供体特异性输注对异基因小鼠皮肤移植的影响
作者：王建文 王宗惠 高居忠 管德林 许建军 夏成青
单位：王建文 高居忠 管德林 许建军(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院泌尿外科)；王宗惠(北京市职业病防治所)；夏成青(北京红十字朝阳医院病理科)
关键词：移植；骨髓；抗体
首都医科大学学报000403 提要：为研究抗CD3单抗和供鼠骨髓细胞输注对小鼠皮肤移植存活的影响，在抗CD3单抗作用下，从供鼠C57BL/6中分离提取骨髓细胞液，移植术后注入受鼠BALB/C中，观察对异基因皮肤移植存活的影响。结果：骨髓组移植皮肤平均存活时间(MST)为15.6 d，抗CD3单抗组为10.1 d，正常对照组为7.7 d。结果提示，在免疫抑制下供鼠骨髓输注可促进移植物的存活。
中图分类号：R622+.1
, http://www.100md.com
Effect of Anti-CD3 Antibody and Donor Strain Bone Marrow on Mouse Skin Graft Survival
Wang Jianwen,Wang Zonghui,Gao Juzhong,Guan Delin,Xu Jianjun,Xia Chengqing
(Department of Urology,Beijing Red Cross Chaoyang Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract:The research is to study the influence on mouse skin graft survival with anti-CD3 antibody and donor bone marrow infusion.Under the effect of the immunosuppression of anti-CD3 antibody,bone marrow cell suspensions were extracted from donor strain C57BL/6 and injected into recipient BALB/C after skin allograft.The MST is 15.6 d for the bone marrow group,10.1 d for the anti-CD3 group and 7.7 d in the contrast group respectively.The donor specific bone marrow infusion could improve the skin graft survival under the immunosuppression.
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Key words:allograft;bone marrow;antibody
当前在器官移植领域中供体特异性输注已日益引起重视，特别是对供体特异性骨髓输注的研究已取得较大进展，但存在问题也很多[1]。1998年7月至1999年1月，我们应用异基因小鼠皮肤移植模型，研究了在免疫抑制下供体骨髓细胞输注对移植物存活的影响。
1 材料和方法
1.1 动物及分组
近交系小鼠C57BL/6(H-2d)和BALB/C(H-2b)各26只，56 d左右，体质量18～20 g，均为雄性，分别为移植供体和受体。第3供体鼠为昆明小鼠。以上动物均由中国医学科学院动物中心提供。分组：①正常对照(A)组：单纯做皮肤移植。②抗CD3单抗(B)组：分别在移植术前、术后第2天腹腔注入抗CD3单抗10 μg/只。③骨髓(C)组：在抗CD3单抗作用下，在术后第8天从尾静脉输入供鼠的骨髓细胞。
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1.2 试剂
抗CD3单抗由北京医科大学免疫室制备，效价为1∶1 000。
1.3 实验方法
①皮肤移植：移植供鼠的尾部皮肤，方法按文献[2]进行。以皮片结痂、变硬或皮片上毛脱落作为排斥的标准，结果用皮片平均存活时间(MST)表示。②供鼠骨髓细胞悬液的制备和活力检测：将供鼠去颈椎处死，备皮消毒后，迅速放入洁净工作台中，剪断四肢骨，用含青-链双抗的1640液反复冲洗髓腔后，离心(3 000 r/min)3 min，弃去上清液，加入数滴0.83%氯化铵，5 min后再加入1640液，离心(1 000 r/min)5 min，弃上清，显微镜下计数板计数，并用台盼蓝染色，计算活细胞比例。
