中国南海总合草苔虫抗癌活性成分研究 III△Bryostatin 10, 11, 18的分离鉴定及其体外抗肿瘤活性
作者：林厚文 易杨华 姚新生 吴厚铭
单位：林厚文 易杨华(第二军医大学药学院天然药物化学教研室，上海 200433) 姚新生(沈阳药科大学，沈阳市110015)吴厚铭(上海有机化学研究所，上海市200031)
关键词：总合草苔虫，抗癌活性，草苔虫内酯
中国海洋药物000401 摘要 对采自广西北海的总合草苔虫进行抗癌活性成分的追踪分离，经溶媒提取和多种层析方法(Sephadex LH-20, ODS, HPLC等)分离，得到6个活性单体。利用电喷雾离子质谱(ESI-MS)和高分辨核磁共振(600 MHz)二维谱技术(DQF-COSY, HMQC, TOCSY, ROESY等)，分别将其鉴定为：bryostatin 4, bryostatin 5, bryostatin 6，bryostatin 10，bryostatin 11，bryostatin 18。其中，bryostatin 10，bryostatin 11，bryostatin 18是首次从中国产总合草苔虫中获得，并在体外表现出显著的抗癌活性。
, 百拇医药
STUDIES ON THE ANTINEOPLASTIC CONSTITUENTS FROM MARINE BRYOZOAN BUGULA NERITINA INHABITING SOUTH CHINA SEA (III)：Isolation and Structural Elucidation of Bryostatin 10, 11 and 18
Lin Houwen，Yi Yanghua，Yao Xinsheng，Wu Houming
(School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
ABSTRACT Six active compounds were isolated from the marine bryozoan Bugula neritina , inhabiting Nanwan Bay in South China Sea, by bioassay-guided isolation method with a combination of extraction and partitionation with suitable solvent as well as multiple column chromatographies (Sephadex LH-20, ODS and preparative HPLC). Their structure were elucidated as known bryostatins：bryostatin 4, 5, 6, 10, 11 and 18 by intensive analysis of the data of high resolution 2D NMR (600 MHz, DQF-COSY, TOCSY, HMQC and ROESY) and ESI-MS. Among them, bryostatin 10, 11 and 18 were for the first time obtained from this bryozoan in South China Sea and showed significant antineoplastic activities in vitro.
, 百拇医药
KEY WORDS Bugula neritina， Antineoplastic activities， Bryostatins 总合草苔虫Bugula neritina (Linnaeus)是我国较常见的海洋污损物之一，也是世界上广泛分布的最常见的一种海洋底栖动物。作者对我国大鹏湾海域的总合草苔虫进行了抗癌活性成分的初步研究，发现其中含有结构独特的抗癌活性成分[1、 2]。为充分开发利用我国海洋药物资源，作者对南中国海的总合草苔虫资源进行了广泛调查，样本采自我国广东、广西、福建、海南等南部沿海海域，对采自广西北海南湾的总合草苔虫样本(60 kg)进行了广泛的抗癌活性成分追踪分离，从中共分离得到6个活性单体。利用高分辨(600 MHz)二维核磁共振技术和电喷雾离子质谱(ESI-MS)等光谱解析手段，确定了所有化合物的结构。其中，bryostatin 4, 5, 6 已经从南海总合草苔虫中获得[2]，Bryostatin 10, 11, 18是首次从中国南海总合草苔虫中获得，并在体外表现出显著的抗癌活性。本文报道bryostatin 10, 11,18的分离鉴定和体外抗癌活性。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 与已发表文章相同[2]。
1.2 样本采集
样本于1997年3月采自广西北海南湾。样本采集后置阴凉通风处，海风吹至近干，共收得100 kg。样本经国家海洋局第三海洋研究所李传燕研究员鉴定，为总合草苔虫Bugula neritina(Linnaeus)。
1.3 提取分离
