兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备以及在大肠肿瘤筛检中的应用
王志红 李世荣 晨智敏
摘 要 目的：研究兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳对大肠肿瘤普查的临床意义。方法：应用致敏羧化胶乳的方法制备了兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂。用反向胶乳凝集试验检测经结肠镜检出和病理证实的269例大肠肿瘤和结肠炎患者以及161例正常人的粪微量白蛋白。结果：该试剂灵敏性高(3.125ng/ml)；检测牛、马、羊、豚鼠等动物血清呈阴性反应；用多批次免疫羧化胶乳平行检测并在有效期内重复检测已知阳性标本，其重复性良好。结论：该试剂对大肠癌的诊断敏感性76.8%，特异性80.0%，准确性77.0%。
关键词：免疫羧化胶乳 反向胶乳凝集试验 大肠肿瘤 粪微量白蛋白
1956年，Singer和Plotz首次报道以胶乳颗粒为载体吸附IgG[1]，胶乳吸附抗体检测相应抗原的方法称为反向胶乳凝集试验，对206例大肠肿瘤、63例结肠炎患者和161例正常人粪微量白蛋白进行了检测。
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1 材料与方法
1.1 兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备
1.1.1兔抗人白蛋白抗体的制备采用25%人血浆白蛋白注射液，按常规免疫新西兰纯种白兔，获得兔抗人白蛋白免疫血清(效价1:32)，经饱和硫酸铵沉淀后，过DE-52层析柱，IgG峰部洗脱液用Follin酚法于540nm处定量测定IgG蛋白含量，并用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳鉴定，仅出现一条区带。
1.1.2兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备取10%羧化聚苯乙烯胶乳悬液(军事医学科学院动物中心产品，Φ=0.6μm)，用pH8.2甘氨酸缓冲液(GBS)稀释成1%浓度，将其于兔抗人白蛋白IgG按适当比例混合，以常规物理吸附法致敏胶乳[2]。
1.2 敏感性试验
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取25%人血浆白蛋白20μl，加入生理盐水180μl，再经系列稀释成10个浓度，其浓度范围在25mg/ml～3.125ng/ml之间，用兔抗人免疫羧化胶乳做3次重复检测。
1.3 特异性试验 将牛、马、羊、豚鼠血清分别稀释至5%、2.5%和1.25%，用兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳检测。
1.4 重复性试验 用四批兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳，对5份粪微量白蛋白阳性粪便标本和2份已知浓度白蛋白溶液平行检测，并在有效期内用同一批免疫羧化胶乳先后7次重复检测，同时设阴性对照。
1.5 受试对象 选择经全结肠纤维结肠镜检查和病理证实的患者与正常人430例，其中82例大肠癌，124例大肠良性肿瘤，63例结肠炎，161例正常人。
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1.6 标本采集 在不限制饮食的条件下，嘱受试对象按试验要求将其粪便涂布在特制的粪便采集卡中，晾干后封口，4℃保存待检。
1.7 检测方法 在黑背景玻璃反应板上，滴加粪液(特制粪便采集卡内圆滤纸片2片，加200μl生理盐水浸泡)和免疫羧化胶乳各1滴，并设阳性和阴性对照，摇动反应板3分钟后观察结果，无凝集颗粒者为阴性，有凝集颗粒者为阳性。胶乳凝集程度按常规胶乳检测判定标准分为四个等级(+、++、+++、++++)。
2 结果
2.1 粪微量白蛋白检测的敏感性
检测人血浆白蛋白最低浓度为3.125ng/ml。
2.2 粪微量白蛋白检测的特异性
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与牛、马、羊、豚鼠等动物血清反应均呈阴性结果。
2.3 粪微量白蛋白检测的重复性
实验表明该试剂重复性良好。
2.4 粪微量白蛋白检测结果
见附表。大肠癌组阳性率明显高于正常人和其他各组(P<0.01)，在大肠癌以外的各组中，大肠腺瘤组和溃疡性结肠炎组阳性率高于正常人组(P<0.05)。
附表 大肠病变与正常人粪微量白蛋白检测结果
组别
例数
阳性例数
阳性率(%)
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大肠癌
82
63
76.8
大肠腺瘤
81
30
37.0
炎性息肉
43
13
30.2
溃疡性结肠炎
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15
6
40.0
慢性结直肠炎
48
14
29.2
正常人
161
31
19.3
2.5 方法学评价
粪微量白蛋白对大肠癌诊断的敏感性为76.8%，特异性为80.0%，准确性为77.0%，阳性预检值为62.0%，阴性预检值为44.1%，诊断指数为1.6。
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3 讨论
兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂对粪微量白蛋白的检测，是针对粪便中由于病变部位出血后的血浆蛋白，或组织渗出液中的白蛋白。而检测粪微量白蛋白作为大肠肿瘤的筛检手段之一，最早是在1987年，日本中山拓郎等曾用ELISA法对粪潜白蛋白(Occult Albmin)进行定量检测，并认为其敏感性优于便潜血[3]。1993年，我们制备和建立了兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂和反向胶乳凝集试验，检测了378例已知患者和正常人粪便标本[4]，其临床结果显示：56例大肠癌诊断敏感性55.4%，特异性82.6%；132例正常人阳性率17.4%。近来我们增加了已知患者数量，重新检测了161例正常人粪微量白蛋白，结果表明：在增加受检人数后，提高了大肠癌的诊断敏感性(76.8%)，而特异性则无显著差别(80.0%)；161例正常人阳性率为19.2%，比原来的132例正常人阳性率高1.8%。实验结果显示：在受检人数增多的情况下，用该试剂检测粪微量白蛋白可能会达到提高诊断敏感性，保持特异性的良好效果。
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文中161例正常人粪微量白蛋白检测阳性率19.2%，这可能是由于以下两种原因：其一是某些正常人的肠壁粘膜虽无肉眼可见的病理学改变，但实际上其粘膜组织存在退行性改变或某些腺体水肿而导致蛋白的病理性渗出，在未做组织活检的情况下，这些组织细胞学改变在结肠镜下是难以观察到的；其二是由于某些正常人个体差异的不同，在生理上存在蛋白的高分泌状态而引起白蛋白的渗出。82例大肠癌粪微量白蛋白检测阴性率为23.2%，这可能是因为某些患者的癌及癌旁组织出血程度较轻或组织渗出液较少所致。
初步研究结果提示，兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳检测人粪微量白蛋白，对大肠肿瘤普查筛检是一种无创、简便快捷、价格低廉、敏感性高、特异性较好的方法，对早期诊断大肠肿瘤具有一定的实际意义。
基金项目：本文课题受全军“八.五”攻关项目科研资金资助
作者单位：北京军区总医院消化内科(北京市 100700)
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参考文献
1 北京医学院微生物学教研组.实验免疫学.北京:人民卫生出版社,1980:350
2 上海医学化验所.临床免疫学检验(下册).上海:上海科学技术出版社,1986:59
3 Nakayama T,Yasuoka H,Kishino T,etal.ELISA for occult feacal albumin.Lancet,1987;1(8546):1368
4 王志红,李世荣,晨智敏,等.粪潜白蛋白的半定量试验在大肠癌普查中的筛检作用.中国实验临床免疫学杂志,1993;5(5):39, 百拇医药
摘 要 目的：研究兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳对大肠肿瘤普查的临床意义。方法：应用致敏羧化胶乳的方法制备了兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂。用反向胶乳凝集试验检测经结肠镜检出和病理证实的269例大肠肿瘤和结肠炎患者以及161例正常人的粪微量白蛋白。结果：该试剂灵敏性高(3.125ng/ml)；检测牛、马、羊、豚鼠等动物血清呈阴性反应；用多批次免疫羧化胶乳平行检测并在有效期内重复检测已知阳性标本，其重复性良好。结论：该试剂对大肠癌的诊断敏感性76.8%，特异性80.0%，准确性77.0%。
关键词：免疫羧化胶乳 反向胶乳凝集试验 大肠肿瘤 粪微量白蛋白
1956年，Singer和Plotz首次报道以胶乳颗粒为载体吸附IgG[1]，胶乳吸附抗体检测相应抗原的方法称为反向胶乳凝集试验，对206例大肠肿瘤、63例结肠炎患者和161例正常人粪微量白蛋白进行了检测。
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1 材料与方法
1.1 兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备
1.1.1兔抗人白蛋白抗体的制备采用25%人血浆白蛋白注射液，按常规免疫新西兰纯种白兔，获得兔抗人白蛋白免疫血清(效价1:32)，经饱和硫酸铵沉淀后，过DE-52层析柱，IgG峰部洗脱液用Follin酚法于540nm处定量测定IgG蛋白含量，并用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳鉴定，仅出现一条区带。
1.1.2兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备取10%羧化聚苯乙烯胶乳悬液(军事医学科学院动物中心产品，Φ=0.6μm)，用pH8.2甘氨酸缓冲液(GBS)稀释成1%浓度，将其于兔抗人白蛋白IgG按适当比例混合，以常规物理吸附法致敏胶乳[2]。
1.2 敏感性试验
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取25%人血浆白蛋白20μl，加入生理盐水180μl，再经系列稀释成10个浓度，其浓度范围在25mg/ml～3.125ng/ml之间，用兔抗人免疫羧化胶乳做3次重复检测。
1.3 特异性试验 将牛、马、羊、豚鼠血清分别稀释至5%、2.5%和1.25%，用兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳检测。
