备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定
作者：张媛媛 曾园山 顾熊飞 陈穗君
单位：张媛媛(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室)；曾园山(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室)；顾熊飞(生物化学教研室，广州 510089)；陈穗君(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室)
关键词：备用根模型；细胞培养；凝胶层析；高效液相色谱；神经营养活性物质
解剖学报000408 【摘要】 目的 进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液，以获得某种神经营养活性物质。 方法 用Superdex G-75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质。 结果 手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析后，得到的A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节(DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示，A峰洗脱液呈现一条分子量约为60 kD的蛋白质主带。 结论 结合生物活性检测结果，分子量约60 kD的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质。进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液，以获得某种神经营养活性物质。 方法 用Superdex G-75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质。 结果 手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析后，得到的A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节(DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示，A峰洗脱液呈现一条分子量约为60 kD的蛋白质主带。 结论 结合生物活性检测结果，分子量约60 kD的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质。
, 百拇医药
【中图分类号】 Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-322
THE ISOLATION AND BIOACTIVE ASSAY OF NEUROTROPHIC
ACTIVE SUBSTANCE DERIVED FROM SPINAL DORSAL HORN
OF SPARED ROOT RAT
ZHANG Yuan-yuan ZENG Yuan-shan CHEN Sui-jun
(Division of Neurosciences, Department of Histology and Embryology)
GU Xiong-fei
, 百拇医药
(Department of Biochemistry, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089,China)
【Abstract】 Objective The extract of spinal dorsal horn of partial deafferentation(operated side) in spared root rat was isolated and purified further to look for some neurotrophic active substance. Methods Neurotrophic active substance was isolated and analysed by Superdex G-75 prep grade gel chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) and cell culture, ect. Results Peak A eluate was obtained from the extract of spinal dorsal horn of operated side through Superdex G-75 prep grade gel chromatography and HPLC. The peak A eluate played a neurotrophic active role in promoting survival and neurite growth of dissociated neurons of chick embryonal dorsal root ganglion(DRG) in vitro. According to the analysis of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), peak A eluate presented a main protein band with a molecular weight of 60kD. Conclusion The 60kD protein may be a neurotrophic active substance of spinal dorsal horn of operated side by the result of bioactive assay.
, http://www.100md.com
【Key words】 Spared root preparation; Cell culture; Gel chromatography; High performance liquid chromatography; Neurotrophic active substance
1958年，Liu和Chambers[1]创建了备用根动物模型，即切断成年猫脊髓一侧数条背根，但保留其中的一条背根(备用根)，并观察到备用根初级传入纤维能够在脊髓后角发生侧支出芽。因此首次发现成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)在损伤后具有修复能力，从而提出了CNS具有可塑性的新概念。随后几十年，许多学者的研究都证实在成年哺乳动物部分去除传入纤维支配的脊髓内来自于背根的初级传入纤维可发生侧支出芽，并重建突触联系[2～4]。据最近的研究发现[5]，部分去传入纤维支配的脊髓后角组织含有神经营养活性物质，其分子量约在40～78 kD之间。因此推测这可能是引起初级传入纤维在脊髓后角内侧支出芽和突触重建的重要因素之一。但现在还不清楚备用根大鼠脊髓后角组织提取液40～78 kD的蛋白质组分中究竟是哪种分子量蛋白质具有神经营养活性作用?为了寻找这种物质，本实验在以上研究的基础上，利用Superdex G-75 prep grade凝胶层析以及高效液相色谱(HPLC)等蛋白质分离纯化技术，进一步分离纯化备用根大鼠背根切断侧脊髓后角组织提取液，以期获得某种神经营养活性物质，为深入探讨引起脊髓可塑性变化的分子基础提供实验依据，这将有助于了解在神经系统发育过程中某一神经通路建立所涉及的化学因子以及损伤后的修复机制。
, 百拇医药
材料和方法
1.备用根模型动物的制备
用体重为180～200 g的雄性SD大鼠100只，按前述方法进行备用根模型手术[5]，即切除左侧L1～L3、L5和L6背根和背根节(DRG)，保留L4背根(备用背根)。术后动物存活5d。
2.脊髓后角组织提取液的制备
用击毙法处死术后存活5d的备用根大鼠，以脊髓横断面中央管作为前、后角的分界线，分别切取L1～L6脊髓节段手术侧和非手术侧脊髓后角组织。每300 mg的后角组织加入2 ml 10 mmol/L PBS(pH7.0)，在高速匀浆器内匀浆，5 000 r/min，匀浆3 s；离心10 min，1 200 r/min。收集上清液，即为手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测、凝胶层析和电泳分析。
, 百拇医药
3. Superdex G-75 prep grade凝胶层析
将Superdex G-75 prep grade(Pharmasia产品)装入洁净的层析柱(70 cm×1 cm)，用洗脱液10 mmol/L PBS(pH7.0)平衡层析柱48h后，加入2 ml的备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液(样品液)，然后用10 mmol/L PBS洗脱。流速每管2 ml，15 min，4℃。分部收集各峰值处的洗脱液，经滤膜超滤浓缩后，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测、HPLC层析和电泳分析。
