喉癌细胞增殖能力与放疗疗效的关系
作者：杨怀安 朴哲孝治 高坂知节
单位：杨怀安(110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院耳鼻咽喉科)；朴哲孝治(日本东北大学耳鼻咽喉科学教室)；高坂知节(日本东北大学耳鼻咽喉科学教室)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000419 早期喉癌放射治疗目前已经逐渐成为重要的治疗手段，但却有10%～35%的复发率影响着患者的喉保存率及5年生存率[1]。肿瘤细胞增殖能力是影响放疗疗效的一个重要因素，我们应用单克隆抗体MIB-1对喉癌组织进行了免疫组织化学染色，分析了喉癌细胞增殖能力与放射线治疗疗效的关系，报道如下。
一、研究对象和方法
1.病例选择：选择1985～1995年间诊断为喉鳞癌，并行单纯放射治疗无效的30例喉癌患者，按TNM及生长部位可比原则随机选择40例单纯放射治疗有效的喉癌患者。其中T1期57例，T2期12例，T3期1例。喉癌按照1987年国际抗癌联盟(UICC)喉癌分期标准分期。有效组定为5年内无复发者。无效组定为放射治疗未治愈或5年内复发者。近期有效定为放疗后3个月内肿瘤消失，近期无效定为放疗后3个月内肿瘤未消失；远期有效定为放疗后6个月内肿瘤消失，远期无效定为放疗后6个月内肿瘤未消失或5年内肿瘤复发。
, 百拇医药
2.治疗方法：采用单纯60Co γ射线治疗，吸收剂量为60～70 Gy，每天2 Gy，连续5 d后休2 d。对于放射治疗无效或复发例进一步行全喉及部分喉切除术。
3.染色方法：选择治疗前活检的经福尔马林固定，石蜡包埋的喉癌组织标本。具体操作如下：石蜡包埋癌组织切片(4 μm)在50℃温水中充分伸展后贴附在玻璃片上。在37℃恒温器上干燥24 h。脱石蜡，亲水化后在10 mmol/L的柠檬酸缓冲液中煮沸10 min，然后①用3% H2O2加50% Methanol阻断内源性过氧化物酶；②用1%正常马血清阻断非特异性蛋白；③一抗MIB-1(MBL医学生物研究所产品)，工作液稀释度为1∶20在微波仪中反应3 min；④二抗(antimouse IgG)在微波仪中反应3 min；⑤ABC复合体反应30 min；⑥DAB中发色15 min;⑦在甲基绿(Methyl green)中衬染30 min，脱水，封片。ki-67基因蛋白染色阳性者可见肿瘤细胞核呈黄褐色，染色阴性者细胞核呈淡蓝色。
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4.结果判定：随机选择10个高倍视野，数1 000个肿瘤细胞，计算阳性细胞所占比例(ki-67 positive cell fraction KPF)，当阳性肿瘤细胞占总数的76%～100%时定为；当阳性肿瘤细胞占总数的51%～75%时定为；当阳性肿瘤细胞占总数的26%～50%时定为；当阳性肿瘤细胞占总数的0%～25%时定为+。喉癌射线治疗疗效与KPF间是否相关应用χ2检验。
二、结果
ki-67基因蛋白表达在喉癌组织中从无表达到全部表达不等。喉癌放射治疗有效组与无效组间ki-67基因蛋白表达程度差异具有显著性，χ2=8.50>χ20.01，疗效与表达程度相关系数为0.71。
表1为喉癌近期远期疗效与ki-67基因蛋白表达程度的关系。喉癌近期无效远期无效组间与ki-67基因蛋白表达程度的关系，应用Mantel-Haenszel卡方检验，χ2=10.50>χ20.01，相关系数为0.543。喉癌近期有效远期有效组间与ki-67基因蛋白表达程度的关系，应用Fisher's Exact Test(2-Tail)卡方检验P<0.01，相关系数为0.503。
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表1 喉癌近期远期疗效与ki-67基因
蛋白表达程度的关系 组别
例数
+
近期有效
37
0
6
13
, 百拇医药
18
远期有效
3
3
0
0
0
近期无效
7
5
1
1
0
远期无效
, 百拇医药
23
2
4
8
9
三、讨论
ki-67基因蛋白作为增殖期细胞标志物，其生物学特征及生理意义尚不十分清楚，通常认为是修饰、控制核小体机能的蛋白质，除G0期以外的增殖期细胞均呈阳性反应[2]。MIB-1是抗ki-67 cDNA(1 002 bp)基因蛋白的单克隆抗体，与进入细胞周期(G1,S,G2,M期)的细胞反应，而与静止期G0的细胞不反应，因此应用此抗体染色，能够对增殖期细胞和非增殖期细胞进行区分和定量分析，用它分析肿瘤放射治疗疗效，则是划时代的进步[3]。
