人酪氨酸羟化酶全长及催化核心序列的克隆与表达
作者：熊英 刘华 于培兰 张澄波 杨慧 徐群渊
单位：熊英 刘华 于培兰 张澄波(首都医科大学生化教研室)；杨慧 徐群渊(北京市神经科学研究所)
关键词：酪氨酸羟化酶；表达；催化核心；全长序列
首都医科大学学报000401 提要：设计合成含适当酶切位点的PCR引物，以人的全长THcDNA为模板，进行PCR扩增反应，得到人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)全长及催化核心序列，将其分别插入谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1,转化入大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达，SDS-PAGE、western blotting分析表达产物。结果获得了编码N-端缺失145个氨基酸的酪氨酸羟化酶催化结构域的cDNA片段及带一定内切酶识别位点的全长片段，表达载体构建正确。插入片段序列与人THmRNA相应序列完全一致。转入重组质粒的菌经诱导后，有相对分子质量约为8.3万及6.6万的外源融合蛋白表达，并得到较纯的酶蛋白。
, 百拇医药
中图分类号：Q546
Clonging and Expression for DNA Fragment of Complete Sequence and Catalytic Domain of Human Tyrosine Hydroxylase
Xiong Ying,Liu Hua,Yu Peilan,Zhang Chengbo
(Department of Biochem,Capital University of Medical Sciences)
Yang Hui,Xu Qunyuan
(Beijing Institute for Neuroscience)
Abstract:In order to obtain complete sequence and catalytic core of human tyrosine hydroxylase(TH) cDNA,the full length of cDNA from human TH was used as template and the specific oligonucleotide primers were designed for PCR.The target fragments were cloned into vector pGEX-4T-1 respectively.The recombinant plasmids were transferred into E.coli BL21,and the expression of target protein was induced with IPTG.The expressed protein was analysed by SDS-PAGE and western-blotting.The result showed that the cDNA fragments of complete sequence and catalytic core of human TH were harvested.The sequencing for them showed that the cloned target gene fragments were correct.SDS-PAGE indicated that the proteins with Mr about 83000 and 66000 were expressed with the recombinant plamids pGEXTHa and pGEXTHc respectively.
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Key words:tyrosine hydroxylase;expression;catalytic core;complete sequence
酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是儿茶酚胺类神经递质合成过程中的限速酶，催化酪氨酸转变成L-多巴(L-DOPA)，常被用来作为帕金森病(Parkinson disease，PD)基因治疗时的目的基因[1]。因此植入脑内的外源性TH基因能否高效表达酶的活性是基因治疗PD有无疗效的关键。本研究拟在原核表达系统中表达人TH全酶及催化核心，如能证实后者的活性的确高于前者，则可为PD治疗提供更有效的手段。
1 材料和方法
1.1 材料
质粒与菌种:pRrchTH质粒由Somatix Therapy Corporation提供，pGEX-4T-1质粒、大肠杆菌BL21购自Amersham Parmacia公司。
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酶与化学试剂:PCR引物由赛百盛生物工程公司合成，AccuPowerTM PCR Premix试剂盒购于Bioneer公司，限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于华美公司，Glassmilk kit购自原平皓公司，质粒快速提取试剂盒购自博大科技公司，IPTG、抗TH单克隆抗体为Sigma公司产品。其余试剂均为分析纯试剂。