4. HPLC层析
将凝胶层析得到的具有生物活性的洗脱液(活性峰)，加入到HPLC仪(6000 A型，Waters Millipore公司，USA)的蛋白质PAK 200SW型柱(300mm×8mm)中，上样量为300μl。洗脱液为10 mmol/L PBS(pH7.0)，柱温18℃，洗脱液速度为0.2 ml/min。紫外检测器441的检测波长为280 nm，数据处理系统为WDL-95色谱工作站(国家色谱研究中心)。按洗脱峰收集各洗脱液，然后冷冻干燥，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测和电泳分析。
, http://www.100md.com
5.考马斯亮蓝法测定样品液的蛋白质浓度
配制5种标准浓度的牛血清白蛋白(单位：mg/L)10、20、30、40和50，以空白管调零。考马斯亮蓝G-250显色。在595nm波长下测出A值，绘制标准曲线[6]。各级样品液浓度可从标准曲线上查知。
6.脊髓后角组织提取液各级样品液的生物活性检测
6.1 制备脊髓后角组织提取液各级样品液的培养液：以各级最低蛋白质浓度的样品液为基准，将同级的样品液稀释成相同的蛋白质浓度。然后将样品液用针头滤器过滤除菌后，按照1份样品液，加入2份培养液的比例进行稀释。培养液为DMEM，其中补加1/3胎牛血清、葡萄糖1.5 g/L、NaHCO3 2.2 g/L、青霉素105 μg/L和链霉素0.1 g/L。按同样方法将10 mmol/L PBS代替上述样品液制备对照组培养液。
, http://www.100md.com
6.2 鸡胚DRG悬滴培养法检测样品液的生物活性：从胚龄9 d的鸡胚取出腰段DRG，应用悬滴培养法，用手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液的培养液分别培养鸡胚DRG。每个DRG加入培养液40μl，在37℃恒温培养箱内培养。培养48h，将盖玻片培养物(涂有胶原基质的盖玻片及附着在基质上培养的DRG)放入10%中性福尔马林溶液内，固定1h，然后用1%甲苯胺蓝溶液染色[7]。在光镜下先观察DRG神经突起生长晕的生长情况，并用目镜方格测试系统对其中的神经突起进行半定量计数[8，9]，即神经突起的分支越多而长，则与测试系统上的横、竖测试线的交叉点数就越多，反之则少。对各组所得数据均进行两样本均数t检验，求出P值。
6.3 鸡胚DRG分离细胞盖玻片培养法检测样品液生物活性：分离9 d龄鸡胚DRG细胞，制成细胞悬液，接种在涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，每片约含3×104细胞。此盖玻片放在培养皿内，每皿分别加入含凝胶柱层析洗脱液或HPLC层析洗脱液的培养液1.5 ml。置37℃ CO2培养箱培养48h，用2.5%戊二醛固定。在倒置相差显微镜下，以涂有多聚赖氨酸的边缘为起点，按“Z”字形轨迹上、下移动盖玻片，计数每组5个盖玻片上存活的神经元数目和长突起的神经元(神经突起长度大于其胞体直径者)总数。对各组所得数据均进行两样本均数t检验求P值。
, http://www.100md.com
7.SDS-PAGE和蛋白质分子量测定
将备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液和具有生物活性的凝胶柱层析洗脱液及HPLC层析洗脱液进行SDS-PAGE。电泳分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%。选择稳流15 mA电泳，电泳时间约1 h，考马斯亮蓝R-250染色。用低分子量标准蛋白质作对照，计算出各标准蛋白质的相对迁移率，绘制标准曲线。根据各级样品液蛋白质区带的迁移率便可从标准曲线上查知该样品液蛋白质区带的分子量，并且对各级样品液蛋白质区带电泳图谱进行薄层扫描分析。
结 果
1.手术和非手术侧脊髓后角提取液的生物活性检测
1.1 体外培养鸡胚DRG的生长情况：对照组的DRG在培养48 h时，其周围形成较完整的神经突起长生晕。其中施万细胞和成纤维细胞较多(图1)，仅见少量神经突起。非手术侧组培养48 h的DRG，其神经突起生长晕生长情况与对照组相似。手术侧组培养48 h的DRG，其神经突起生长晕的生长情况较好，可见许多长而有分支的神经突起(图2)，有些呈梭形的施万细胞还附着在神经突起上。
, http://www.100md.com
图1 对照组的背根节(DRG)部分神经突起生长晕，示施万细胞和成纤维细胞，培养48h，甲苯胺蓝染色 ×100
Fig.1 A part of neurite outgrowth of dorsal root ganglion(DRG) in control group;Showing Schwann cell and fibroblast, Cultured for 48h and stained with toluidine blue. ×100
图2 手术侧组的DRG部分神经突起生长晕，示神经突起，培养48h，甲苯胺蓝染色 ×100
Fig.2 A part of neurite outgrowth of DRG in operated side group; Showing neurite, cultured for 48h and stained with toluidine blue. ×100
, 百拇医药
1.2 鸡胚DRG生长晕的神经突起密度：表1显示，对照组与非手术侧组培养的DRG神经突起密度之间比较，没有显著性差异。但是手术侧组培养的DRG神经突起密度明显大于对照组和非手术侧组，表明手术侧脊髓后角组织提取液含有促进体外培养DRG神经突起生长的神经营养活性物质。
表1 脊髓后角组织提取液对鸡胚DRG神经突起
密度(
±s)的影响(培养48h)
Table 1 Effect of the extracts of spinal dorsal horn on
the neuritic density (±s) of chick
, http://www.100md.com
embryonic DRG(cultured for 48h)
对照组
control group
非手术侧组
unoperated
side group
手术侧组
operarated side
group
神经突起密度
neuritic density
, 百拇医药
116.08±15.81a
123.88±16.85b
247.54±15.71c
DRG数目
number of DRG
24
24
24
t检验(t-test):avsb P>0.05；avsc,bvsc,P<0.01
2.凝胶柱层析及其洗脱液的生物活性检测
, 百拇医药
2.1 Superdex G-75 prep grade凝胶层析的结果：具有神经营养活性的手术侧脊髓后角组织提取液经层析后，可得到2个不同的洗脱峰，即Ⅰ峰和Ⅱ峰(图3)。
图3 手术侧脊髓后角组织提取液的Superdex G-75
prep grade凝胶层析洗脱峰图
Fig.3 Elution profile of Superdex G-75 prep grade gel chroma-
tography of the extract of operated side spinal dorsal horn
2.2 洗脱液对体外培养鸡胚DRG分离细胞生长的影响：对照组的DRG分离细胞在培养48h时，仅见少数神经元长出短小的神经突起，含有Ⅱ峰洗脱液培养的DRG分离细胞(Ⅱ峰组)，在48h时神经元的生长情况与对照组的相似(图4)。然而在含有Ⅰ峰洗脱液培养的DRG分离细胞(Ⅰ峰组)，在48h时可见较多的神经元长出细长的神经突起，有些突起还形成交错的网络状(图5)。从表2可见，Ⅰ峰组神经元的存活数目，较对照组和Ⅱ峰组的多；长出神经突起的神经元数目，也比对照组和Ⅱ峰组的高。这些表明，Ⅰ峰洗脱液含有神经营养活性物质。
, 百拇医药
图4 Ⅱ峰洗脱液作用的DRG分离细胞，示神经元的神经突起(↑)(图4，5，7和8DRG分离细胞，培养48 h，倒置显微镜 ×200)
Fig.4 Dissociated DRG cells of chick embryo treated by the peak Ⅱ eluate; Showing neuronal neurite(arrows)(Fig.4,5,7 and 8 dissociated DRG cells cultured for 48h, inverted microscopy. ×200
图5 Ⅰ峰洗脱液作用的DRG分离细胞，示神经元的神经突起(↑)。
Fig.5 Dissociated DRG cells of chick embryo treated by the peak I eluate; Showing neuronal neurite(arrows).
