养72h,培养结束前4h各孔加入MTT 10μL(5g.L1)。经离心，洗涤加入DMSO充分震荡混匀后于酶标仪570nm处测A值。
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2.2 PSP对小鼠移植性肿瘤的抑制作用
无菌取传代后5d的瘤细胞悬液，经生理盐水稀释计数后调整细胞至2×1010～6×1010/L，接种于小鼠右侧腋下部位，每只0.2mL。次日随机分组，每组10只，对照组动物数为试验组鼠数×组数，分别为PSP大剂量组(300mg.kg-1)中剂量组(150mg*kg-1)，小剂量组(75mg*kg-1)，FT207对照组(120mg*kg-1)灌胃给药，每只0.8mL，每日1次，连续10d，同时设立PJV对照组(20mg*kg-1,隔日皮下注射)。第11d处死小鼠取瘤块称重，计算抑瘤率，脾指数和胸腺指数。
2.3 PSP促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化实验[1，2]
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取Balb/c小鼠按上述方法接种S180瘤细胞并分组给药10d。无菌取脾制成单细胞悬液，经NH3 CI-Tris溶解、Hank′s液洗涤红细胞后以含10% FCS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度1×1010/L，加入96孔板中，每孔0.1mL,设加CoA (0.1mL,10mg*L-1)孔和不加CoA(加0.1mL培养基)对照孔，置5%CO2 37℃孵箱中培养72h，同2.1测A值，以各组加CoA孔OD值与不加CoA对照孔A值比较，计算淋巴细胞转化率。
2.4 NK细胞活性测定[1，2]
同2.3处理动物和制备脾细胞。取经CoA激活72h的脾细胞作效应细胞，洗去CoA后，调整细胞浓度至1×1010/L，每孔0.1mL, 入培养板中，即每孔1×106，另取K562细胞作为靶细胞，每孔加入2×108/L，效应细胞，靶细胞＝50：1与上述不同药物处理的脾细胞作混合培养10h。同2.1测A值，以各组混合培养孔A值减去该组效应细胞培养孔A值，并与靶细胞孔A值之比得杀伤率(%)。
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2.5 PSP对荷瘤小鼠TNF-α的诱生作用测定[3、4]
2.5.1 TNF-α的诱生
动物分组及治疗方法同2.4制备培养脾细胞上清液。
2.5.2 制备TNF-α标准曲线及各组上清液测定
以96孔培养板加入不同浓度的TNF-α标准品50μL(终浓度分别为20×10-3，40×10-3，60×10-3和80×10-3IU*L-1)，制定标准曲线。在另一区域，加入不同浓度的各组脾细胞诱导上清液50μL，共同加入终浓度为1mg*L的Act-D 50μL，最后加入L929细胞50μL,置37℃，5%CO2孵箱中孵育20h。
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2.5.3 TNF-α中和试验
按(2.5.3)方法在96孔板中加入不同稀释浓度的TNF-α单克隆抗体50μL(终浓度1mg*L-1)，混匀置37℃ 5%CO2孵箱中。45min后再依次加入Act-D和细胞，同上培养20h。同2.1测A值。
2.6 PSP对荷瘤小鼠脾淋巴细胞rIL-2水平的影响[3、4]
2.6.1 rIL-2诱生
动物处理方法同2.3制备脾细胞悬液，培养基稀释至5×109/L，加入24孔板中，每孔1mL，再加入含CoA的培养液1mL(5mg*L-1)，置37℃，5%CO2的孵箱中培养24h，取上清液离心后-20℃备用。
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2.6.2 标准rIL-2活性的标定及各组诱导上清液的测定
将CTLL-2依赖细胞洗涤2次后稀释至4×109/L，接种于96孔培养板中，每孔0.1ml(含4×108/L)，然后加入不同稀释浓度rIL-2的培养基0.1mL及待测上清0.1mL,置37℃，5%CO2孵箱中培养48h。培养结束同上处理测A值。以细胞最高存活孔A值为100%，计算各稀释浓度及待测样品稀释浓度的细胞存活率，并以各稀释度对数值为横坐标，以细胞存活率为纵坐标，做每个样品及标准品的剂量反应曲线，通过曲线回归，计算50%细胞存活率对应的稀释度，以其倒数表示本次试验条件下的实验单位(LU)，再按下式计算每个测定样品的参考单位(RU)。
参考单位(RU)＝(样品的LU)/(标准品的LU)×标准品RU(IU/ml)
2.7 PSP对小鼠外周血白细胞的影响