1.2 方法
1)PCR扩增DNA片段：对于TH全长序列及根据大鼠TH催化结构域对应的DNA碱基序列(2～4)推导出的人TH所对应的催化结构域的碱基序列，设计出特定的引物，进行PCR扩增反应。
2)DNA重组克隆及其鉴定：质粒提取、酶切反应、电泳分析、DNA回收、连接反应、细菌转化等均参照文献[2]略作修改进行。DNA测序采用Sanger双脱氧终止法，由TaKaRa Bio公司测定。
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构建的表达质粒相应地分别命名为pGEXTHa、pGEXTHc。
3)基因表达：参照文献[2]中GST融合蛋白的表达方法进行。
4)表达产物溶解性分析：取诱导后破菌上清蛋白样品及诱导后破菌沉淀蛋白样品进行SDS-PAGE分析表达产物的溶解性。
5)融合表达产物的亲和层析纯化：在10倍体积的PBS中预溶胀S-连接谷胱甘肽-琼脂糖凝胶珠1 h，然后用PBS洗涤2次，以PBS按50%比例重悬，该糊状琼脂糖凝胶于4 ℃保存备用。
取适量诱导后破菌上清蛋白样品，加入1/10体积的50%谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液，室温下轻柔混匀5 min，加与上清蛋白样品等体积PBS，用涡旋混合器短暂振荡旋起，高速离心5 s，收集琼脂糖珠，弃去上清。重复用PBS洗涤2次。往洗过的琼脂糖珠中加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5 min，各取20 μL 上样，进行SDS-PAGE分析表达产物的纯化情况。最后进一步用western blotting鉴定表达产物。
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2 结果
2.1 人THacDNA及THccDNA的获得
根据Genbank中人TH2mRNA的基因序列，以及大鼠TH催化结构域对应的DNA碱基序列推导出的人TH催化结构域的碱基部位，设计的引物为：
引物1：5' TTAGGATCCATGCCCACCCCCGACGC 3'
引物2：5' TTAGGATCCGCCGCCCTGCTCAGTGG 3'
引物3：5' TTGAATTCCTAGCCAATGGCACTCAG 3'
引物1为全长序列5'端引物，在其中引进了1个BamH1酶切位点，引物2为催化结构域序列5'端引物，也包含1个BamH1酶切位点，由于采用融合表达载体，所以不必另加入起始密码子。引物3为上2段序列共用的3'端引物，在其中引进了1个EcoR1酶切位点，且包含终止密码子TAG的互补序列CTA。
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以质粒pRrchTH上人的全长TH2cDNA为模板，用上述一对半引物进行PCR扩增反应，通过琼脂糖电泳分析扩增产物，分别获得1.5 kb的人TH全长序列cDNA条带和1.05 kb的催化结构域序列cDNA条带，两端均带有所设计的工具酶识别位点。
2.2 表达质粒的构建及鉴定
经前述方法构建的重组质粒pGEXTHa和pGEXTHc，长度分别为6.45 kb及6.00 kb。对于质粒pGEXTHa，以Pst1单切后，产生4.15 kb及2.30 kb片段，证明其中的外源基因插入方向正确(图1)。 对于质粒pGEXTHc，以EcoR1和Pst1双切后，产生约5.04 kb及0.96 kb的片段，证明其中的外源基因插入方向正确(图2)。
2.3 THacDNA及THccDNA的序列分析
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图1 酶切图谱鉴定重组体pGEXTHa
1：pGEXTHa质粒;M1：λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；2、4、5、6：pGEXTHa/Pst1单酶切正向插入产物；3：pGEXTHa/Pst1单酶切未见正确片段，舍弃；M2：λDNA/HindⅢ(Marker)
图2 酶切图谱鉴定重组体pGEXTHc
1：pGEXTHc质粒；M1：λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；2、3、4、5、6：pGEXTHc/ Pst1+EcoR1双切正向插入产物；M2：λDNA/HindⅢ(Marker)
对于载体pGEX-4T-1，合成1对测序引物，用双脱氧法对插入片段进行DNA序列分析，再与人THmRNA相应序列(genbank 91120)比较，测序结果与THmRNA相应序列完全一致。
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2.4 人TH全长及核心片段基因在大肠杆菌中表达
将上述构建的重组表达质粒分别转化大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导的表达研究。在37 ℃条件下诱导表达2～3 h，表达产物用含12%凝胶的SDS-PAGE检测。结果显示，两重组菌克隆分别比各自相应的对照及未经诱导者多出1条新生深染条带，含TH全长基因的重组菌中新生深染条带相对分子质量约为8.3万，含TH核心片段基因的重组菌中新生深染条带相对分子质量约为6.6万，与预期的GST-THa、GST-THc融合蛋白大小相符(见图3)。取诱导物进行的分级分离电泳显示，表达产物主要为可溶性蛋白(见图3的2、3、7、8)。