, http://www.100md.com
3.HPLC层析及其洗脱液的生物活性检测
3.1 HPLC层析结果：具有神经营养活性的手术侧脊髓后角组织提取液Ⅰ峰洗脱液经HPLC层析后，得到4个不同的洗脱峰，即A、B、C和D峰(图6)。
3.2 HPLC层析洗脱液对体外培养鸡胚DRG分离细胞生长的影响：对照组的DRG分离细胞在培养48h时，只有少数神经元长出短小的神经突起。分别由含有B峰洗脱液(B峰组)、C峰洗脱液(C峰组)和D峰洗脱液(D峰组)培养的DRG分离细胞，在48h时神经元的生长情况与对照组的相似(图7)。含有A峰洗脱液(A峰组)培养的DRG分离细胞，在48h时能观察到较多的神经元长出细长的神经突起(图8)。表3显示，A峰组神经元的存活数目，较对照组、B峰组、C峰组和D峰组的多；长出的神经突起的神经元数目，也比对照组、B峰组、C峰组和D峰组的多。这些提示，A峰洗脱液含有神经营养活性物质。
表2 凝胶层析洗脱峰液对鸡胚DRG分离神经元存活及其神经突起生长(±s)的影响(培养48h)
, 百拇医药
Table 2 Effects of the peak eluate from gel chromatography on survival and neurite growth (±s) of
dissociated neurons of chick embryonal DRG(cultured for 48h)
对照组(control group)
Ⅰ峰组(peak Ⅰ group)
Ⅱ峰组(peak Ⅱ group)
存活的神经元数目
, 百拇医药
number of surviving neuron
204.58±15.17a
329.25±13.00b
193.33±14.80c
长突起的神经元数目
number of neuron with neurite
50.57±8.21d
96.50±8.45e
54.17±9.68f
, 百拇医药
盖片数目
number of cover-slip
12
12
12
t检验(t-test):avsc P>0.05；a vs b,b vs c P<0.01; d vs f P>0.05； d vs e, e vs f P<0.01表3 HPLC层析洗脱液对鸡胚DRG分离神经元存活及其神经突起生长(±s)的影响(培养48h)
Table 3 Effecs of the peak eluate from HPLC chromatography on survival and neurite growth (±s) of
, 百拇医药
dissociated neurons of chick embryonal DRG(cultured for 48h)
存活的神经元数目
number of surviving neuron
长突起的神经元数目
number of neuron with neurite
盖片数目
numer of cover-slip
对照组(control group)
186.00±17.42a
, 百拇医药
50.17±3.97f
12
A峰组(peak A group)
331.75±19.09b
94.58±6.49g
12
B峰组(peak B group)
196.25±17.39c
49.50±3.45h
12
, 百拇医药
C峰组(peak C group)
191.50±14.49d
47.50±6.78i
12
D峰组(peak D group)
182.50±14.55e
49.17±3.10j
12
t检验(t-test):avsc,avsd,avse,cvsd,dvse,cvse,fvsh,fvsi,fvsj,hvsi,ivsj,hvsj P>0.05;
, 百拇医药
avsb，bvsc，bvsd,bvse,fvsg,gvsh,gvsi,gvsj P<0.01
图6 Superdex G-75 prep grade 凝胶层析Ⅰ峰洗
脱液的HPLC洗脱峰图
Fig.6 Elution profile of HPLC of peak I eluate of
Superdex G-75 prep grade gel chromatography.
图7 D峰洗脱液作用的DRG分离细胞，示神经元的神经突起(↑)。
, 百拇医药
Fig.7 Dissociated DRG cells of chick embryo treated by the peak D eluate; Showing neuronal neurite(arrows).
图8 A峰洗脱液作用的DRG分离细胞，示神经元的神经突起(↑)。
Fig.8 Dissociated DRG cells of chick embryo treated by the peak A eluate; Showing neuronal neurite(arrows).
4.SDS-PAGE的结果
将具有神经营养活性作用的手术侧脊髓后角组织提取液、Superdex G-75 prep grade凝胶层析Ⅰ峰洗脱液和HPLC层析A峰洗脱液进行SDS-PAGE。结果发现，脊髓后角组织提取液约呈现8条蛋白质区带；Ⅰ峰洗脱液约呈现5条蛋白质区带，分子量在30～78 kD之间；而A峰洗脱液则呈现1条分子量约60 kD的蛋白质主带和几条微带(图9)。电泳图谱经薄层扫描分析发现，HPLC层析A峰洗脱液分子量约60 kD的蛋白质主带吸收峰面积的百分比为89%。
, 百拇医药
图9 备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液、Superdex G-75 prep grade凝胶层析Ⅰ峰洗脱液和HPLC层析A峰洗脱液的SDS-PAGE图谱，考马斯亮蓝染色。
A.低分子量标准蛋白质 B.HPLC层析A峰洗脱液 C.凝胶层析Ⅰ峰洗脱液 D.手术侧脊髓后角组织提取液
Fig.9 SDS-PAGE profile of the extract from operated side spinal dorsal horn of spared root rat, peak Ⅰ eluate from superdex G-75 prep grad chromatography and peak A eluate from HPLC Chromatography;Stained with Coomassie Brilliant blue.