1.4 红细胞免疫功能测定
皮肤移植前及术后第8天，骨髓组在术后第14天，取鼠尾血0.2 mL肝素抗凝，用酵母菌花环法测红细胞补体C3bR(RBC-C3bR)和红细胞免疫复合物(RBC-IC)花环变化。
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1.5 单向混合淋巴细胞反应(MLR)的测定
各组小鼠分离脾细胞，A、B、C 3组分别在术后第7天、第10天、第14天，移植物未出现明显排斥反应前进行测定，用四氮唑蓝(MTT)法分别测定供鼠和第3供鼠的MLR反应。
1.6 移植皮片的病理检查
植皮小鼠分别在术后第8天、第14天取移植皮片和移植床，常规制片观察。
1.7 统计学处理
两样本均数比较用t检验，多样本均数比较用方差分析。
2 结果
抗CD3单抗注射对正常小鼠淋巴细胞的影响：抗CD3单抗注射前小鼠的淋巴细胞数为(10.07±0.97)×103，注射后第1天、第3天、第5天、第10天、第12天的淋巴细胞数分别为(3.45±1.26)×103、(8.68±0.78)×103、(5.38±0.99)×103、(6.68±1.24)×103、(8.28±2.10)×103。以注药后第1天、第5～10天的抑制作用强，与其他时间比较有显著性差异(P<0.05)，以后逐渐回升。
, 百拇医药
皮片存活时间比较：各组MST如表1所示。由表1可见，C组MST较A、B组明显延长(P<0.01)。
RBC免疫功能测定：3组的RBC-C3bR和RBC-IC结果均为术后第8天较术前有明显改变(P<0.05)，A组在术后第8天RBC免疫反应明显升高(P<0.05)，B、C组则明显减弱(P<0.05)，C组在术后第14天时逐渐升高(P<0.05)，详见表2。
表1 3组间皮片移植存活时间比较 组别
n
t(平均存活)/d
A
6
7.67±0.81
, 百拇医药
B
8
10.13±0.83
C
12
15.58±0.90
与A、B组比较P<0.01 对供鼠及第3供鼠的MLR反应(用转化指数SI表示)：对供鼠的MLR A组与B、C组间有显著性差异(P<0.05)。对第3供鼠的MLR C组与A、B组间有显著性差异(P<0.05)。对供鼠及昆明小鼠的MLR A、B组无明显差异(P>0.05)，C组则表现为对供鼠的MLR明显下降，对昆明小鼠的MLR呈正常反应，两者间有明显差异(P<0.05)，结果见表3。
表2 RBC免疫功能测定结果 组别
, 百拇医药
RBC-C3bR
RBC-IC
术前
术后第8天
术后第14天
术前
术后第8天
术后第14天
A
8.38±2.69
10.39±1.62
8.73±1.33
, 百拇医药 13.6±0.94
B
6.61±1.79
3.75±1.87
9.06±2.73
8.06±2.47
C
10.38±4.3
5.23±2.25
6.55±3.08
11.25±4.02
6.74±3.06
, 百拇医药
7.38±3.26
表3 对供鼠及第3供鼠MLR的结果 组别
对供鼠
对第3供鼠
A
1.45±0.57
1.47±0.61
B
0.80±0.27
0.96±0.11
C
0.31±0.33
, 百拇医药
1.97±0.15
移植皮片不同时间的病理改变见表4。3 讨论
抗CD3单抗是近年来在动物实验和临床中应用广泛的单克隆抗体，它通过调节和去除与T细胞TcR结合的CD3分子而使T细胞灭活。从它对正常BALB/C小鼠淋巴细胞影响变化看出，它在注药后的第1天、第5～10天抑制作用比较强，以后逐渐回升，因此本实验选择在其抑制作用较强的第7～8天输注供体骨髓。
Monaco等研究发现，供体骨髓是诱导耐受的最适抗原，效果明显强于淋巴细胞和脾细胞[3]。Gozzo等人用密度梯度离心法将骨髓分为4部分，其中第3部分Fr3为活性成分，它包含有大量的小淋巴细胞和多形核细胞，其诱导耐受的作用与全部骨髓相同。Starzl研究提出骨髓中富含造血干细胞、树突状细胞(DC)，特别是不成熟的DC，可促进耐受的形成[4]。抗CD3单抗的作用在于清除大部分T细胞，使机体处于免疫抑制状态，对移植抗原和第3供体抗原均不产生正常免疫应答(见表3 B组)。在术后第8天输入供体骨髓1×107 mL-1，能明显延长皮片移植的存活时间，病理显示延缓表皮细胞和附件的退行性变，减少炎症细胞浸润。