2.5 融合蛋白表达量的测定及纯化鉴定
对蛋白电泳结果进行光密度扫描，显示GST-THa、GST-THc融合蛋白主要存在于诱导后破菌上清蛋白样品中，分别约占细菌可溶性总蛋白的10.59%和12.47%，诱导后破菌沉淀中亦有少量目的蛋白。2种上清蛋白样品经亲和层析纯化，纯度分别为87.63%和90.18%(图3的6、1)。进一步以western blotting鉴定，GST-THa融合蛋白可见明显表达条带，证明所表达产物的确是TH蛋白，而GST-THc融合蛋白未见明显条带，可能是由于N-端缺失影响其与TH单克隆抗体的结合所致。
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图3 GST-TH融合蛋白的表达
1：纯化的GST-THc融合蛋白;2：pGEXTHc诱导后破菌上清;3：pGEXTHc诱导后破菌沉淀;4：pGEXTHc 未诱导表达;5：pGEX-4T-1表达产物;6：纯化的GST-THa融合蛋白;7：pGEXTHa诱导后破菌上清;8：pGEXTHa诱导后破菌沉淀;9：pGEXTHa未诱导表达;M：蛋白质相对分子质量标准
3 讨论
TH分子由N-端调节结构域和C-端催化结构域组成，对TH用蛋白酶进行限制性水解可以提高酶的活性[3]，即野生型酶一旦切去了包含磷酸化位点的N-端调节结构域，TH就成为有活性的形式[4，5]。Kaufman等提出了真核生物中存在有TH的翻译后调控机制[6～8]，推测TH的N-端调节结构域对酶活性起抑制作用，认为TH全酶可与其反馈抑制剂儿茶酚胺类化合物紧密的结合，从而限制了酶与底物的结合，影响酶的活性。相反，如切去包括磷酸化位点在内的调节结构域，可引起酶的构象改变，有利于底物进入酶的活性中心，激活酶的催化活性。人TH含有4种亚型，即TH1、TH2、TH3和TH4，其中TH1催化活性最高，另外3种的活性是其的30%～50%。而与TH1cDNA相比，其他3种THcDNA在90～91碱基之间分别具有12、81和93 bp的插入序列，它们的催化核心序列则完全相同。据此推测上述插入序列的存在可能抑制了酶的活性[9]。Nagatsu发现不同动物的TH氨基酸顺序存在着高度保守性，均包含可被蛋白激酶磷酸化的调节结构域以及可与底物酪氨酸、分子氧和辅因子四氢喋啶(BH4)结合并具有催化活性的催化结构域[10]。因此，我们在已知大鼠TH催化结构域的氨基酸序列及其对应的核酸碱基序列基础上，推导出人TH催化结构域的碱基部位，进行克隆和表达，得到的N-端缺失145个氨基酸的TH催化核心蛋白，由于消除了N-端部分蛋白的抑制作用，应具有较高的酶活性。若该假设得到证实，则可为帕金森病基因治疗提供更有效的工具。
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我们采用的质粒pGEX-4T-1为含谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合表达载体，含Ptac启动子和3个读框的终止码，具Amp抗性，GST后接59 bp的多克隆位点，GST与目的基因之间有凝血酶(thrombin)的识别位点。该高效融合蛋白表达载体的优点是：不但消除了外源基因起始信号ATG周围核苷酸序列对其表达水平的影响，而且以融合形式表达的目的蛋白降低了对宿主细胞的毒性作用，有利于目的蛋白的高效表达，表达的融合蛋白多以可溶形式存在，可通过亲和层析纯化，操作简单易行，所得产品纯度高。同时可用特定的蛋白酶切除GST，从而获得正确折叠、有生物活性的酶蛋白，为以后的酶学研究提供了有利条件。
参考文献
1，Freeman T B.From transplants to gene therapy for Parkinson's disease.Exp Neurol,1997,144(1):47～50
, 百拇医药 2，F.奥斯伯，R.布伦特，R E.金斯顿，等著.精编分子生物学实验指南.颜子颖，王海林译.北京：科学出版社，1998
3，Kuczenski R.Rat brain tyrosine hydroxylase:Activation by limited tryptic proteolysis.J Biol Chem,1973,248(7):2261
4，Abate C,Joh T H.Limited proteolysis of rat brain tyrosine hydroxylase defines and N-terminal region required for regulation of cofactor binding and directing substrate specificity.J Mol Neurosci,1992,2(4):203
, 百拇医药
5，Abate C,Smith J A,Joh T H.Charaterization of the catalytic domain of bovine adrenal tyrosine hydroxylase.Biochem Biophys Res Commun,1988,151(3):1446