A,low molecular weight standard proteins;B,peak A eluate from HPLC;C, peak I eluate from gel chromatography;D,extract from operated side spinal dorsal horn
, 百拇医药
讨 论
本研究室先前的实验结果已经显示[5]，把部分去传入纤维支配的脊髓后角组织提取液(手术侧)>10 kD组分与非手术侧的脊髓后角组织提取液>10 kD组分一起进行SDS-PAGE分析。经光密度扫描发现，两者的蛋白质区带数目和区带的迁移率大致相同，表明手术侧提取液>10 kD组分蛋白质在性质上没有发生变化，而手术侧相对迁移率为0.23的第4个吸收峰面积(第4条蛋白质区带，分子量约为60 kD)的百分比，比非手术侧相同位置的吸收峰面积的百分比大。提示手术侧该区带的蛋白质含量有增高的趋势。这种现象与周雪等[10]的观察结果有相似之处，即手术侧和非手术侧的电泳蛋白质区带数相似，但手术侧某些区带的吸收峰面积的百分比大于非手术侧。本实验在上述研究的基础上，利用Superdex G-75 prep grade凝胶层析和高效液相色谱层析技术，从部分去传入纤维支配的脊髓后角组织分离纯化出以60 kD蛋白质为主要成分的神经营养活性物质。这种物质能在体外培养中促进鸡胚DRG分离神经元的存活及其神经突起生长，表明它是一种神经营养活性物质。结合先前本研究室的实验结果[5]，我们认为，在非手术侧脊髓后角组织中也可能含有60 kD蛋白质，只因其含量极低，而不能在体外培养时对鸡胚DRG神经突起的生长起促进作用。当部分去传入纤维支配后，脊髓后角组织可能会分泌更多的60 kD蛋白质，从而增强了其神经营养活性，促进体外培养的鸡胚DRG神经突起的生长和DRG分离神经元的存活及其神经突起的生长。因此有理由推测，手术侧脊髓后角组织60 kD蛋白质的神经营养活性作用增高，是引起备用根大鼠初级传入纤维在脊髓后角内侧支出芽的重要因素之一。在进一步的研究中，如果能够将60 kD的蛋白质制备成单克隆抗体，再把它注入到备用根大鼠体内，观察其能否抑制初级传入纤维在脊髓后角内侧支出芽，就可以从另一个角度来验证60 kD蛋白质是否是促进DRG感觉神经元发出的初级传入纤维侧支出芽的重要因素。
, 百拇医药
目前，已从脑和外周组织中分离纯化出对感觉神经元具有神经营养活性作用的多种神经营养因子，如神经生长因子(nerve growth factor,NGF,140 kD)[10]、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF,12 kD)、神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3,13.6 kD)和S-100β(约10 500 kD)[11，12]等，它们可以在星形胶质细胞合成和表达[12，13]。Lindsay等[14]和Csillik等[15]的研究报道，脊髓能产生对感觉神经元生长和发育有作用的神经营养活性物质，并推测这些神经营养物质可能来源于脊髓中的靶神经元或星形胶质细胞。本实验中手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析分离后所得到的神经营养活性物质，也可能来源于脊髓的星形胶质细胞或靶神经元。这种主带分子量为60 kD的蛋白质，与已知的神经营养因子的分子量相差较大，故推测可能是尚未鉴定的神经营养物质。
, 百拇医药
本文图1，2，4，5，7，8见插图第9页
【基金项目】 广东省自然科学基金项目(970093)
【作者简介】 张媛媛(1972—)，女(汉族)，安徽人，医学硕士
参考文献
[1] Liu CN, Chambers WW， Intraspinal sprouting of dorsal root axons [J]. Arch Neurol,1958,79(6):46-61.
[2] Murray M, Goldberger ME. Replacement of synaptic terminals in lamina II and Clarke's nucleus after unilateral lumbosacral dorsal rhizotomy in adult cats[J]. J Neurosci, 1986,6(11):3205-3217.
, 百拇医药
[3] 曾园山，吴良芳.吗啡对备用根大鼠脊髓II板层突触重建的影响——电镜定量研究[J].解剖学报，1993，24(2)：191～196.
[4] Zhang B, Goldberger ME, Wu LF, et al. Plasticity of complex terminals in lamina II in partially deafferented spinal cord:the cat spared root preparation[J]. Exp Neurol,1995,132(2):186-193.
[5] 曾园山，章尧，郭畹华，等.备用根大鼠脊髓后角提取液中神经营养活性组的分离及生物活性测定[J].神经解剖学杂志，1997，13(1):46～50.
[6] Bradford HM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochem,1976,72(1-2):248-254.
, http://www.100md.com
[7] 曾园山，章尧.甲苯胺蓝染色法显示体外培养的神经突起[J].解剖学杂志，1997，20(2)：199～200.
[8] 谢富康，郭畹华.组织外植块对培养的鸡胚DRG神经突起生长的影响[J].神经解剖学杂志，1986，2(1)：63～70.
[9] Ebendal T, Tissue explants affecting extention and orientation axons in cultured chick embryo ganglion [J]. Exp Cell Res, 1977,105(12):379-387.
[10] 周雪，吴良芳，保天然，等.备用根手术对背角组织促神经突起生长活性的影响[J].四川解剖学杂志，1995，3(3)：127～132.
[11] Van Eldik LJ, Christie-pope B, Bolin LM, et al. Neurotrophic activity of S-100b in cultures of DRG from embryonic chick and fetal rat[J]. Brain Res, 1991,542(20):280-285.
, 百拇医药
[12] Isobe T, Ishioka N, Okugama T. Structural relation of two S-100 proteins in bovine brain;subunit composition of S-100a protein [J]. Eur J Biochem, 1981,115(3):469-474.
[13] Moretto G, Xu RY, Walker DG, et al. Co-expression of mRNA for neurotrophic factors in humans neurons and glial cells in culture[J]. J Neuropathol Exp Neurol,1994,53(1)：78-85
[14] Lindsay RM, Peters C. Spinal cord contains neurotrophic activity for spinal nerve sensory neurons. Late developmental appearance of a survival factor distinct from nerve growth factor[J]. Neurosci, 1984,12(1):45-51.
[15] Csillik EK, Csillik B, Oselreicher AB. Light and electron microscopic localizatuin of B-50 (GAP-43) in the rat spinal cord during transganglionic degeneration atrophy and degeneration[J]. J Neurosci Res, 1992,32(1)：93-109.