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取昆明种小鼠，一次性皮下注射CTX 80mg*kg-1。第3d尾静脉取血检查随机分组，灌胃给药10d后取血查外周血白细胞。
3 结果
3.1 体外PSP在0.3～1.5g*L-1时对B37和K562白血病细胞的最大抑制率分别为68.0%和46.0%(见图1)，对两细胞的IC50分别为1.48和1.56g*L-1，显示PSP体外直接抑制细胞作用较弱。
图1.PSP体外对B37和K562细胞的抑制作用
3.2 PSP在75～300mg*kg-1的剂量范围对小鼠S180肉瘤，EAC小鼠腹水瘤和H22小鼠肝癌均有一定的抑制作用，其中对S180肉瘤抑制作用较强，实验结果平均在33.8%～55.2%之间，对H22的抑瘤率为31.0%～47.1%，对EAC腹水瘤的抑制率为22.8%～56.9%。同时对荷瘤小鼠具有明显增加脾指数和胸腺指数的作用，不伴有降低体重或其他毒副作用，见表1。
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表1 PSP对S180，HepA和EAC小鼠肿瘤抑制作用结果(%，
±s) 组别S180
HepA
EAC
抑瘤率
脾指数
胸腺指数
抑瘤率
脾指数
胸腺指数
抑瘤率
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脾指数
对照组
大剂量
中剂量
小剂量
FT207
PJV
55.2
44.6
33.8
56.5
35.2
0.61±0.13
, 百拇医药
0.88±0.14
0.95±0.15
0.75±0.16
0.65±0.16
1.10±0.03
0.40±0.14
0.72±0.12
0.56±0.10
0.48±0.07
0.37±0.04
0.81±0.03
47.1
, 百拇医药
36.4
31.0
63.1
41.2
0.66±0.15
1.06±0.16
1.12±0.09
0.80±0.05
0.63±0.13
1.15±0.09
0.38±0.12
0.57±0.08
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0.52±0.11
0.45±0.03
0.31±0.07
0.78±0.03
56.9
44.7
22.8
39.0
47.2
0.56±0.13
0.89±0.06
0.80±0.01
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0.67±0.07
0.48±0.12
0.94±0.14
P<0.05 vs对照组
3.3 PSP具有明显促进荷瘤Balb/c小鼠脾淋巴细胞转化作用(见图2)并有较好的剂量-效应关系。
3.4 PSP能促进荷瘤小鼠脾NK细胞对靶细胞的细胞毒作用(图3)，S180荷瘤对照组小鼠脾NK细胞活性明显低于正常对照组。
图2 PSP对荷瘤小鼠淋巴细胞转化率的影响(%)
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图3 PSP对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
3.5 PSP对小鼠脾淋巴细胞TNF-α活性的诱导作用，TNF-α活性与L929敏感细胞的生存关系见图4，得到各对应组脾淋巴细胞TNF-α的浓度，并由TNF-α单克隆抗体中和实验得到证实，见表2。
图4 TNF-α活性与L929细胞存活率之间的关系
表2 各组小鼠脾淋巴细胞培养上清TNF-α测定结果 组别
TNF-α(IU/ml)
TNF-α单抗中和前
TNF-α单抗中和后
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对照
S180对照
大剂量
中剂量
小剂量
PJV
34
24
75
63
42
54
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0
0
20
22
0
18
P<0.05 vs S180对照组，P<0.05 vs正常对照组
3.6 PSP治疗后各剂量组脾细胞rIL-2水平见图4，计算方法参考图5。
图5 PSP对荷瘤小鼠IL-2水平的影响
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图6 IL-2与细胞存活率之间的关系及IL-2计算方法
3.7 PSP具有明显升高小鼠外周血白细胞的功能，同时不同程度的增加脾指数和体重作用，见表3。
表3 PSP对各组小鼠外周血白细胞的提升作用 组别
体重(g)
脾指数(%)
胸腺指数(%)
WBC(×109/L)
正常对照
对照
大剂量
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中剂量
小剂量
P.J.V.