新鲜采集的样本(60 kg，干重)，用95%乙醇(500mL)室温浸提1周，共提取4次，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得浸膏2 kg。浸膏用90%甲醇悬浮分散，用正已烷10L萃取5次，得正己烷萃取物560 g，经体外抗癌活性筛选无活性。含水甲醇层再加水配成80%甲醇水溶液，用CCl4(10L)萃取5次，得CCl4萃取物60 g(IC50=7× 10-3μg.L-1，P388)，为活性部位。该活性部位经快速硅胶柱层析(200～300目)得活性组分2BH-10(2.7 g，IC50=2.4×10-3μg.L-1，P388)。2BH-10经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，以CH2Cl2-MeOH (1:1) 洗脱，流速60 mL.h-1，得到两个活性组分A (1.7g,IC50=3×10-4μg.L-1，P388)和B(1.1g，IC50=8×10-4μg.L-1，P388)。对这两个活性组分分别进行2次凝胶柱层析，依次以Hexane-CH2Cl2-MeOH (4:5:1) 和 Hexane-CH2Cl2-MeOH (10:10:1)洗脱，分别得到纯度更高、活性更强的两个组分C (0.7 g,IC50= 1×10-4μg.L-1, P388) 和D (0.5 g, IC50=0.8μg.L-1, P388)。C、D两组分仍含有较多的绿色素，故将二者合并，进行ODS快速柱层析，以50%～80% MeOH梯度洗脱，得浅黄色活性组分E (0.8 g, IC50=0.48μg.L-1, P388)。该组分经硅胶柱层析，以Hexane-acetone (5:1→1:1) 梯度洗脱，得到两个部分F (0.4 g) 和 G (0.2 g)。F 经反复HPLC 制备，以83% MeOH 为流动相，分别得到化合物1 (10 mg)、化合物2 (65 mg)、化合物4 (50 mg)。G经过1次Lobar柱制备分离，以50%～80% MeOH梯度洗脱，得到3个组分G1 (5 mg)、G2 (12 mg)、G3 (34 mg)。G1经反复HPLC制备，以75% MeOH为流动相，得到化合物3 (2.1 mg)。G2、G3分别经HPLC制备，以85% MeOH为流动相，分别得到化合物5 (5.8 mg) 和化合物6 (18 mg)。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 结构鉴定
化合物1，白色无定型粉末，mp156～159℃。UV 显示bryostatin类大环内酯化合物的特征吸收峰λmaxMeOH＝228.7nm。ESI-MS给出[M+Na+H](m/z 832)和[2M+Na+2H](m/z 1641),示相对分子质量为808，与bryostatin 10和18的分子量相同。二者是在C21位上α，β-不饱和酯的立体异构体[3～5]，如图1所示。
图1 Bryostatin 10与Bryostatin 18 的立体异构
这两个化合物的1HNMR和13CNMR谱数据很相近，只是在C-20位和C-22位上化学位移不同。Bryostatin 18的1HNMR谱中，两个H-20质子信号分别出现在δ 3.79和2.10，而22位两个氢质子信号分别出现在δ 2.23和2.02。与此相对应，Bryostatin 10的20位两个氢质子信号分别出现在δ2.73和2.20，而22位两个氢质子信号分别出现在δ4.00和1.95。Bryostatin 18中20位两个氢质子和Bryostatin 10中22位两个氢质子的高度不对称性，可能是由于-OCH3的空间位阻效应或α，β-不饱和酯羰基的屏蔽效应造成的。因此，如图1所示，21位双键的E或Z构型，可以根据C-21或C-22位两个氢质子的不对称性来判断。同样，13CNMR谱中，Bryostatin 18的C-20信号出现在δ 33.70，C-22信号出现在δ 43.13，而Bryostatin 10中C-20信号出现在δ 40.39，C-22信号出现在δ 36.63。这可能是由于-OCH3的空间位阻效应，使与之相近的碳原子化学位移向高场移动。仔细比较化合物1与Bryostatin 18及Bryostatin 10的1HNMR和13CNMR谱数据，结果与Bryostatin 18的数据相一致[3]，见表1。故确定化合物1的结构为Bryostatin 18(见图2)。
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化合物1相对立体构型的确立，主要是通过对其1HNMR谱中偶合常数及ROESY谱中相关信号的仔细分析而推断的。首先，16、17位反式双键 (E式构型)是根据H-16与H-17的偶合常数(J16-17＝16.11 Hz)而确立的。在ROESY谱中，存在H-17与H-15的相关峰，证明了H-15的竖键取向。同样，H-11与H-15的相关峰也证明了H-11的竖键取向。H-5与H-7有明显的相关峰，说明两者吡喃环的同侧。H-7 (δ 5.10, dd, J = 11.97, 4.95 Hz)的取向可根据其与邻位H-6较大的偶合常数(Jaa =11.97 Hz)而定，因此，H-5也一定是竖键取向。
化合物1的1HNMR谱中，有1个双重峰(δ 4.75, d, J = 2.89 Hz)很特别。在HMQC谱中，没有与之相对应的碳原子信号，说明此氢质子不是连接在碳原子上，而可能是连接在C-19、25、9或3位上的羟基质子。将该双重峰归属于25-OH、9-OH或3-OH似乎不合理，因为缺乏与邻位质子NOE相关信号的支持。而该双重峰与23-H (δ 4.05, m)有明显NOE相关 (δ 4.75/4.05)，因此，该双重峰只能是19位上羟基质子的信号。
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13位上α，β-不饱和甲酯的构型可根据一系列ROESY相关峰确立，如图2(Fig. 2)所示。
Fig. 2 Summary of ROESY correlations observed for compound 1, tm 300 ms,CDCl3.Geminal and some vicinal correlations were omitted for clarity.