【收稿日期】 1999-09-14
【修回日期】 2000-02-03, http://www.100md.com
单位：张媛媛(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室)；曾园山(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室)；顾熊飞(生物化学教研室，广州 510089)；陈穗君(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室)
关键词：备用根模型；细胞培养；凝胶层析；高效液相色谱；神经营养活性物质
解剖学报000408 【摘要】 目的 进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液，以获得某种神经营养活性物质。 方法 用Superdex G-75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质。 结果 手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析后，得到的A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节(DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示，A峰洗脱液呈现一条分子量约为60 kD的蛋白质主带。 结论 结合生物活性检测结果，分子量约60 kD的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质。进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液，以获得某种神经营养活性物质。 方法 用Superdex G-75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质。 结果 手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析后，得到的A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节(DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示，A峰洗脱液呈现一条分子量约为60 kD的蛋白质主带。 结论 结合生物活性检测结果，分子量约60 kD的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质。
, 百拇医药
【中图分类号】 Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-322
THE ISOLATION AND BIOACTIVE ASSAY OF NEUROTROPHIC
ACTIVE SUBSTANCE DERIVED FROM SPINAL DORSAL HORN
OF SPARED ROOT RAT
ZHANG Yuan-yuan ZENG Yuan-shan CHEN Sui-jun
(Division of Neurosciences, Department of Histology and Embryology)
GU Xiong-fei
, 百拇医药
(Department of Biochemistry, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089,China)
【Abstract】 Objective The extract of spinal dorsal horn of partial deafferentation(operated side) in spared root rat was isolated and purified further to look for some neurotrophic active substance. Methods Neurotrophic active substance was isolated and analysed by Superdex G-75 prep grade gel chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) and cell culture, ect. Results Peak A eluate was obtained from the extract of spinal dorsal horn of operated side through Superdex G-75 prep grade gel chromatography and HPLC. The peak A eluate played a neurotrophic active role in promoting survival and neurite growth of dissociated neurons of chick embryonal dorsal root ganglion(DRG) in vitro. According to the analysis of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), peak A eluate presented a main protein band with a molecular weight of 60kD. Conclusion The 60kD protein may be a neurotrophic active substance of spinal dorsal horn of operated side by the result of bioactive assay.
, http://www.100md.com
【Key words】 Spared root preparation; Cell culture; Gel chromatography; High performance liquid chromatography; Neurotrophic active substance
1958年，Liu和Chambers[1]创建了备用根动物模型，即切断成年猫脊髓一侧数条背根，但保留其中的一条背根(备用根)，并观察到备用根初级传入纤维能够在脊髓后角发生侧支出芽。因此首次发现成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)在损伤后具有修复能力，从而提出了CNS具有可塑性的新概念。随后几十年，许多学者的研究都证实在成年哺乳动物部分去除传入纤维支配的脊髓内来自于背根的初级传入纤维可发生侧支出芽，并重建突触联系[2～4]。据最近的研究发现[5]，部分去传入纤维支配的脊髓后角组织含有神经营养活性物质，其分子量约在40～78 kD之间。因此推测这可能是引起初级传入纤维在脊髓后角内侧支出芽和突触重建的重要因素之一。但现在还不清楚备用根大鼠脊髓后角组织提取液40～78 kD的蛋白质组分中究竟是哪种分子量蛋白质具有神经营养活性作用?为了寻找这种物质，本实验在以上研究的基础上，利用Superdex G-75 prep grade凝胶层析以及高效液相色谱(HPLC)等蛋白质分离纯化技术，进一步分离纯化备用根大鼠背根切断侧脊髓后角组织提取液，以期获得某种神经营养活性物质，为深入探讨引起脊髓可塑性变化的分子基础提供实验依据，这将有助于了解在神经系统发育过程中某一神经通路建立所涉及的化学因子以及损伤后的修复机制。
, 百拇医药
材料和方法
1.备用根模型动物的制备
用体重为180～200 g的雄性SD大鼠100只，按前述方法进行备用根模型手术[5]，即切除左侧L1～L3、L5和L6背根和背根节(DRG)，保留L4背根(备用背根)。术后动物存活5d。
2.脊髓后角组织提取液的制备
用击毙法处死术后存活5d的备用根大鼠，以脊髓横断面中央管作为前、后角的分界线，分别切取L1～L6脊髓节段手术侧和非手术侧脊髓后角组织。每300 mg的后角组织加入2 ml 10 mmol/L PBS(pH7.0)，在高速匀浆器内匀浆，5 000 r/min，匀浆3 s；离心10 min，1 200 r/min。收集上清液，即为手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测、凝胶层析和电泳分析。
, 百拇医药
3. Superdex G-75 prep grade凝胶层析
将Superdex G-75 prep grade(Pharmasia产品)装入洁净的层析柱(70 cm×1 cm)，用洗脱液10 mmol/L PBS(pH7.0)平衡层析柱48h后，加入2 ml的备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液(样品液)，然后用10 mmol/L PBS洗脱。流速每管2 ml，15 min，4℃。分部收集各峰值处的洗脱液，经滤膜超滤浓缩后，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测、HPLC层析和电泳分析。