6，Kaufman S.Tyrosine hydroxylase.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1995,70:103
7，Ribeiro P,Wang Y,Citron B A,et al.Deletion mutagenesis of rat PC12 tyrosine hydroxylase regulatory and catalytic domains.J Mol Neurosci,1993,4(2):125
8，Kumer S C,Vrana K E.Intricate regulation of tyrosine hydroxylase activity and gene expression.J Neurochem,1996,67(2):443
9，Nagatsu T.The human tyrosine hydroxylase gene.Cell Mol Neurobiol,1989,9(3):313
10，Nagatsu T,Ichinose H.Comparative studies on the structure of human tyrosine hydroxylase with those of the enzyme of various mammals.Comp Biochem Physical,1991,98(1):203
收稿日期：2000-05-17, 百拇医药
单位：熊英 刘华 于培兰 张澄波(首都医科大学生化教研室)；杨慧 徐群渊(北京市神经科学研究所)
关键词：酪氨酸羟化酶；表达；催化核心；全长序列
首都医科大学学报000401 提要：设计合成含适当酶切位点的PCR引物，以人的全长THcDNA为模板，进行PCR扩增反应，得到人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)全长及催化核心序列，将其分别插入谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1,转化入大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达，SDS-PAGE、western blotting分析表达产物。结果获得了编码N-端缺失145个氨基酸的酪氨酸羟化酶催化结构域的cDNA片段及带一定内切酶识别位点的全长片段，表达载体构建正确。插入片段序列与人THmRNA相应序列完全一致。转入重组质粒的菌经诱导后，有相对分子质量约为8.3万及6.6万的外源融合蛋白表达，并得到较纯的酶蛋白。
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中图分类号：Q546
Clonging and Expression for DNA Fragment of Complete Sequence and Catalytic Domain of Human Tyrosine Hydroxylase
Xiong Ying,Liu Hua,Yu Peilan,Zhang Chengbo
(Department of Biochem,Capital University of Medical Sciences)
Yang Hui,Xu Qunyuan
(Beijing Institute for Neuroscience)
Abstract:In order to obtain complete sequence and catalytic core of human tyrosine hydroxylase(TH) cDNA,the full length of cDNA from human TH was used as template and the specific oligonucleotide primers were designed for PCR.The target fragments were cloned into vector pGEX-4T-1 respectively.The recombinant plasmids were transferred into E.coli BL21,and the expression of target protein was induced with IPTG.The expressed protein was analysed by SDS-PAGE and western-blotting.The result showed that the cDNA fragments of complete sequence and catalytic core of human TH were harvested.The sequencing for them showed that the cloned target gene fragments were correct.SDS-PAGE indicated that the proteins with Mr about 83000 and 66000 were expressed with the recombinant plamids pGEXTHa and pGEXTHc respectively.