化合物2，白色无定型粉末，mp 160～164℃。UV 显示bryostatin类大环内酯化合物的特征吸收峰λmaxMeOH＝228.7nm。ESI-MS给出[M+Na+H](m/z 832)和[2M+Na+2H](m/z 1641),示相对分子质量808，结合元素分析结果，推知其分子式为C42H64O15，与化合物1相同，可能是bryostatin 10和18的立体异构体中的1个。仔细比较化合物2与Bryostatin 10[4]的1HNMR和13CNMR谱数据，结果完全一致，见表2。故确定化合物2的结构为Bryostatin 10(见图3)。
, 百拇医药
化合物3，白色无定型粉末，mp 156～159℃。UV 显示bryostatin类大环内酯化合物的特征吸收峰λmaxMeOH＝228.7nm。ESI-MS给出[M+Na+H](m/z 790)和[2M+Na+2H](m/z 1557),示分子量766，结合元素分析结果，推知其分子式为C39H58O15，与bryostatin 11相同[5、 6]。由于样品数量有限，故未测定其1HNMR和13CNMR谱，其结构暂定为bryostatin 11(见Fig.3)。
化合物4，5，6分别鉴定为bryostatin 4，5和6，已作过报道[2]。
Fig. 3 Structure of compound 2 and 3
, 百拇医药
2. 2 体外抗癌活性试验结果
采用台盼兰排染法和MTT法,测定化合物1，2，3对人红细胞白血病K562，人单核细胞白血病U937的抑制率。3个样品都表现出显著的抗癌活性，对K562的抑制率分别为2.2×103, 2.6×103, 3.4×104(mg.L-1);对U937的抑制率分别为1.8×102, 2.0×104, 5.2×104(mg.L-1)。
表1 化合物1与bryostatin 18的1HNMR和13CNMR 谱数据
Table 1.1HNMR and 13CNMR data for compound 1a and bryostatin 18b
, http://www.100md.com
1HNMR
13CNMR
Compound 1
Bryostatin 18
Compound 1
Bryostatin 18
1
172.44
172.37
2a
2.50 m
2.50 brs
, http://www.100md.com
42.21
42.73
2b
2.46 m
2.50 brs
3
4.11 m
4.04 m
68.16
69.81
9-OH
3.99 m
4a
, http://www.100md.com
2.0 (overlaped)c
1.80c
39.70
40.95
4b (α)
1.55 (overlaped)
1.70
5
4.22 brt
4.20 brt
65.69
, 百拇医药 66.70
6eq
1.70 (overlaped)
1.64
33.19
34.02
6ax
1.43 dt (11.5, 11.5)
1.45 dt (12, 12)
7
5.10 dd (4.95, 11.97)
5.07 dd (5, 12)
, 百拇医药
72.46
73.20
10a
2.08 (overlaped)
1.99
42.08
42.73
10b
1.66 (overlaped)
1.73
11
3.88 brt
, 百拇医药
3.92
71.31
73.44
12a (α)
1.72 m
2.17
44.74
44.71
12b
1.94 m
2.17
13
156.71
, 百拇医药
158.89
14eq
3.66 (overlaped)
3.57 brd (12)
36.54
37.36
14ax
1.90 (overlaped)
1.91
15
4.09 m (overlaped)
4.10
, http://www.100md.com
78.99
80.51
16
5.37 dd (8.67, 16.11)
5.31 dd (8, 16)
130.41
130.94
17
5.83 d (16.11)
5.87 d (16)
138.04
139.85
, http://www.100md.com
18
44.85
45.68
19
100.97
101.98
20a
3.67 s (overlaped)
3.79 d (12)
32.96
33.70
20b
, 百拇医药 2.05 m (overlaped)
2.10*
21
156.71
158.81
22a (β)
2.19
2.23*
44.17
43.13
22b
2.02
2.02
, 百拇医药
23
4.05
3.96
64.72
66.17
24a
1.90 m (overlaped)
1.95
36.16
36.03
24b
1.69 m
1.62 m
, 百拇医药
25
5.13 m
5.12
73.53
73.25
26
3.78 m
3.75
70.14
69.08
27
1.21 d (6.19)
1.07 d (6.7)
, http://www.100md.com
19.15
19.18
28
1.09
1.01 s
16.96
17.35
29
0.94 s
1.02 s
20.42
20.55
30
, http://www.100md.com
5.74 brs
5.76 brs
115.94
114.52
31
166.87
167.73
32
1.02 s
0.89 s
21.02
21.33
, 百拇医药 33
1.10
1.09 s
24.44
24.75
34
5.68 brs
5.73 brs
114.28
116.26
35
166.75
167.67
, 百拇医药
36
3.71 s
3.66 s
51.00
51.61
37
3.67 s
3.63 s