4. HPLC层析
将凝胶层析得到的具有生物活性的洗脱液(活性峰)，加入到HPLC仪(6000 A型，Waters Millipore公司，USA)的蛋白质PAK 200SW型柱(300mm×8mm)中，上样量为300μl。洗脱液为10 mmol/L PBS(pH7.0)，柱温18℃，洗脱液速度为0.2 ml/min。紫外检测器441的检测波长为280 nm，数据处理系统为WDL-95色谱工作站(国家色谱研究中心)。按洗脱峰收集各洗脱液，然后冷冻干燥，用于蛋白质浓度测定、生物活性检测和电泳分析。
, http://www.100md.com
5.考马斯亮蓝法测定样品液的蛋白质浓度
配制5种标准浓度的牛血清白蛋白(单位：mg/L)10、20、30、40和50，以空白管调零。考马斯亮蓝G-250显色。在595nm波长下测出A值，绘制标准曲线[6]。各级样品液浓度可从标准曲线上查知。
6.脊髓后角组织提取液各级样品液的生物活性检测
6.1 制备脊髓后角组织提取液各级样品液的培养液：以各级最低蛋白质浓度的样品液为基准，将同级的样品液稀释成相同的蛋白质浓度。然后将样品液用针头滤器过滤除菌后，按照1份样品液，加入2份培养液的比例进行稀释。培养液为DMEM，其中补加1/3胎牛血清、葡萄糖1.5 g/L、NaHCO3 2.2 g/L、青霉素105 μg/L和链霉素0.1 g/L。按同样方法将10 mmol/L PBS代替上述样品液制备对照组培养液。
, http://www.100md.com
6.2 鸡胚DRG悬滴培养法检测样品液的生物活性：从胚龄9 d的鸡胚取出腰段DRG，应用悬滴培养法，用手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液的培养液分别培养鸡胚DRG。每个DRG加入培养液40μl，在37℃恒温培养箱内培养。培养48h，将盖玻片培养物(涂有胶原基质的盖玻片及附着在基质上培养的DRG)放入10%中性福尔马林溶液内，固定1h，然后用1%甲苯胺蓝溶液染色[7]。在光镜下先观察DRG神经突起生长晕的生长情况，并用目镜方格测试系统对其中的神经突起进行半定量计数[8，9]，即神经突起的分支越多而长，则与测试系统上的横、竖测试线的交叉点数就越多，反之则少。对各组所得数据均进行两样本均数t检验，求出P值。
6.3 鸡胚DRG分离细胞盖玻片培养法检测样品液生物活性：分离9 d龄鸡胚DRG细胞，制成细胞悬液，接种在涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，每片约含3×104细胞。此盖玻片放在培养皿内，每皿分别加入含凝胶柱层析洗脱液或HPLC层析洗脱液的培养液1.5 ml。置37℃ CO2培养箱培养48h，用2.5%戊二醛固定。在倒置相差显微镜下，以涂有多聚赖氨酸的边缘为起点，按“Z”字形轨迹上、下移动盖玻片，计数每组5个盖玻片上存活的神经元数目和长突起的神经元(神经突起长度大于其胞体直径者)总数。对各组所得数据均进行两样本均数t检验求P值。
, http://www.100md.com
7.SDS-PAGE和蛋白质分子量测定
将备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液和具有生物活性的凝胶柱层析洗脱液及HPLC层析洗脱液进行SDS-PAGE。电泳分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%。选择稳流15 mA电泳，电泳时间约1 h，考马斯亮蓝R-250染色。用低分子量标准蛋白质作对照，计算出各标准蛋白质的相对迁移率，绘制标准曲线。根据各级样品液蛋白质区带的迁移率便可从标准曲线上查知该样品液蛋白质区带的分子量，并且对各级样品液蛋白质区带电泳图谱进行薄层扫描分析。
结 果
1.手术和非手术侧脊髓后角提取液的生物活性检测
1.1 体外培养鸡胚DRG的生长情况：对照组的DRG在培养48 h时，其周围形成较完整的神经突起长生晕。其中施万细胞和成纤维细胞较多(图1)，仅见少量神经突起。非手术侧组培养48 h的DRG，其神经突起生长晕生长情况与对照组相似。手术侧组培养48 h的DRG，其神经突起生长晕的生长情况较好，可见许多长而有分支的神经突起(图2)，有些呈梭形的施万细胞还附着在神经突起上。
, http://www.100md.com
图1 对照组的背根节(DRG)部分神经突起生长晕，示施万细胞和成纤维细胞，培养48h，甲苯胺蓝染色 ×100
Fig.1 A part of neurite outgrowth of dorsal root ganglion(DRG) in control group;Showing Schwann cell and fibroblast, Cultured for 48h and stained with toluidine blue. ×100
图2 手术侧组的DRG部分神经突起生长晕，示神经突起，培养48h，甲苯胺蓝染色 ×100
Fig.2 A part of neurite outgrowth of DRG in operated side group; Showing neurite, cultured for 48h and stained with toluidine blue. ×100
, 百拇医药
1.2 鸡胚DRG生长晕的神经突起密度：表1显示，对照组与非手术侧组培养的DRG神经突起密度之间比较，没有显著性差异。但是手术侧组培养的DRG神经突起密度明显大于对照组和非手术侧组，表明手术侧脊髓后角组织提取液含有促进体外培养DRG神经突起生长的神经营养活性物质。
表1 脊髓后角组织提取液对鸡胚DRG神经突起
密度(
±s)的影响(培养48h)Table 1 Effect of the extracts of spinal dorsal horn on
the neuritic density (
±s) of chick, http://www.100md.com
embryonic DRG(cultured for 48h)
对照组
control group
非手术侧组
unoperated
side group
手术侧组
operarated side
group
神经突起密度
neuritic density
, 百拇医药
116.08±15.81a
123.88±16.85b
247.54±15.71c
DRG数目
number of DRG
24
24
24
t检验(t-test):avsb P>0.05；avsc,bvsc,P<0.01
2.凝胶柱层析及其洗脱液的生物活性检测
, 百拇医药
2.1 Superdex G-75 prep grade凝胶层析的结果：具有神经营养活性的手术侧脊髓后角组织提取液经层析后，可得到2个不同的洗脱峰，即Ⅰ峰和Ⅱ峰(图3)。
图3 手术侧脊髓后角组织提取液的Superdex G-75
prep grade凝胶层析洗脱峰图
Fig.3 Elution profile of Superdex G-75 prep grade gel chroma-
tography of the extract of operated side spinal dorsal horn
2.2 洗脱液对体外培养鸡胚DRG分离细胞生长的影响：对照组的DRG分离细胞在培养48h时，仅见少数神经元长出短小的神经突起，含有Ⅱ峰洗脱液培养的DRG分离细胞(Ⅱ峰组)，在48h时神经元的生长情况与对照组的相似(图4)。然而在含有Ⅰ峰洗脱液培养的DRG分离细胞(Ⅰ峰组)，在48h时可见较多的神经元长出细长的神经突起，有些突起还形成交错的网络状(图5)。从表2可见，Ⅰ峰组神经元的存活数目，较对照组和Ⅱ峰组的多；长出神经突起的神经元数目，也比对照组和Ⅱ峰组的高。这些表明，Ⅰ峰洗脱液含有神经营养活性物质。
, 百拇医药
图4 Ⅱ峰洗脱液作用的DRG分离细胞，示神经元的神经突起(↑)(图4，5，7和8DRG分离细胞，培养48 h，倒置显微镜 ×200)
Fig.4 Dissociated DRG cells of chick embryo treated by the peak Ⅱ eluate; Showing neuronal neurite(arrows)(Fig.4,5,7 and 8 dissociated DRG cells cultured for 48h, inverted microscopy. ×200
图5 Ⅰ峰洗脱液作用的DRG分离细胞，示神经元的神经突起(↑)。
Fig.5 Dissociated DRG cells of chick embryo treated by the peak I eluate; Showing neuronal neurite(arrows).