1.4 重复性试验 用四批兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳，对5份粪微量白蛋白阳性粪便标本和2份已知浓度白蛋白溶液平行检测，并在有效期内用同一批免疫羧化胶乳先后7次重复检测，同时设阴性对照。
1.5 受试对象 选择经全结肠纤维结肠镜检查和病理证实的患者与正常人430例，其中82例大肠癌，124例大肠良性肿瘤，63例结肠炎，161例正常人。
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1.6 标本采集 在不限制饮食的条件下，嘱受试对象按试验要求将其粪便涂布在特制的粪便采集卡中，晾干后封口，4℃保存待检。
1.7 检测方法 在黑背景玻璃反应板上，滴加粪液(特制粪便采集卡内圆滤纸片2片，加200μl生理盐水浸泡)和免疫羧化胶乳各1滴，并设阳性和阴性对照，摇动反应板3分钟后观察结果，无凝集颗粒者为阴性，有凝集颗粒者为阳性。胶乳凝集程度按常规胶乳检测判定标准分为四个等级(+、++、+++、++++)。
2 结果
2.1 粪微量白蛋白检测的敏感性
检测人血浆白蛋白最低浓度为3.125ng/ml。
2.2 粪微量白蛋白检测的特异性
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与牛、马、羊、豚鼠等动物血清反应均呈阴性结果。
2.3 粪微量白蛋白检测的重复性
实验表明该试剂重复性良好。
2.4 粪微量白蛋白检测结果
见附表。大肠癌组阳性率明显高于正常人和其他各组(P<0.01)，在大肠癌以外的各组中，大肠腺瘤组和溃疡性结肠炎组阳性率高于正常人组(P<0.05)。
附表 大肠病变与正常人粪微量白蛋白检测结果
组别
例数
阳性例数
阳性率(%)
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大肠癌
82
63
76.8
大肠腺瘤
81
30
37.0
炎性息肉
43
13
30.2
溃疡性结肠炎
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15
6
40.0
慢性结直肠炎
48
14
29.2
正常人
161
31
19.3
2.5 方法学评价
粪微量白蛋白对大肠癌诊断的敏感性为76.8%，特异性为80.0%，准确性为77.0%，阳性预检值为62.0%，阴性预检值为44.1%，诊断指数为1.6。
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3 讨论
兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂对粪微量白蛋白的检测，是针对粪便中由于病变部位出血后的血浆蛋白，或组织渗出液中的白蛋白。而检测粪微量白蛋白作为大肠肿瘤的筛检手段之一，最早是在1987年，日本中山拓郎等曾用ELISA法对粪潜白蛋白(Occult Albmin)进行定量检测，并认为其敏感性优于便潜血[3]。1993年，我们制备和建立了兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂和反向胶乳凝集试验，检测了378例已知患者和正常人粪便标本[4]，其临床结果显示：56例大肠癌诊断敏感性55.4%，特异性82.6%；132例正常人阳性率17.4%。近来我们增加了已知患者数量，重新检测了161例正常人粪微量白蛋白，结果表明：在增加受检人数后，提高了大肠癌的诊断敏感性(76.8%)，而特异性则无显著差别(80.0%)；161例正常人阳性率为19.2%，比原来的132例正常人阳性率高1.8%。实验结果显示：在受检人数增多的情况下，用该试剂检测粪微量白蛋白可能会达到提高诊断敏感性，保持特异性的良好效果。
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文中161例正常人粪微量白蛋白检测阳性率19.2%，这可能是由于以下两种原因：其一是某些正常人的肠壁粘膜虽无肉眼可见的病理学改变，但实际上其粘膜组织存在退行性改变或某些腺体水肿而导致蛋白的病理性渗出，在未做组织活检的情况下，这些组织细胞学改变在结肠镜下是难以观察到的；其二是由于某些正常人个体差异的不同，在生理上存在蛋白的高分泌状态而引起白蛋白的渗出。82例大肠癌粪微量白蛋白检测阴性率为23.2%，这可能是因为某些患者的癌及癌旁组织出血程度较轻或组织渗出液较少所致。
初步研究结果提示，兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳检测人粪微量白蛋白，对大肠肿瘤普查筛检是一种无创、简便快捷、价格低廉、敏感性高、特异性较好的方法，对早期诊断大肠肿瘤具有一定的实际意义。
基金项目：本文课题受全军“八.五”攻关项目科研资金资助
作者单位：北京军区总医院消化内科(北京市 100700)
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参考文献
1 北京医学院微生物学教研组.实验免疫学.北京:人民卫生出版社,1980:350
2 上海医学化验所.临床免疫学检验(下册).上海:上海科学技术出版社,1986:59
3 Nakayama T,Yasuoka H,Kishino T,etal.ELISA for occult feacal albumin.Lancet,1987;1(8546):1368
4 王志红,李世荣,晨智敏,等.粪潜白蛋白的半定量试验在大肠癌普查中的筛检作用.中国实验临床免疫学杂志,1993;5(5):39, 百拇医药