50.86
51.40
1HNMR
13CNMR
, 百拇医药
Compound 1
Bryostatin 18
Compound 1
Bryostatin 18
1'
178.01
178.54
2'
39.02
39.67
3'～5'
1.19 s
, 百拇医药
1.16 s
27.15
27.46
19-OH
4.75 d (2.89)
4.74 d (3)
a Recorded on a Bruker AMX-600 (600 MHz) spectrometer in CDCl3
b Recorded on a Bruker AMX-400 (400 MHz) spectrometer in Deuterioacetonitrile
c Couplings for these signals were obscured表2 化合物2与Bryostatin 10的1HNMR和13CNMR 谱数据
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Table 1. 1HNMR and 13CNMR data for compound 2a and bryostatin 10b
1HNMR
13CNMR
Compound2
Bryostatin 10
Compound2
Bryostatin10
1
171.60
172.64
, http://www.100md.com
2a
2.43 dd (2.3, 12.4)
2.44 d (11.7)
41.13
42.05
2b
2.53 t (12)
2.54 dd (12.2, 11.7)
3
4.12 m
4.12 m
67.15
, 百拇医药
68.14
3-OH
4.03 s
4a
1.54 m
1.54 d (14.7)
38.83
39.78
4b
1.97 m
1.97 m
5
4.21 m
, 百拇医药
4.23 d (12.2)
64.58
65.64
6a
1.42 m
1.43 d
32.21
33.19
6b
1.71 m
1.71 brs
7
5.12 m
, 百拇医药
5.10ddd(11.9, 7.3, 4.4)
71.66
72.59
8
40.28
41.26
9-OH
4.81 s
100.78
101.79
10a
1.66 d (14.7)
, http://www.100md.com
1.62 brs
41.06
42.16
10b
2.08 m
2.08 m
11
3.95 m
3.89 m
70.34
71.34
12a
2.06 m
, http://www.100md.com
2.06 m
43.20
44.19
12b
2.18 m (overlaped)
2.18 d(13.2)
43.20
44.19
13
156.15
157.04
14a
, 百拇医药
1.88 m
1.88 m
35.60
36.56
14b
3.66 m (overlaped)
3.66 m
15
4.11 m
4.11 m
77.90
78.95
, 百拇医药
16
5.35 dd (8.5, 15.9)
5.36 dd (8.3, 15.6)
129.48
130.43
17
5.81 d (15.5)
5.81 d (15.6)
136.87
137.91
18
43.73
, 百拇医药
44.75
19-OH
5.04 d (2.7)
5.91 s
99.93
100.93
20a
2.16 m (overlaped)
2.14 m
38.77
39.78
20b
, http://www.100md.com
2.36 d (13.2)
2.35 d (14.2)
21
156.00
157.04
22a
1.73 m
1.76 d (11.7)
35.11
35.72
22b
3.86 br d (13.2)
, 百拇医药
3.86 m
23
3.98 m
3.98 m
63.62
64.61
1HNMR
13CNMR
Compound2
Bryostatin 10
Compound2
Bryostatin10
, 百拇医药
24a
1.70 m
1.70 m
34.74
36.12
24b
1.95 m
1.95 m
25
5.10 m
5.08 dd (14.2, 3.9)
72.79
, http://www.100md.com 73.83
26
3.74 m
3.75 m
69.18
70.23
27
1.20 d (6.2)
1.21 d (6.8)
18.63
19.68
28
1.03 s
, http://www.100md.com
1.03 s
16.05
17.06
29
0.93 s
0.94 s
20.05
21.07
30
5.67 brs
5.68 brs
113.12
114.19
, 百拇医药
31
165.97
167.01
32
1.03 s
1.03 s
19.38
20.39
33
1.08 s
1.08 s
23.45
24.45
, http://www.100md.com
34
5.69 brs
5.69 brs
114.71
115.73
35
165.78
166.81
36
3.70 s
3.71 s
50.03
51.08
, http://www.100md.com
37
3.66 s
3.67 s
49.79
50.84
1'
177.15
178.13
2'
38.04
39.05
3'-5'
1.18 s
, 百拇医药
1.19 s
26.14
27.16
a Recorded on a Bruker AMX-600 (600 MHz) spectrometer in CDCl3
b Recorded on a JEOL JNM-EX400 (400 MHz) spectrometer in CDCl3国家自然科学基金资助项目(编号29672050)