, http://www.100md.com
3.HPLC层析及其洗脱液的生物活性检测
3.1 HPLC层析结果：具有神经营养活性的手术侧脊髓后角组织提取液Ⅰ峰洗脱液经HPLC层析后，得到4个不同的洗脱峰，即A、B、C和D峰(图6)。
3.2 HPLC层析洗脱液对体外培养鸡胚DRG分离细胞生长的影响：对照组的DRG分离细胞在培养48h时，只有少数神经元长出短小的神经突起。分别由含有B峰洗脱液(B峰组)、C峰洗脱液(C峰组)和D峰洗脱液(D峰组)培养的DRG分离细胞，在48h时神经元的生长情况与对照组的相似(图7)。含有A峰洗脱液(A峰组)培养的DRG分离细胞，在48h时能观察到较多的神经元长出细长的神经突起(图8)。表3显示，A峰组神经元的存活数目，较对照组、B峰组、C峰组和D峰组的多；长出的神经突起的神经元数目，也比对照组、B峰组、C峰组和D峰组的多。这些提示，A峰洗脱液含有神经营养活性物质。
表2 凝胶层析洗脱峰液对鸡胚DRG分离神经元存活及其神经突起生长(
±s)的影响(培养48h), 百拇医药
Table 2 Effects of the peak eluate from gel chromatography on survival and neurite growth (
±s) ofdissociated neurons of chick embryonal DRG(cultured for 48h)
对照组(control group)
Ⅰ峰组(peak Ⅰ group)
Ⅱ峰组(peak Ⅱ group)
存活的神经元数目
, 百拇医药
number of surviving neuron
204.58±15.17a
329.25±13.00b
193.33±14.80c
长突起的神经元数目
number of neuron with neurite
50.57±8.21d
96.50±8.45e
54.17±9.68f
, 百拇医药
盖片数目
number of cover-slip
12
12
12
t检验(t-test):avsc P>0.05；a vs b,b vs c P<0.01; d vs f P>0.05； d vs e, e vs f P<0.01表3 HPLC层析洗脱液对鸡胚DRG分离神经元存活及其神经突起生长(
±s)的影响(培养48h)Table 3 Effecs of the peak eluate from HPLC chromatography on survival and neurite growth (
±s) of, 百拇医药
dissociated neurons of chick embryonal DRG(cultured for 48h)
存活的神经元数目
number of surviving neuron
长突起的神经元数目
number of neuron with neurite
盖片数目
numer of cover-slip
对照组(control group)
186.00±17.42a
, 百拇医药
50.17±3.97f
12
A峰组(peak A group)
331.75±19.09b
94.58±6.49g
12
B峰组(peak B group)
196.25±17.39c
49.50±3.45h
12
, 百拇医药
C峰组(peak C group)
191.50±14.49d
47.50±6.78i
12
D峰组(peak D group)
182.50±14.55e
49.17±3.10j
12
t检验(t-test):avsc,avsd,avse,cvsd,dvse,cvse,fvsh,fvsi,fvsj,hvsi,ivsj,hvsj P>0.05;
, 百拇医药
avsb，bvsc，bvsd,bvse,fvsg,gvsh,gvsi,gvsj P<0.01
图6 Superdex G-75 prep grade 凝胶层析Ⅰ峰洗
脱液的HPLC洗脱峰图
Fig.6 Elution profile of HPLC of peak I eluate of
Superdex G-75 prep grade gel chromatography.
图7 D峰洗脱液作用的DRG分离细胞，示神经元的神经突起(↑)。
, 百拇医药
Fig.7 Dissociated DRG cells of chick embryo treated by the peak D eluate; Showing neuronal neurite(arrows).
图8 A峰洗脱液作用的DRG分离细胞，示神经元的神经突起(↑)。
Fig.8 Dissociated DRG cells of chick embryo treated by the peak A eluate; Showing neuronal neurite(arrows).
4.SDS-PAGE的结果
将具有神经营养活性作用的手术侧脊髓后角组织提取液、Superdex G-75 prep grade凝胶层析Ⅰ峰洗脱液和HPLC层析A峰洗脱液进行SDS-PAGE。结果发现，脊髓后角组织提取液约呈现8条蛋白质区带；Ⅰ峰洗脱液约呈现5条蛋白质区带，分子量在30～78 kD之间；而A峰洗脱液则呈现1条分子量约60 kD的蛋白质主带和几条微带(图9)。电泳图谱经薄层扫描分析发现，HPLC层析A峰洗脱液分子量约60 kD的蛋白质主带吸收峰面积的百分比为89%。
, 百拇医药
图9 备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液、Superdex G-75 prep grade凝胶层析Ⅰ峰洗脱液和HPLC层析A峰洗脱液的SDS-PAGE图谱，考马斯亮蓝染色。
A.低分子量标准蛋白质 B.HPLC层析A峰洗脱液 C.凝胶层析Ⅰ峰洗脱液 D.手术侧脊髓后角组织提取液
Fig.9 SDS-PAGE profile of the extract from operated side spinal dorsal horn of spared root rat, peak Ⅰ eluate from superdex G-75 prep grad chromatography and peak A eluate from HPLC Chromatography;Stained with Coomassie Brilliant blue.