混合淋巴细胞反应显示对供鼠的MLR明显降低，而对第3供鼠的MLR正常(见表3 C组)。表明骨髓来源的不成熟的树突状细胞，表达低水平的MHC分子和缺乏B7分子表达，可能阻断了宿主T细胞对移植抗原的直接识别，延缓了排斥反应的发生。本实验未能诱导出耐受的原因考虑为：①皮肤移植物内含有淋巴细胞和树突状细胞，而且为非血管性的移植物，它的特殊性决定了诱导耐受的难度要大于实质性器官。②抗CD3单抗灭活了大部分的T细胞，可能使耐受不易形成，最近有人用抗CD4单抗改变Th1/Th2比例诱导耐受说明了这一点[5]。③骨髓输入的时间、剂量和途径仍然非常重要，有报道从门静脉中输入效果要好于尾静脉[6]。
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表4 移植皮片不同时间的病理改变 组别
术后第8天病理改变
术后第14天病理改变
A
表皮坏死脱落，皮片与移植床分界清楚，大量炎性细胞浸润，血管内膜炎伴血栓形成，皮片缩小翘起
皮片完全干缩、结痂
B
表皮坏死脱落不明显，皮片与移植床分界不清，真皮内中等量炎性细胞浸润，可见新生血管形成及纤维组织增生
表皮坏死脱落，皮肤附属器消失，纤维组织增生，血栓形成多量炎性细胞浸润
, 百拇医药 C
表皮坏死脱落不明显，少量炎性细胞浸润，血管内充血，皮片与移植床愈合良好
表皮细胞角化，附件退行性变，炎性细胞浸润不明显，伴血管及纤维组织增生
近年来对RBC的免疫功能又有了新的认识，RBC和WBC免疫系统是平行的，与补体及抗原、抗体调控关系复杂。在排斥反应中移植抗原入血循环后，先被RBC识别浓缩，引起免疫反应，其免疫反应强弱与供体器官免疫原性强弱呈正相关，RBC的C3bR还提供Ag给B细胞，增强体液免疫功能。本实验中A组皮片移植后第8天，RBC免疫反应增强，机体出现排斥反应。而同样时间B、C组结果低，C组在术后第14天RBC免疫反应再次升高，预示了排斥反应的发生。其变化与排斥反应的发生基本相符，陈凡提出RBC免疫状态改变，能间接反应机体细胞免疫状态[7]。本研究认为RBC免疫功能变化测定是1个简单、快速预测排斥的指标，可望用于临床。
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总之，在免疫抑制状态下输注供体骨髓有助于延长移植物的存活，但由于骨髓的分离、冷冻、复苏比较困难，其活性成分也不是很明确的，在此方面还需进一步的研究。
卫生部基金资助项目
参考文献
1，Daniel C,Brennan,Thalachallour M,et al.Donor-specific transfusion and donor bone marrow infusion in renal transplantation tolerance: A review of efficacy and mechanisms.Am J Kidney Dis,1995,26:701～715
2，王一冲.小鼠皮片移植不同方法的比较.上海免疫学杂志,1982,2:32～34
, http://www.100md.com
3，Monaco A P,Wood M.The use of donor-specific antigen for the induction of immunologic unresponsiveness to experimental and clinical allografts.Trans Proc,1988,20(1): 122～130
4，Starzl T E,Demetris A J,Murase N K,et al.The lost chord: Microchimerism and allograft survival.Immunol Today,1996,17:577～584
5，Bushell A,Morris P J,Wood K J,et al.Induction of operational tolerance by random blood transfusion combined with anti-CD4 antibody therapy.A protocol with significant clinical potential.Transplantation,1994,58:133～139
6，叶建平,谢蜀生.成年小鼠移植耐受的实验研究.中华器官移植杂志,1992,1:21～22
7，陈凡,宋惠民.致敏大鼠心脏移植后红细胞免疫功能变化.铁道医学,1997,1:8～9