, 百拇医药
通常认为G0期细胞更能抵抗放射线照射，它的多少对肿瘤放射治疗疗效具有很大影响。本文作者用ki-67基因产物蛋白单克隆抗体对70例接受单纯放射治疗的喉癌患者进行了回顾性研究，消除了肿瘤大小、生长部位和治疗方法等因素，主要从癌增殖期细胞的组织特性探讨对疗效的影响。发现虽然都是喉鳞癌，但ki-67基因蛋白表达(KPF)在喉癌组织中从无表达到全部表达不等，差异很大，放疗有效组和放疗无效组间KPF具有明显差别，在放射治疗无效组中所占比例较低，而在放射治疗有效组中的所占比例较高，随着KPF的提高，喉癌放疗疗效明显提高，说明放射治疗疗效与增殖期细胞比例呈正相关。在放射治疗无效的病例中，近期无效和远期无效间同样具有明显差别，在近期无效组中KPF所占比例较低，而在远期无效组中的所占比例较高，随着KPF的降低，喉癌放疗局部未控比例高，复发率亦较高。在放疗近期有效组中KPF所占比例较高。说明喉癌组织中增殖期细胞所占比例多少对放射治疗疗效具有重要影响，因此可以把KPF作为判定喉癌放疗疗效的一个参考指标。
参考文献
, 百拇医药
1，朝仓光司，志藤文明，坪田 大，他.喉头癌放射线照射后再发症例レ-ザ-手术.耳鼻临床，1996，89：1249-1252.
2，Key G,Becher MHG,Duchrow M,et al.New ki-67 equivalent murine monoclonal antibodies(MIB1-3) prepared against recombinant parts of the ki-67 antigen.Anal Cell Pathol,1992,4:181-183.
3，Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of a monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation.Int J Cancer,1983,31:13-20.
(收稿日期：2000-02-21), 百拇医药
单位：杨怀安(110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院耳鼻咽喉科)；朴哲孝治(日本东北大学耳鼻咽喉科学教室)；高坂知节(日本东北大学耳鼻咽喉科学教室)
关键词：
中华放射医学与防护杂志000419 早期喉癌放射治疗目前已经逐渐成为重要的治疗手段，但却有10%～35%的复发率影响着患者的喉保存率及5年生存率[1]。肿瘤细胞增殖能力是影响放疗疗效的一个重要因素，我们应用单克隆抗体MIB-1对喉癌组织进行了免疫组织化学染色，分析了喉癌细胞增殖能力与放射线治疗疗效的关系，报道如下。
一、研究对象和方法
1.病例选择：选择1985～1995年间诊断为喉鳞癌，并行单纯放射治疗无效的30例喉癌患者，按TNM及生长部位可比原则随机选择40例单纯放射治疗有效的喉癌患者。其中T1期57例，T2期12例，T3期1例。喉癌按照1987年国际抗癌联盟(UICC)喉癌分期标准分期。有效组定为5年内无复发者。无效组定为放射治疗未治愈或5年内复发者。近期有效定为放疗后3个月内肿瘤消失，近期无效定为放疗后3个月内肿瘤未消失；远期有效定为放疗后6个月内肿瘤消失，远期无效定为放疗后6个月内肿瘤未消失或5年内肿瘤复发。
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2.治疗方法：采用单纯60Co γ射线治疗，吸收剂量为60～70 Gy，每天2 Gy，连续5 d后休2 d。对于放射治疗无效或复发例进一步行全喉及部分喉切除术。
3.染色方法：选择治疗前活检的经福尔马林固定，石蜡包埋的喉癌组织标本。具体操作如下：石蜡包埋癌组织切片(4 μm)在50℃温水中充分伸展后贴附在玻璃片上。在37℃恒温器上干燥24 h。脱石蜡，亲水化后在10 mmol/L的柠檬酸缓冲液中煮沸10 min，然后①用3% H2O2加50% Methanol阻断内源性过氧化物酶；②用1%正常马血清阻断非特异性蛋白；③一抗MIB-1(MBL医学生物研究所产品)，工作液稀释度为1∶20在微波仪中反应3 min；④二抗(antimouse IgG)在微波仪中反应3 min；⑤ABC复合体反应30 min；⑥DAB中发色15 min;⑦在甲基绿(Methyl green)中衬染30 min，脱水，封片。ki-67基因蛋白染色阳性者可见肿瘤细胞核呈黄褐色，染色阴性者细胞核呈淡蓝色。