参考文献
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(收稿日期：2000-06-25), 百拇医药
单位：林厚文 易杨华(第二军医大学药学院天然药物化学教研室，上海 200433) 姚新生(沈阳药科大学，沈阳市110015)吴厚铭(上海有机化学研究所，上海市200031)
关键词：总合草苔虫，抗癌活性，草苔虫内酯
中国海洋药物000401 摘要 对采自广西北海的总合草苔虫进行抗癌活性成分的追踪分离，经溶媒提取和多种层析方法(Sephadex LH-20, ODS, HPLC等)分离，得到6个活性单体。利用电喷雾离子质谱(ESI-MS)和高分辨核磁共振(600 MHz)二维谱技术(DQF-COSY, HMQC, TOCSY, ROESY等)，分别将其鉴定为：bryostatin 4, bryostatin 5, bryostatin 6，bryostatin 10，bryostatin 11，bryostatin 18。其中，bryostatin 10，bryostatin 11，bryostatin 18是首次从中国产总合草苔虫中获得，并在体外表现出显著的抗癌活性。
, 百拇医药
STUDIES ON THE ANTINEOPLASTIC CONSTITUENTS FROM MARINE BRYOZOAN BUGULA NERITINA INHABITING SOUTH CHINA SEA (III)：Isolation and Structural Elucidation of Bryostatin 10, 11 and 18
Lin Houwen，Yi Yanghua，Yao Xinsheng，Wu Houming
(School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
ABSTRACT Six active compounds were isolated from the marine bryozoan Bugula neritina , inhabiting Nanwan Bay in South China Sea, by bioassay-guided isolation method with a combination of extraction and partitionation with suitable solvent as well as multiple column chromatographies (Sephadex LH-20, ODS and preparative HPLC). Their structure were elucidated as known bryostatins：bryostatin 4, 5, 6, 10, 11 and 18 by intensive analysis of the data of high resolution 2D NMR (600 MHz, DQF-COSY, TOCSY, HMQC and ROESY) and ESI-MS. Among them, bryostatin 10, 11 and 18 were for the first time obtained from this bryozoan in South China Sea and showed significant antineoplastic activities in vitro.
, 百拇医药
KEY WORDS Bugula neritina， Antineoplastic activities， Bryostatins 总合草苔虫Bugula neritina (Linnaeus)是我国较常见的海洋污损物之一，也是世界上广泛分布的最常见的一种海洋底栖动物。作者对我国大鹏湾海域的总合草苔虫进行了抗癌活性成分的初步研究，发现其中含有结构独特的抗癌活性成分[1、 2]。为充分开发利用我国海洋药物资源，作者对南中国海的总合草苔虫资源进行了广泛调查，样本采自我国广东、广西、福建、海南等南部沿海海域，对采自广西北海南湾的总合草苔虫样本(60 kg)进行了广泛的抗癌活性成分追踪分离，从中共分离得到6个活性单体。利用高分辨(600 MHz)二维核磁共振技术和电喷雾离子质谱(ESI-MS)等光谱解析手段，确定了所有化合物的结构。其中，bryostatin 4, 5, 6 已经从南海总合草苔虫中获得[2]，Bryostatin 10, 11, 18是首次从中国南海总合草苔虫中获得，并在体外表现出显著的抗癌活性。本文报道bryostatin 10, 11,18的分离鉴定和体外抗癌活性。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 与已发表文章相同[2]。
1.2 样本采集
样本于1997年3月采自广西北海南湾。样本采集后置阴凉通风处，海风吹至近干，共收得100 kg。样本经国家海洋局第三海洋研究所李传燕研究员鉴定，为总合草苔虫Bugula neritina(Linnaeus)。
1.3 提取分离