收稿日期：1999-12-23, 百拇医药
单位：王建文 高居忠 管德林 许建军(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院泌尿外科)；王宗惠(北京市职业病防治所)；夏成青(北京红十字朝阳医院病理科)
关键词：移植；骨髓；抗体
首都医科大学学报000403 提要：为研究抗CD3单抗和供鼠骨髓细胞输注对小鼠皮肤移植存活的影响，在抗CD3单抗作用下，从供鼠C57BL/6中分离提取骨髓细胞液，移植术后注入受鼠BALB/C中，观察对异基因皮肤移植存活的影响。结果：骨髓组移植皮肤平均存活时间(MST)为15.6 d，抗CD3单抗组为10.1 d，正常对照组为7.7 d。结果提示，在免疫抑制下供鼠骨髓输注可促进移植物的存活。
中图分类号：R622+.1
, http://www.100md.com
Effect of Anti-CD3 Antibody and Donor Strain Bone Marrow on Mouse Skin Graft Survival
Wang Jianwen,Wang Zonghui,Gao Juzhong,Guan Delin,Xu Jianjun,Xia Chengqing
(Department of Urology,Beijing Red Cross Chaoyang Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract:The research is to study the influence on mouse skin graft survival with anti-CD3 antibody and donor bone marrow infusion.Under the effect of the immunosuppression of anti-CD3 antibody,bone marrow cell suspensions were extracted from donor strain C57BL/6 and injected into recipient BALB/C after skin allograft.The MST is 15.6 d for the bone marrow group,10.1 d for the anti-CD3 group and 7.7 d in the contrast group respectively.The donor specific bone marrow infusion could improve the skin graft survival under the immunosuppression.
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Key words:allograft;bone marrow;antibody
当前在器官移植领域中供体特异性输注已日益引起重视，特别是对供体特异性骨髓输注的研究已取得较大进展，但存在问题也很多[1]。1998年7月至1999年1月，我们应用异基因小鼠皮肤移植模型，研究了在免疫抑制下供体骨髓细胞输注对移植物存活的影响。
1 材料和方法
1.1 动物及分组
近交系小鼠C57BL/6(H-2d)和BALB/C(H-2b)各26只，56 d左右，体质量18～20 g，均为雄性，分别为移植供体和受体。第3供体鼠为昆明小鼠。以上动物均由中国医学科学院动物中心提供。分组：①正常对照(A)组：单纯做皮肤移植。②抗CD3单抗(B)组：分别在移植术前、术后第2天腹腔注入抗CD3单抗10 μg/只。③骨髓(C)组：在抗CD3单抗作用下，在术后第8天从尾静脉输入供鼠的骨髓细胞。
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1.2 试剂
抗CD3单抗由北京医科大学免疫室制备，效价为1∶1 000。
1.3 实验方法
①皮肤移植：移植供鼠的尾部皮肤，方法按文献[2]进行。以皮片结痂、变硬或皮片上毛脱落作为排斥的标准，结果用皮片平均存活时间(MST)表示。②供鼠骨髓细胞悬液的制备和活力检测：将供鼠去颈椎处死，备皮消毒后，迅速放入洁净工作台中，剪断四肢骨，用含青-链双抗的1640液反复冲洗髓腔后，离心(3 000 r/min)3 min，弃去上清液，加入数滴0.83%氯化铵，5 min后再加入1640液，离心(1 000 r/min)5 min，弃上清，显微镜下计数板计数，并用台盼蓝染色，计算活细胞比例。