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Key words:tyrosine hydroxylase;expression;catalytic core;complete sequence
酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是儿茶酚胺类神经递质合成过程中的限速酶，催化酪氨酸转变成L-多巴(L-DOPA)，常被用来作为帕金森病(Parkinson disease，PD)基因治疗时的目的基因[1]。因此植入脑内的外源性TH基因能否高效表达酶的活性是基因治疗PD有无疗效的关键。本研究拟在原核表达系统中表达人TH全酶及催化核心，如能证实后者的活性的确高于前者，则可为PD治疗提供更有效的手段。
1 材料和方法
1.1 材料
质粒与菌种:pRrchTH质粒由Somatix Therapy Corporation提供，pGEX-4T-1质粒、大肠杆菌BL21购自Amersham Parmacia公司。
, http://www.100md.com
酶与化学试剂:PCR引物由赛百盛生物工程公司合成，AccuPowerTM PCR Premix试剂盒购于Bioneer公司，限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于华美公司，Glassmilk kit购自原平皓公司，质粒快速提取试剂盒购自博大科技公司，IPTG、抗TH单克隆抗体为Sigma公司产品。其余试剂均为分析纯试剂。
1.2 方法
1)PCR扩增DNA片段：对于TH全长序列及根据大鼠TH催化结构域对应的DNA碱基序列(2～4)推导出的人TH所对应的催化结构域的碱基序列，设计出特定的引物，进行PCR扩增反应。
2)DNA重组克隆及其鉴定：质粒提取、酶切反应、电泳分析、DNA回收、连接反应、细菌转化等均参照文献[2]略作修改进行。DNA测序采用Sanger双脱氧终止法，由TaKaRa Bio公司测定。
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构建的表达质粒相应地分别命名为pGEXTHa、pGEXTHc。
3)基因表达：参照文献[2]中GST融合蛋白的表达方法进行。
4)表达产物溶解性分析：取诱导后破菌上清蛋白样品及诱导后破菌沉淀蛋白样品进行SDS-PAGE分析表达产物的溶解性。
5)融合表达产物的亲和层析纯化：在10倍体积的PBS中预溶胀S-连接谷胱甘肽-琼脂糖凝胶珠1 h，然后用PBS洗涤2次，以PBS按50%比例重悬，该糊状琼脂糖凝胶于4 ℃保存备用。
取适量诱导后破菌上清蛋白样品，加入1/10体积的50%谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液，室温下轻柔混匀5 min，加与上清蛋白样品等体积PBS，用涡旋混合器短暂振荡旋起，高速离心5 s，收集琼脂糖珠，弃去上清。重复用PBS洗涤2次。往洗过的琼脂糖珠中加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5 min，各取20 μL 上样，进行SDS-PAGE分析表达产物的纯化情况。最后进一步用western blotting鉴定表达产物。
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2 结果
2.1 人THacDNA及THccDNA的获得
根据Genbank中人TH2mRNA的基因序列，以及大鼠TH催化结构域对应的DNA碱基序列推导出的人TH催化结构域的碱基部位，设计的引物为：
引物1：5' TTAGGATCCATGCCCACCCCCGACGC 3'
引物2：5' TTAGGATCCGCCGCCCTGCTCAGTGG 3'
引物3：5' TTGAATTCCTAGCCAATGGCACTCAG 3'
引物1为全长序列5'端引物，在其中引进了1个BamH1酶切位点，引物2为催化结构域序列5'端引物，也包含1个BamH1酶切位点，由于采用融合表达载体，所以不必另加入起始密码子。引物3为上2段序列共用的3'端引物，在其中引进了1个EcoR1酶切位点，且包含终止密码子TAG的互补序列CTA。
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以质粒pRrchTH上人的全长TH2cDNA为模板，用上述一对半引物进行PCR扩增反应，通过琼脂糖电泳分析扩增产物，分别获得1.5 kb的人TH全长序列cDNA条带和1.05 kb的催化结构域序列cDNA条带，两端均带有所设计的工具酶识别位点。