23.45±1.07
18.26±1.14*
22.38±1.46
21.00±1.11*
20.15±1.63*
19.20±1.82*
0.72±0.30
0.49±0.16*
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0.80±0.18
0.71±0.24
0.65±0.15
1.04±0.10
0.43±0.09
0.22±0.16*
0.45±0.18
0.48±0.14
0.40±0.20
0.42±0.26
10.74±0.85
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7.31±0.92*
9.83±1.60
9.87±1.21
8.74±1.12*
7.88±0.87*
*P<0.05 vs 正常对照组
3 讨论
对螺旋藻多糖的研究已有报道，以往的研究多集中于螺旋藻抗衰老，提高免疫功能等保健方面，少有直接观察其抗癌作用及机理的研究。本实验中，以PSP 75mg时即有较明显的抑瘤作用，并有剂量效应关系。这种抗癌作用的特点是不伴有明显的毒副作用，还能治疗或预防CTX对外周血白细胞的毒性作用。有报道PSP有治疗放射线对正常细胞的毒性作用[5、6]，显然，这种独特的双重作用有利于肿瘤病人的综合治疗和康复。PSP体外对肿瘤细胞的直接抑制作用较弱，虽然刘力生也观察到其对肿瘤细胞DNA，RNA和蛋白质有一定的抑制作用，但是报道结果差异较大，还需进一步证实，结合本实验观察到的现象，说明PSP对肿瘤细胞的直接杀伤或抑制并不起主要作用。
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目前认为，肿瘤所引起的免疫反应的增强和减弱的变化过程，虽然在一定条件下，肿瘤越大对机体免疫系统的刺激越强，但是，荷瘤小鼠脾活性的淋巴细胞增殖能力却显著下降，也可以认为是肿瘤抑制了机体的免疫力。本实验荷瘤小鼠对照组动物免疫活性显著下降也说明这个问题，因而提高机体免疫学水平是抗癌作用的主要机理之一。在证实PSP具有良好抗癌效果的基础上，探讨了PSP增强荷瘤动物免疫活性的作用机理。首先观察了PSP对两个主要免疫学器官脾脏和胸腺的增重作用，并显示呈剂量依赖性关系，说明确与抑瘤作用有关。经体外对脾细胞以CoA刺激后转化率升高，这是提高机体特异与非特异免疫学作用的基础。
越来越多的证据表明：NK细胞在机体肿瘤非特异免疫中具有重要作用，有直接细胞毒作用和分泌淋巴因子功能[7、8]。本实验荷瘤小鼠体内NK细胞活性显著降低，而经PSP治疗组均不同程度地提高NK细胞活性，并与瘤重的大小一致。白细胞介素-2也是参入提高机体免疫应答的核心物质，尤其增加对细胞毒T淋巴细胞，NK细胞和LAK细胞等使其杀伤活性增加，进而清除体内癌细胞。PSP增强rIL-2活性的还可能增进抗体和干扰素的分泌，T细胞受到激活也能提高TNF-α的水平。PSP促进荷瘤小鼠分泌TNF，无疑是提高抗肿瘤活性的基础，其功能除具有直接杀伤肿瘤细胞外，也能增强NK细胞活性，刺激T淋巴细胞诱导γ-干扰素和淋巴因子的分泌，调节MHCⅡ型抗原的表达等功能，所以，TNF与其他淋巴因子，可溶性免疫分子之间互相诱生，共同参与肿瘤免疫调节作用[9～11]。本实验提示PSP主要是通过增强和恢复机体的免疫网络功能来达到杀灭肿瘤细胞的。肿瘤的放射治疗和化学治疗都存在着抑制机体免疫功能等严重的毒副作用，PSP在具有良好抑瘤效果的同时，还具有较强地逆转或弥补这些药物的不足之功能，适合于联合用药，所以，PSP在免疫化疗中有相当好的应用前景。
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参考文献
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(收稿日期：2000-03-10), 百拇医药