A,low molecular weight standard proteins;B,peak A eluate from HPLC;C, peak I eluate from gel chromatography;D,extract from operated side spinal dorsal horn
, 百拇医药
讨 论
本研究室先前的实验结果已经显示[5]，把部分去传入纤维支配的脊髓后角组织提取液(手术侧)>10 kD组分与非手术侧的脊髓后角组织提取液>10 kD组分一起进行SDS-PAGE分析。经光密度扫描发现，两者的蛋白质区带数目和区带的迁移率大致相同，表明手术侧提取液>10 kD组分蛋白质在性质上没有发生变化，而手术侧相对迁移率为0.23的第4个吸收峰面积(第4条蛋白质区带，分子量约为60 kD)的百分比，比非手术侧相同位置的吸收峰面积的百分比大。提示手术侧该区带的蛋白质含量有增高的趋势。这种现象与周雪等[10]的观察结果有相似之处，即手术侧和非手术侧的电泳蛋白质区带数相似，但手术侧某些区带的吸收峰面积的百分比大于非手术侧。本实验在上述研究的基础上，利用Superdex G-75 prep grade凝胶层析和高效液相色谱层析技术，从部分去传入纤维支配的脊髓后角组织分离纯化出以60 kD蛋白质为主要成分的神经营养活性物质。这种物质能在体外培养中促进鸡胚DRG分离神经元的存活及其神经突起生长，表明它是一种神经营养活性物质。结合先前本研究室的实验结果[5]，我们认为，在非手术侧脊髓后角组织中也可能含有60 kD蛋白质，只因其含量极低，而不能在体外培养时对鸡胚DRG神经突起的生长起促进作用。当部分去传入纤维支配后，脊髓后角组织可能会分泌更多的60 kD蛋白质，从而增强了其神经营养活性，促进体外培养的鸡胚DRG神经突起的生长和DRG分离神经元的存活及其神经突起的生长。因此有理由推测，手术侧脊髓后角组织60 kD蛋白质的神经营养活性作用增高，是引起备用根大鼠初级传入纤维在脊髓后角内侧支出芽的重要因素之一。在进一步的研究中，如果能够将60 kD的蛋白质制备成单克隆抗体，再把它注入到备用根大鼠体内，观察其能否抑制初级传入纤维在脊髓后角内侧支出芽，就可以从另一个角度来验证60 kD蛋白质是否是促进DRG感觉神经元发出的初级传入纤维侧支出芽的重要因素。
, 百拇医药
目前，已从脑和外周组织中分离纯化出对感觉神经元具有神经营养活性作用的多种神经营养因子，如神经生长因子(nerve growth factor,NGF,140 kD)[10]、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF,12 kD)、神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3,13.6 kD)和S-100β(约10 500 kD)[11，12]等，它们可以在星形胶质细胞合成和表达[12，13]。Lindsay等[14]和Csillik等[15]的研究报道，脊髓能产生对感觉神经元生长和发育有作用的神经营养活性物质，并推测这些神经营养物质可能来源于脊髓中的靶神经元或星形胶质细胞。本实验中手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析分离后所得到的神经营养活性物质，也可能来源于脊髓的星形胶质细胞或靶神经元。这种主带分子量为60 kD的蛋白质，与已知的神经营养因子的分子量相差较大，故推测可能是尚未鉴定的神经营养物质。
, 百拇医药
本文图1，2，4，5，7，8见插图第9页
【基金项目】 广东省自然科学基金项目(970093)
【作者简介】 张媛媛(1972—)，女(汉族)，安徽人，医学硕士
参考文献
[1] Liu CN, Chambers WW， Intraspinal sprouting of dorsal root axons [J]. Arch Neurol,1958,79(6):46-61.
[2] Murray M, Goldberger ME. Replacement of synaptic terminals in lamina II and Clarke's nucleus after unilateral lumbosacral dorsal rhizotomy in adult cats[J]. J Neurosci, 1986,6(11):3205-3217.
, 百拇医药
[3] 曾园山，吴良芳.吗啡对备用根大鼠脊髓II板层突触重建的影响——电镜定量研究[J].解剖学报，1993，24(2)：191～196.
[4] Zhang B, Goldberger ME, Wu LF, et al. Plasticity of complex terminals in lamina II in partially deafferented spinal cord:the cat spared root preparation[J]. Exp Neurol,1995,132(2):186-193.
[5] 曾园山，章尧，郭畹华，等.备用根大鼠脊髓后角提取液中神经营养活性组的分离及生物活性测定[J].神经解剖学杂志，1997，13(1):46～50.
[6] Bradford HM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochem,1976,72(1-2):248-254.
, http://www.100md.com
[7] 曾园山，章尧.甲苯胺蓝染色法显示体外培养的神经突起[J].解剖学杂志，1997，20(2)：199～200.
[8] 谢富康，郭畹华.组织外植块对培养的鸡胚DRG神经突起生长的影响[J].神经解剖学杂志，1986，2(1)：63～70.
[9] Ebendal T, Tissue explants affecting extention and orientation axons in cultured chick embryo ganglion [J]. Exp Cell Res, 1977,105(12):379-387.
[10] 周雪，吴良芳，保天然，等.备用根手术对背角组织促神经突起生长活性的影响[J].四川解剖学杂志，1995，3(3)：127～132.
[11] Van Eldik LJ, Christie-pope B, Bolin LM, et al. Neurotrophic activity of S-100b in cultures of DRG from embryonic chick and fetal rat[J]. Brain Res, 1991,542(20):280-285.
, 百拇医药
[12] Isobe T, Ishioka N, Okugama T. Structural relation of two S-100 proteins in bovine brain;subunit composition of S-100a protein [J]. Eur J Biochem, 1981,115(3):469-474.
[13] Moretto G, Xu RY, Walker DG, et al. Co-expression of mRNA for neurotrophic factors in humans neurons and glial cells in culture[J]. J Neuropathol Exp Neurol,1994,53(1)：78-85
[14] Lindsay RM, Peters C. Spinal cord contains neurotrophic activity for spinal nerve sensory neurons. Late developmental appearance of a survival factor distinct from nerve growth factor[J]. Neurosci, 1984,12(1):45-51.
[15] Csillik EK, Csillik B, Oselreicher AB. Light and electron microscopic localizatuin of B-50 (GAP-43) in the rat spinal cord during transganglionic degeneration atrophy and degeneration[J]. J Neurosci Res, 1992,32(1)：93-109.
【收稿日期】 1999-09-14
【修回日期】 2000-02-03, http://www.100md.com