1.4 红细胞免疫功能测定
皮肤移植前及术后第8天，骨髓组在术后第14天，取鼠尾血0.2 mL肝素抗凝，用酵母菌花环法测红细胞补体C3bR(RBC-C3bR)和红细胞免疫复合物(RBC-IC)花环变化。
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1.5 单向混合淋巴细胞反应(MLR)的测定
各组小鼠分离脾细胞，A、B、C 3组分别在术后第7天、第10天、第14天，移植物未出现明显排斥反应前进行测定，用四氮唑蓝(MTT)法分别测定供鼠和第3供鼠的MLR反应。
1.6 移植皮片的病理检查
植皮小鼠分别在术后第8天、第14天取移植皮片和移植床，常规制片观察。
1.7 统计学处理
两样本均数比较用t检验，多样本均数比较用方差分析。
2 结果
抗CD3单抗注射对正常小鼠淋巴细胞的影响：抗CD3单抗注射前小鼠的淋巴细胞数为(10.07±0.97)×103，注射后第1天、第3天、第5天、第10天、第12天的淋巴细胞数分别为(3.45±1.26)×103、(8.68±0.78)×103、(5.38±0.99)×103、(6.68±1.24)×103、(8.28±2.10)×103。以注药后第1天、第5～10天的抑制作用强，与其他时间比较有显著性差异(P<0.05)，以后逐渐回升。
, 百拇医药
皮片存活时间比较：各组MST如表1所示。由表1可见，C组MST较A、B组明显延长(P<0.01)。
RBC免疫功能测定：3组的RBC-C3bR和RBC-IC结果均为术后第8天较术前有明显改变(P<0.05)，A组在术后第8天RBC免疫反应明显升高(P<0.05)，B、C组则明显减弱(P<0.05)，C组在术后第14天时逐渐升高(P<0.05)，详见表2。
表1 3组间皮片移植存活时间比较 组别
n
t(平均存活)/d
A
6
7.67±0.81
, 百拇医药
B
8
10.13±0.83
C
12
15.58±0.90
与A、B组比较P<0.01 对供鼠及第3供鼠的MLR反应(用转化指数SI表示)：对供鼠的MLR A组与B、C组间有显著性差异(P<0.05)。对第3供鼠的MLR C组与A、B组间有显著性差异(P<0.05)。对供鼠及昆明小鼠的MLR A、B组无明显差异(P>0.05)，C组则表现为对供鼠的MLR明显下降，对昆明小鼠的MLR呈正常反应，两者间有明显差异(P<0.05)，结果见表3。
表2 RBC免疫功能测定结果 组别
, 百拇医药
RBC-C3bR
RBC-IC
术前
术后第8天
术后第14天
术前
术后第8天
术后第14天
A
8.38±2.69
10.39±1.62
8.73±1.33
, 百拇医药 13.6±0.94
B
6.61±1.79
3.75±1.87
9.06±2.73
8.06±2.47
C
10.38±4.3
5.23±2.25
6.55±3.08
11.25±4.02
6.74±3.06
, 百拇医药
7.38±3.26
表3 对供鼠及第3供鼠MLR的结果 组别
对供鼠
对第3供鼠
A
1.45±0.57
1.47±0.61
B
0.80±0.27
0.96±0.11
C
0.31±0.33
, 百拇医药
1.97±0.15
移植皮片不同时间的病理改变见表4。3 讨论
抗CD3单抗是近年来在动物实验和临床中应用广泛的单克隆抗体，它通过调节和去除与T细胞TcR结合的CD3分子而使T细胞灭活。从它对正常BALB/C小鼠淋巴细胞影响变化看出，它在注药后的第1天、第5～10天抑制作用比较强，以后逐渐回升，因此本实验选择在其抑制作用较强的第7～8天输注供体骨髓。
Monaco等研究发现，供体骨髓是诱导耐受的最适抗原，效果明显强于淋巴细胞和脾细胞[3]。Gozzo等人用密度梯度离心法将骨髓分为4部分，其中第3部分Fr3为活性成分，它包含有大量的小淋巴细胞和多形核细胞，其诱导耐受的作用与全部骨髓相同。Starzl研究提出骨髓中富含造血干细胞、树突状细胞(DC)，特别是不成熟的DC，可促进耐受的形成[4]。抗CD3单抗的作用在于清除大部分T细胞，使机体处于免疫抑制状态，对移植抗原和第3供体抗原均不产生正常免疫应答(见表3 B组)。在术后第8天输入供体骨髓1×107 mL-1，能明显延长皮片移植的存活时间，病理显示延缓表皮细胞和附件的退行性变，减少炎症细胞浸润。混合淋巴细胞反应显示对供鼠的MLR明显降低，而对第3供鼠的MLR正常(见表3 C组)。表明骨髓来源的不成熟的树突状细胞，表达低水平的MHC分子和缺乏B7分子表达，可能阻断了宿主T细胞对移植抗原的直接识别，延缓了排斥反应的发生。本实验未能诱导出耐受的原因考虑为：①皮肤移植物内含有淋巴细胞和树突状细胞，而且为非血管性的移植物，它的特殊性决定了诱导耐受的难度要大于实质性器官。②抗CD3单抗灭活了大部分的T细胞，可能使耐受不易形成，最近有人用抗CD4单抗改变Th1/Th2比例诱导耐受说明了这一点[5]。③骨髓输入的时间、剂量和途径仍然非常重要，有报道从门静脉中输入效果要好于尾静脉[6]。
