光线性角化病皮损细胞的P21ras蛋白定量及DNA倍体分析
作者：李玉平 廖海鹰 石凤梧 刘强 孙修蓉
单位：050000石家庄，河北医科大学第二医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志000429
ras癌基因编码的P21ras蛋白是参与细胞浆膜内面刺激细胞生长信号传递的主要物质，当 ras癌基因发生突变时可导致基因活化，使基因产物P21ras蛋白呈现过度表达[1]。我们应用 流式细胞免疫荧光技术对光线性角化病(actinic keratosis,AK)皮损细胞的P21ras蛋白相对含 量进行了定量分析,以探讨P21ras蛋白与该病的联系。
一、材料和方法
, http://www.100md.com
(一)标本来源：采用1972～1995年我院保存的石蜡包埋组织块，AK27份、正常皮肤4份 、高分化皮肤鳞癌8份，并把8份符合下列条件的AK归为异型增生较重的AK，①表皮层次 及细胞极性有较严重的紊乱,②异形细胞不仅限于基底层，但尚无原位癌的特点。
(二)试剂与方法：
1.本研究所用的流式细胞仪为美国生产的FACS420型流式细胞仪。
2.细胞DNA倍体检测样本的制备及检测方法参见文献[2]。
3.细胞P21ras蛋白检测样本的制备及检测方法参见文献[3]，本研究采用间接免疫荧光法， 一抗为1∶400倍稀释的鼠抗人ras基因产物单克隆抗体(panrasCloneF132-62OncogeneScience, Inc.USA),二抗采用1∶20倍稀释的羊抗鼠FITC-IgG抗体(军事医学科学院微生物研究所生产 )。
, 百拇医药
4.测定资料的分析：根据DNA指数(DI值)来判断DNA倍体，DI值=样品细胞的G0/G1期峰均道 值/正常组织细胞的G0/G1期峰均道值，DI值=1.0±2CV为2倍体，DI值≠1.0±2CV为异倍体。 CV为仪器的变异系数，一般调整为5.0%之内。按照Morkve[4]等提出的方法分析P21ras蛋白含量，以荧光指数(FI值)表示P21ras蛋白 的相对含量，FI值=(肿瘤细胞的ras基因表达的平均荧光强度-对照样品ras基因表达的平均 荧光强度)/正常皮肤组织细胞的ras基因表达的平均荧光强度。
表1 各组样品的P21ras蛋白和对含量
组别
例数
, 百拇医药
P21ras蛋白相对含量FI值
t值
P值
范围
±s
正常人皮肤
4
0.909-1.107
0.997±0.087
1.59
>0.05
光线性名化病
, 百拇医药
27
0.833-1.543
1.180±0.221
异形增生程度较轻
19
0.833-1.360
1.124±0.165
2.16
<0.05
异形增生程度较重
8
0.970-1.543
, 百拇医药
1.248±0.192
高分化鳞状细胞癌
8
0.137-1.980
1.458±0.246
二、结果
各组样品的P21ras蛋白相对含量结果见表1。正常皮肤无DNA异倍体，光线性角化病有3例 DNA异倍体(3/27)，其DI值分别是1.115、1.115、1.114，与其对应的P21ras蛋白FI值分别是 1.543、1.117、0.970。高分化皮肤鳞癌有5例DNA异倍体(5/8)，其DI值分别是1.780、1.338、 1.221、1.154、1.127，与其对应的P21ras蛋白FI值分别是1.360、1.432、1.131、1.980、1.300。
, 百拇医药
三、讨论
P21ras蛋白是ras癌基因家族(H-rasK-rasN-ras)编码的蛋白质，在肿瘤细胞中因其ras基因 的点突变基因激活，导致P21ras蛋白过量表达，P21ras蛋白持续激活靶分子并向细胞传递 生长信号，使细胞持续增殖，最终导致细胞恶变[1]。另外，研究发现光暴露部位的AK及 SCC存在ras基因的点突变,并认为紫外线照射与皮损中的ras基因激活有关，AK细胞的恶性 转化与ras基因激活有关[5]。
本研究结果表明，27例光线性角化病皮损细胞的P21ras蛋白含量与正常皮肤组织细胞比较 差异无显著性，但前者的P21ras蛋白含量存在着增高的倾向。8例异形增生较重的光线性 角化病皮损细胞的P21ras蛋白含量高于另外19例光线性角化病皮损细胞及正常皮肤组织细 胞的P21ras蛋白含量，差异均具显著性，这表明P21ras蛋白含量可随光线性角化病皮损细 胞异形增生程度的加重而增高。另外，皮肤高分化鳞癌及光线性角化病皮损细胞的 P21ras蛋白含量的最高值病例(1.980及1.543)均是DNA异倍体细胞。上述这些变化均提示 P21ras蛋白与光线性角化病皮损细胞异形增生及细胞的恶性转化有关。
, http://www.100md.com
参考文献
[1]张继强，范顺才，刘华福.Ras癌基因产物P21在乳腺良、恶性病变中的表达.中华病理学
杂志,1994,23:302-303.