新鲜采集的样本(60 kg，干重)，用95%乙醇(500mL)室温浸提1周，共提取4次，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得浸膏2 kg。浸膏用90%甲醇悬浮分散，用正已烷10L萃取5次，得正己烷萃取物560 g，经体外抗癌活性筛选无活性。含水甲醇层再加水配成80%甲醇水溶液，用CCl4(10L)萃取5次，得CCl4萃取物60 g(IC50=7× 10-3μg.L-1，P388)，为活性部位。该活性部位经快速硅胶柱层析(200～300目)得活性组分2BH-10(2.7 g，IC50=2.4×10-3μg.L-1，P388)。2BH-10经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，以CH2Cl2-MeOH (1:1) 洗脱，流速60 mL.h-1，得到两个活性组分A (1.7g,IC50=3×10-4μg.L-1，P388)和B(1.1g，IC50=8×10-4μg.L-1，P388)。对这两个活性组分分别进行2次凝胶柱层析，依次以Hexane-CH2Cl2-MeOH (4:5:1) 和 Hexane-CH2Cl2-MeOH (10:10:1)洗脱，分别得到纯度更高、活性更强的两个组分C (0.7 g,IC50= 1×10-4μg.L-1, P388) 和D (0.5 g, IC50=0.8μg.L-1, P388)。C、D两组分仍含有较多的绿色素，故将二者合并，进行ODS快速柱层析，以50%～80% MeOH梯度洗脱，得浅黄色活性组分E (0.8 g, IC50=0.48μg.L-1, P388)。该组分经硅胶柱层析，以Hexane-acetone (5:1→1:1) 梯度洗脱，得到两个部分F (0.4 g) 和 G (0.2 g)。F 经反复HPLC 制备，以83% MeOH 为流动相，分别得到化合物1 (10 mg)、化合物2 (65 mg)、化合物4 (50 mg)。G经过1次Lobar柱制备分离，以50%～80% MeOH梯度洗脱，得到3个组分G1 (5 mg)、G2 (12 mg)、G3 (34 mg)。G1经反复HPLC制备，以75% MeOH为流动相，得到化合物3 (2.1 mg)。G2、G3分别经HPLC制备，以85% MeOH为流动相，分别得到化合物5 (5.8 mg) 和化合物6 (18 mg)。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 结构鉴定
化合物1，白色无定型粉末，mp156～159℃。UV 显示bryostatin类大环内酯化合物的特征吸收峰λmaxMeOH＝228.7nm。ESI-MS给出[M+Na+H](m/z 832)和[2M+Na+2H](m/z 1641),示相对分子质量为808，与bryostatin 10和18的分子量相同。二者是在C21位上α，β-不饱和酯的立体异构体[3～5]，如图1所示。
图1 Bryostatin 10与Bryostatin 18 的立体异构
这两个化合物的1HNMR和13CNMR谱数据很相近，只是在C-20位和C-22位上化学位移不同。Bryostatin 18的1HNMR谱中，两个H-20质子信号分别出现在δ 3.79和2.10，而22位两个氢质子信号分别出现在δ 2.23和2.02。与此相对应，Bryostatin 10的20位两个氢质子信号分别出现在δ2.73和2.20，而22位两个氢质子信号分别出现在δ4.00和1.95。Bryostatin 18中20位两个氢质子和Bryostatin 10中22位两个氢质子的高度不对称性，可能是由于-OCH3的空间位阻效应或α，β-不饱和酯羰基的屏蔽效应造成的。因此，如图1所示，21位双键的E或Z构型，可以根据C-21或C-22位两个氢质子的不对称性来判断。同样，13CNMR谱中，Bryostatin 18的C-20信号出现在δ 33.70，C-22信号出现在δ 43.13，而Bryostatin 10中C-20信号出现在δ 40.39，C-22信号出现在δ 36.63。这可能是由于-OCH3的空间位阻效应，使与之相近的碳原子化学位移向高场移动。仔细比较化合物1与Bryostatin 18及Bryostatin 10的1HNMR和13CNMR谱数据，结果与Bryostatin 18的数据相一致[3]，见表1。故确定化合物1的结构为Bryostatin 18(见图2)。
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化合物1相对立体构型的确立，主要是通过对其1HNMR谱中偶合常数及ROESY谱中相关信号的仔细分析而推断的。首先，16、17位反式双键 (E式构型)是根据H-16与H-17的偶合常数(J16-17＝16.11 Hz)而确立的。在ROESY谱中，存在H-17与H-15的相关峰，证明了H-15的竖键取向。同样，H-11与H-15的相关峰也证明了H-11的竖键取向。H-5与H-7有明显的相关峰，说明两者吡喃环的同侧。H-7 (δ 5.10, dd, J = 11.97, 4.95 Hz)的取向可根据其与邻位H-6较大的偶合常数(Jaa =11.97 Hz)而定，因此，H-5也一定是竖键取向。
化合物1的1HNMR谱中，有1个双重峰(δ 4.75, d, J = 2.89 Hz)很特别。在HMQC谱中，没有与之相对应的碳原子信号，说明此氢质子不是连接在碳原子上，而可能是连接在C-19、25、9或3位上的羟基质子。将该双重峰归属于25-OH、9-OH或3-OH似乎不合理，因为缺乏与邻位质子NOE相关信号的支持。而该双重峰与23-H (δ 4.05, m)有明显NOE相关 (δ 4.75/4.05)，因此，该双重峰只能是19位上羟基质子的信号。
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13位上α，β-不饱和甲酯的构型可根据一系列ROESY相关峰确立，如图2(Fig. 2)所示。
Fig. 2 Summary of ROESY correlations observed for compound 1, tm 300 ms,CDCl3.Geminal and some vicinal correlations were omitted for clarity.