2.2 表达质粒的构建及鉴定
经前述方法构建的重组质粒pGEXTHa和pGEXTHc，长度分别为6.45 kb及6.00 kb。对于质粒pGEXTHa，以Pst1单切后，产生4.15 kb及2.30 kb片段，证明其中的外源基因插入方向正确(图1)。 对于质粒pGEXTHc，以EcoR1和Pst1双切后，产生约5.04 kb及0.96 kb的片段，证明其中的外源基因插入方向正确(图2)。
2.3 THacDNA及THccDNA的序列分析
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图1 酶切图谱鉴定重组体pGEXTHa
1：pGEXTHa质粒;M1：λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；2、4、5、6：pGEXTHa/Pst1单酶切正向插入产物；3：pGEXTHa/Pst1单酶切未见正确片段，舍弃；M2：λDNA/HindⅢ(Marker)
图2 酶切图谱鉴定重组体pGEXTHc
1：pGEXTHc质粒；M1：λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ(Marker)；2、3、4、5、6：pGEXTHc/ Pst1+EcoR1双切正向插入产物；M2：λDNA/HindⅢ(Marker)
对于载体pGEX-4T-1，合成1对测序引物，用双脱氧法对插入片段进行DNA序列分析，再与人THmRNA相应序列(genbank 91120)比较，测序结果与THmRNA相应序列完全一致。
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2.4 人TH全长及核心片段基因在大肠杆菌中表达
将上述构建的重组表达质粒分别转化大肠杆菌BL21，进行IPTG诱导的表达研究。在37 ℃条件下诱导表达2～3 h，表达产物用含12%凝胶的SDS-PAGE检测。结果显示，两重组菌克隆分别比各自相应的对照及未经诱导者多出1条新生深染条带，含TH全长基因的重组菌中新生深染条带相对分子质量约为8.3万，含TH核心片段基因的重组菌中新生深染条带相对分子质量约为6.6万，与预期的GST-THa、GST-THc融合蛋白大小相符(见图3)。取诱导物进行的分级分离电泳显示，表达产物主要为可溶性蛋白(见图3的2、3、7、8)。
2.5 融合蛋白表达量的测定及纯化鉴定
对蛋白电泳结果进行光密度扫描，显示GST-THa、GST-THc融合蛋白主要存在于诱导后破菌上清蛋白样品中，分别约占细菌可溶性总蛋白的10.59%和12.47%，诱导后破菌沉淀中亦有少量目的蛋白。2种上清蛋白样品经亲和层析纯化，纯度分别为87.63%和90.18%(图3的6、1)。进一步以western blotting鉴定，GST-THa融合蛋白可见明显表达条带，证明所表达产物的确是TH蛋白，而GST-THc融合蛋白未见明显条带，可能是由于N-端缺失影响其与TH单克隆抗体的结合所致。
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图3 GST-TH融合蛋白的表达
1：纯化的GST-THc融合蛋白;2：pGEXTHc诱导后破菌上清;3：pGEXTHc诱导后破菌沉淀;4：pGEXTHc 未诱导表达;5：pGEX-4T-1表达产物;6：纯化的GST-THa融合蛋白;7：pGEXTHa诱导后破菌上清;8：pGEXTHa诱导后破菌沉淀;9：pGEXTHa未诱导表达;M：蛋白质相对分子质量标准
3 讨论
TH分子由N-端调节结构域和C-端催化结构域组成，对TH用蛋白酶进行限制性水解可以提高酶的活性[3]，即野生型酶一旦切去了包含磷酸化位点的N-端调节结构域，TH就成为有活性的形式[4，5]。Kaufman等提出了真核生物中存在有TH的翻译后调控机制[6～8]，推测TH的N-端调节结构域对酶活性起抑制作用，认为TH全酶可与其反馈抑制剂儿茶酚胺类化合物紧密的结合，从而限制了酶与底物的结合，影响酶的活性。相反，如切去包括磷酸化位点在内的调节结构域，可引起酶的构象改变，有利于底物进入酶的活性中心，激活酶的催化活性。人TH含有4种亚型，即TH1、TH2、TH3和TH4，其中TH1催化活性最高，另外3种的活性是其的30%～50%。而与TH1cDNA相比，其他3种THcDNA在90～91碱基之间分别具有12、81和93 bp的插入序列，它们的催化核心序列则完全相同。据此推测上述插入序列的存在可能抑制了酶的活性[9]。Nagatsu发现不同动物的TH氨基酸顺序存在着高度保守性，均包含可被蛋白激酶磷酸化的调节结构域以及可与底物酪氨酸、分子氧和辅因子四氢喋啶(BH4)结合并具有催化活性的催化结构域[10]。因此，我们在已知大鼠TH催化结构域的氨基酸序列及其对应的核酸碱基序列基础上，推导出人TH催化结构域的碱基部位，进行克隆和表达，得到的N-端缺失145个氨基酸的TH催化核心蛋白，由于消除了N-端部分蛋白的抑制作用，应具有较高的酶活性。若该假设得到证实，则可为帕金森病基因治疗提供更有效的工具。