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表4 移植皮片不同时间的病理改变 组别
术后第8天病理改变
术后第14天病理改变
A
表皮坏死脱落，皮片与移植床分界清楚，大量炎性细胞浸润，血管内膜炎伴血栓形成，皮片缩小翘起
皮片完全干缩、结痂
B
表皮坏死脱落不明显，皮片与移植床分界不清，真皮内中等量炎性细胞浸润，可见新生血管形成及纤维组织增生
表皮坏死脱落，皮肤附属器消失，纤维组织增生，血栓形成多量炎性细胞浸润
, 百拇医药 C
表皮坏死脱落不明显，少量炎性细胞浸润，血管内充血，皮片与移植床愈合良好
表皮细胞角化，附件退行性变，炎性细胞浸润不明显，伴血管及纤维组织增生
近年来对RBC的免疫功能又有了新的认识，RBC和WBC免疫系统是平行的，与补体及抗原、抗体调控关系复杂。在排斥反应中移植抗原入血循环后，先被RBC识别浓缩，引起免疫反应，其免疫反应强弱与供体器官免疫原性强弱呈正相关，RBC的C3bR还提供Ag给B细胞，增强体液免疫功能。本实验中A组皮片移植后第8天，RBC免疫反应增强，机体出现排斥反应。而同样时间B、C组结果低，C组在术后第14天RBC免疫反应再次升高，预示了排斥反应的发生。其变化与排斥反应的发生基本相符，陈凡提出RBC免疫状态改变，能间接反应机体细胞免疫状态[7]。本研究认为RBC免疫功能变化测定是1个简单、快速预测排斥的指标，可望用于临床。
, http://www.100md.com
总之，在免疫抑制状态下输注供体骨髓有助于延长移植物的存活，但由于骨髓的分离、冷冻、复苏比较困难，其活性成分也不是很明确的，在此方面还需进一步的研究。
卫生部基金资助项目
参考文献
1，Daniel C,Brennan,Thalachallour M,et al.Donor-specific transfusion and donor bone marrow infusion in renal transplantation tolerance: A review of efficacy and mechanisms.Am J Kidney Dis,1995,26:701～715
2，王一冲.小鼠皮片移植不同方法的比较.上海免疫学杂志,1982,2:32～34
, http://www.100md.com
3，Monaco A P,Wood M.The use of donor-specific antigen for the induction of immunologic unresponsiveness to experimental and clinical allografts.Trans Proc,1988,20(1): 122～130
4，Starzl T E,Demetris A J,Murase N K,et al.The lost chord: Microchimerism and allograft survival.Immunol Today,1996,17:577～584
5，Bushell A,Morris P J,Wood K J,et al.Induction of operational tolerance by random blood transfusion combined with anti-CD4 antibody therapy.A protocol with significant clinical potential.Transplantation,1994,58:133～139
6，叶建平,谢蜀生.成年小鼠移植耐受的实验研究.中华器官移植杂志,1992,1:21～22
7，陈凡,宋惠民.致敏大鼠心脏移植后红细胞免疫功能变化.铁道医学,1997,1:8～9
收稿日期：1999-12-23, 百拇医药