化合物2，白色无定型粉末，mp 160～164℃。UV 显示bryostatin类大环内酯化合物的特征吸收峰λmaxMeOH＝228.7nm。ESI-MS给出[M+Na+H](m/z 832)和[2M+Na+2H](m/z 1641),示相对分子质量808，结合元素分析结果，推知其分子式为C42H64O15，与化合物1相同，可能是bryostatin 10和18的立体异构体中的1个。仔细比较化合物2与Bryostatin 10[4]的1HNMR和13CNMR谱数据，结果完全一致，见表2。故确定化合物2的结构为Bryostatin 10(见图3)。
, 百拇医药
化合物3，白色无定型粉末，mp 156～159℃。UV 显示bryostatin类大环内酯化合物的特征吸收峰λmaxMeOH＝228.7nm。ESI-MS给出[M+Na+H](m/z 790)和[2M+Na+2H](m/z 1557),示分子量766，结合元素分析结果，推知其分子式为C39H58O15，与bryostatin 11相同[5、 6]。由于样品数量有限，故未测定其1HNMR和13CNMR谱，其结构暂定为bryostatin 11(见Fig.3)。
化合物4，5，6分别鉴定为bryostatin 4，5和6，已作过报道[2]。
Fig. 3 Structure of compound 2 and 3
, 百拇医药
2. 2 体外抗癌活性试验结果
采用台盼兰排染法和MTT法,测定化合物1，2，3对人红细胞白血病K562，人单核细胞白血病U937的抑制率。3个样品都表现出显著的抗癌活性，对K562的抑制率分别为2.2×103, 2.6×103, 3.4×104(mg.L-1);对U937的抑制率分别为1.8×102, 2.0×104, 5.2×104(mg.L-1)。
表1 化合物1与bryostatin 18的1HNMR和13CNMR 谱数据
Table 1.1HNMR and 13CNMR data for compound 1a and bryostatin 18b
, http://www.100md.com
1HNMR
13CNMR
Compound 1
Bryostatin 18
Compound 1
Bryostatin 18
1
172.44
172.37
2a
2.50 m
2.50 brs
, http://www.100md.com
42.21
42.73
2b
2.46 m
2.50 brs
3
4.11 m
4.04 m
68.16
69.81
9-OH
3.99 m
4a
, http://www.100md.com
2.0 (overlaped)c
1.80c
39.70
40.95
4b (α)
1.55 (overlaped)
1.70
5
4.22 brt
4.20 brt
65.69
, 百拇医药 66.70
6eq
1.70 (overlaped)
1.64
33.19
34.02
6ax
1.43 dt (11.5, 11.5)
1.45 dt (12, 12)
7
5.10 dd (4.95, 11.97)
5.07 dd (5, 12)
, 百拇医药
72.46
73.20
10a
2.08 (overlaped)
1.99
42.08
42.73
10b
1.66 (overlaped)
1.73
11
3.88 brt
, 百拇医药
3.92
71.31
73.44
12a (α)
1.72 m
2.17
44.74
44.71
12b
1.94 m
2.17
13
156.71
, 百拇医药
158.89
14eq
3.66 (overlaped)
3.57 brd (12)
36.54
37.36
14ax
1.90 (overlaped)
1.91
15
4.09 m (overlaped)
4.10
, http://www.100md.com
78.99
80.51
16
5.37 dd (8.67, 16.11)
5.31 dd (8, 16)
130.41
130.94
17
5.83 d (16.11)
5.87 d (16)
138.04
139.85
, http://www.100md.com
18
44.85
45.68
19
100.97
101.98
20a
3.67 s (overlaped)
3.79 d (12)
32.96
33.70
20b
, 百拇医药 2.05 m (overlaped)
2.10*
21
156.71
158.81
22a (β)
2.19
2.23*
44.17
43.13
22b
2.02
2.02
, 百拇医药
23
4.05
3.96
64.72
66.17
24a
1.90 m (overlaped)
1.95
36.16
36.03
24b
1.69 m
1.62 m
, 百拇医药
25
5.13 m
5.12
73.53
73.25
26
3.78 m
3.75
70.14
69.08
27
1.21 d (6.19)
1.07 d (6.7)
, http://www.100md.com
19.15
19.18
28
1.09
1.01 s
16.96
17.35
29
0.94 s
1.02 s
20.42
20.55
30
, http://www.100md.com
5.74 brs
5.76 brs
115.94
114.52
31
166.87
167.73
32
1.02 s
0.89 s
21.02
21.33
, 百拇医药 33
1.10
1.09 s
24.44
24.75
34
5.68 brs
5.73 brs
114.28
116.26
35
166.75
167.67
, 百拇医药
36
3.71 s
3.66 s
51.00
51.61
37
3.67 s
3.63 s
50.86
51.40
1HNMR
13CNMR
, 百拇医药
Compound 1