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我们采用的质粒pGEX-4T-1为含谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合表达载体，含Ptac启动子和3个读框的终止码，具Amp抗性，GST后接59 bp的多克隆位点，GST与目的基因之间有凝血酶(thrombin)的识别位点。该高效融合蛋白表达载体的优点是：不但消除了外源基因起始信号ATG周围核苷酸序列对其表达水平的影响，而且以融合形式表达的目的蛋白降低了对宿主细胞的毒性作用，有利于目的蛋白的高效表达，表达的融合蛋白多以可溶形式存在，可通过亲和层析纯化，操作简单易行，所得产品纯度高。同时可用特定的蛋白酶切除GST，从而获得正确折叠、有生物活性的酶蛋白，为以后的酶学研究提供了有利条件。
参考文献
1，Freeman T B.From transplants to gene therapy for Parkinson's disease.Exp Neurol,1997,144(1):47～50
, 百拇医药 2，F.奥斯伯，R.布伦特，R E.金斯顿，等著.精编分子生物学实验指南.颜子颖，王海林译.北京：科学出版社，1998
3，Kuczenski R.Rat brain tyrosine hydroxylase:Activation by limited tryptic proteolysis.J Biol Chem,1973,248(7):2261
4，Abate C,Joh T H.Limited proteolysis of rat brain tyrosine hydroxylase defines and N-terminal region required for regulation of cofactor binding and directing substrate specificity.J Mol Neurosci,1992,2(4):203
, 百拇医药
5，Abate C,Smith J A,Joh T H.Charaterization of the catalytic domain of bovine adrenal tyrosine hydroxylase.Biochem Biophys Res Commun,1988,151(3):1446
6，Kaufman S.Tyrosine hydroxylase.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1995,70:103
7，Ribeiro P,Wang Y,Citron B A,et al.Deletion mutagenesis of rat PC12 tyrosine hydroxylase regulatory and catalytic domains.J Mol Neurosci,1993,4(2):125
8，Kumer S C,Vrana K E.Intricate regulation of tyrosine hydroxylase activity and gene expression.J Neurochem,1996,67(2):443
9，Nagatsu T.The human tyrosine hydroxylase gene.Cell Mol Neurobiol,1989,9(3):313
10，Nagatsu T,Ichinose H.Comparative studies on the structure of human tyrosine hydroxylase with those of the enzyme of various mammals.Comp Biochem Physical,1991,98(1):203
收稿日期：2000-05-17, 百拇医药