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4.结果判定：随机选择10个高倍视野，数1 000个肿瘤细胞，计算阳性细胞所占比例(ki-67 positive cell fraction KPF)，当阳性肿瘤细胞占总数的76%～100%时定为；当阳性肿瘤细胞占总数的51%～75%时定为；当阳性肿瘤细胞占总数的26%～50%时定为；当阳性肿瘤细胞占总数的0%～25%时定为+。喉癌射线治疗疗效与KPF间是否相关应用χ2检验。
二、结果
ki-67基因蛋白表达在喉癌组织中从无表达到全部表达不等。喉癌放射治疗有效组与无效组间ki-67基因蛋白表达程度差异具有显著性，χ2=8.50>χ20.01，疗效与表达程度相关系数为0.71。
表1为喉癌近期远期疗效与ki-67基因蛋白表达程度的关系。喉癌近期无效远期无效组间与ki-67基因蛋白表达程度的关系，应用Mantel-Haenszel卡方检验，χ2=10.50>χ20.01，相关系数为0.543。喉癌近期有效远期有效组间与ki-67基因蛋白表达程度的关系，应用Fisher's Exact Test(2-Tail)卡方检验P<0.01，相关系数为0.503。
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表1 喉癌近期远期疗效与ki-67基因
蛋白表达程度的关系 组别
例数
+
近期有效
37
0
6
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18
远期有效
3
3
0
0
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近期无效
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远期无效
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三、讨论
ki-67基因蛋白作为增殖期细胞标志物，其生物学特征及生理意义尚不十分清楚，通常认为是修饰、控制核小体机能的蛋白质，除G0期以外的增殖期细胞均呈阳性反应[2]。MIB-1是抗ki-67 cDNA(1 002 bp)基因蛋白的单克隆抗体，与进入细胞周期(G1,S,G2,M期)的细胞反应，而与静止期G0的细胞不反应，因此应用此抗体染色，能够对增殖期细胞和非增殖期细胞进行区分和定量分析，用它分析肿瘤放射治疗疗效，则是划时代的进步[3]。
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通常认为G0期细胞更能抵抗放射线照射，它的多少对肿瘤放射治疗疗效具有很大影响。本文作者用ki-67基因产物蛋白单克隆抗体对70例接受单纯放射治疗的喉癌患者进行了回顾性研究，消除了肿瘤大小、生长部位和治疗方法等因素，主要从癌增殖期细胞的组织特性探讨对疗效的影响。发现虽然都是喉鳞癌，但ki-67基因蛋白表达(KPF)在喉癌组织中从无表达到全部表达不等，差异很大，放疗有效组和放疗无效组间KPF具有明显差别，在放射治疗无效组中所占比例较低，而在放射治疗有效组中的所占比例较高，随着KPF的提高，喉癌放疗疗效明显提高，说明放射治疗疗效与增殖期细胞比例呈正相关。在放射治疗无效的病例中，近期无效和远期无效间同样具有明显差别，在近期无效组中KPF所占比例较低，而在远期无效组中的所占比例较高，随着KPF的降低，喉癌放疗局部未控比例高，复发率亦较高。在放疗近期有效组中KPF所占比例较高。说明喉癌组织中增殖期细胞所占比例多少对放射治疗疗效具有重要影响，因此可以把KPF作为判定喉癌放疗疗效的一个参考指标。
参考文献
, 百拇医药
1，朝仓光司，志藤文明，坪田 大，他.喉头癌放射线照射后再发症例レ-ザ-手术.耳鼻临床，1996，89：1249-1252.
2，Key G,Becher MHG,Duchrow M,et al.New ki-67 equivalent murine monoclonal antibodies(MIB1-3) prepared against recombinant parts of the ki-67 antigen.Anal Cell Pathol,1992,4:181-183.
3，Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of a monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation.Int J Cancer,1983,31:13-20.
(收稿日期：2000-02-21), 百拇医药