Bryostatin 18
Compound 1
Bryostatin 18
1'
178.01
178.54
2'
39.02
39.67
3'～5'
1.19 s
, 百拇医药
1.16 s
27.15
27.46
19-OH
4.75 d (2.89)
4.74 d (3)
a Recorded on a Bruker AMX-600 (600 MHz) spectrometer in CDCl3
b Recorded on a Bruker AMX-400 (400 MHz) spectrometer in Deuterioacetonitrile
c Couplings for these signals were obscured表2 化合物2与Bryostatin 10的1HNMR和13CNMR 谱数据
, http://www.100md.com
Table 1. 1HNMR and 13CNMR data for compound 2a and bryostatin 10b
1HNMR
13CNMR
Compound2
Bryostatin 10
Compound2
Bryostatin10
1
171.60
172.64
, http://www.100md.com
2a
2.43 dd (2.3, 12.4)
2.44 d (11.7)
41.13
42.05
2b
2.53 t (12)
2.54 dd (12.2, 11.7)
3
4.12 m
4.12 m
67.15
, 百拇医药
68.14
3-OH
4.03 s
4a
1.54 m
1.54 d (14.7)
38.83
39.78
4b
1.97 m
1.97 m
5
4.21 m
, 百拇医药
4.23 d (12.2)
64.58
65.64
6a
1.42 m
1.43 d
32.21
33.19
6b
1.71 m
1.71 brs
7
5.12 m
, 百拇医药
5.10ddd(11.9, 7.3, 4.4)
71.66
72.59
8
40.28
41.26
9-OH
4.81 s
100.78
101.79
10a
1.66 d (14.7)
, http://www.100md.com
1.62 brs
41.06
42.16
10b
2.08 m
2.08 m
11
3.95 m
3.89 m
70.34
71.34
12a
2.06 m
, http://www.100md.com
2.06 m
43.20
44.19
12b
2.18 m (overlaped)
2.18 d(13.2)
43.20
44.19
13
156.15
157.04
14a
, 百拇医药
1.88 m
1.88 m
35.60
36.56
14b
3.66 m (overlaped)
3.66 m
15
4.11 m
4.11 m
77.90
78.95
, 百拇医药
16
5.35 dd (8.5, 15.9)
5.36 dd (8.3, 15.6)
129.48
130.43
17
5.81 d (15.5)
5.81 d (15.6)
136.87
137.91
18
43.73
, 百拇医药
44.75
19-OH
5.04 d (2.7)
5.91 s
99.93
100.93
20a
2.16 m (overlaped)
2.14 m
38.77
39.78
20b
, http://www.100md.com
2.36 d (13.2)
2.35 d (14.2)
21
156.00
157.04
22a
1.73 m
1.76 d (11.7)
35.11
35.72
22b
3.86 br d (13.2)
, 百拇医药
3.86 m
23
3.98 m
3.98 m
63.62
64.61
1HNMR
13CNMR
Compound2
Bryostatin 10
Compound2
Bryostatin10
, 百拇医药
24a
1.70 m
1.70 m
34.74
36.12
24b
1.95 m
1.95 m
25
5.10 m
5.08 dd (14.2, 3.9)
72.79
, http://www.100md.com 73.83
26
3.74 m
3.75 m
69.18
70.23
27
1.20 d (6.2)
1.21 d (6.8)
18.63
19.68
28
1.03 s
, http://www.100md.com
1.03 s
16.05
17.06
29
0.93 s
0.94 s
20.05
21.07
30
5.67 brs
5.68 brs
113.12
114.19
, 百拇医药
31
165.97
167.01
32
1.03 s
1.03 s
19.38
20.39
33
1.08 s
1.08 s
23.45
24.45
, http://www.100md.com
34
5.69 brs
5.69 brs
114.71
115.73
35
165.78
166.81
36
3.70 s
3.71 s
50.03
51.08
, http://www.100md.com
37
3.66 s
3.67 s
49.79
50.84
1'
177.15
178.13
2'
38.04
39.05
3'-5'
1.18 s
, 百拇医药
1.19 s
26.14
27.16
a Recorded on a Bruker AMX-600 (600 MHz) spectrometer in CDCl3
b Recorded on a JEOL JNM-EX400 (400 MHz) spectrometer in CDCl3国家自然科学基金资助项目(编号29672050)
参考文献
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(收稿日期：2000-06-25), 百拇医药