[2]李玉平，廖海鹰，孙修蓉，等.光线性角化病皮损细胞的DNA含量流式细胞分析.中华皮
肤科杂志,1997,30:246-247.
[3]四荣联，李玉平，姚春华，等.皮脂腺癌及汗腺癌细胞Bcl-2蛋白的定量分析.中华皮肤
科杂志,1997,30:258-259.
[4]Morkve O, Laerum OD. Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin-embedded tissue from bronchial carcinomas. Cytometry, 1991,12:438- 444.
[5]Spencer JM, Kahn SM, Jiang W, et al. Activated ras genes occur in human actinic keratoses, premalignant precursors to squamous cell carcinomas. Arch Dermatol, 1995,131:796- 800.
(收稿日期：1999-07-22), http://www.100md.com
单位：050000石家庄，河北医科大学第二医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志000429
ras癌基因编码的P21ras蛋白是参与细胞浆膜内面刺激细胞生长信号传递的主要物质，当 ras癌基因发生突变时可导致基因活化，使基因产物P21ras蛋白呈现过度表达[1]。我们应用 流式细胞免疫荧光技术对光线性角化病(actinic keratosis,AK)皮损细胞的P21ras蛋白相对含 量进行了定量分析,以探讨P21ras蛋白与该病的联系。
一、材料和方法
, http://www.100md.com
(一)标本来源：采用1972～1995年我院保存的石蜡包埋组织块，AK27份、正常皮肤4份 、高分化皮肤鳞癌8份，并把8份符合下列条件的AK归为异型增生较重的AK，①表皮层次 及细胞极性有较严重的紊乱,②异形细胞不仅限于基底层，但尚无原位癌的特点。
(二)试剂与方法：
1.本研究所用的流式细胞仪为美国生产的FACS420型流式细胞仪。
2.细胞DNA倍体检测样本的制备及检测方法参见文献[2]。
3.细胞P21ras蛋白检测样本的制备及检测方法参见文献[3]，本研究采用间接免疫荧光法， 一抗为1∶400倍稀释的鼠抗人ras基因产物单克隆抗体(panrasCloneF132-62OncogeneScience, Inc.USA),二抗采用1∶20倍稀释的羊抗鼠FITC-IgG抗体(军事医学科学院微生物研究所生产 )。
, 百拇医药
4.测定资料的分析：根据DNA指数(DI值)来判断DNA倍体，DI值=样品细胞的G0/G1期峰均道 值/正常组织细胞的G0/G1期峰均道值，DI值=1.0±2CV为2倍体，DI值≠1.0±2CV为异倍体。 CV为仪器的变异系数，一般调整为5.0%之内。按照Morkve[4]等提出的方法分析P21ras蛋白含量，以荧光指数(FI值)表示P21ras蛋白 的相对含量，FI值=(肿瘤细胞的ras基因表达的平均荧光强度-对照样品ras基因表达的平均 荧光强度)/正常皮肤组织细胞的ras基因表达的平均荧光强度。
表1 各组样品的P21ras蛋白和对含量
组别
例数
, 百拇医药
P21ras蛋白相对含量FI值
t值
P值
范围
±s
正常人皮肤
4
0.909-1.107
0.997±0.087
1.59
>0.05
光线性名化病
, 百拇医药
27
0.833-1.543
1.180±0.221
异形增生程度较轻
19
0.833-1.360
1.124±0.165
2.16
<0.05
异形增生程度较重
8
0.970-1.543
, 百拇医药
1.248±0.192
高分化鳞状细胞癌
8
0.137-1.980
1.458±0.246
二、结果
各组样品的P21ras蛋白相对含量结果见表1。正常皮肤无DNA异倍体，光线性角化病有3例 DNA异倍体(3/27)，其DI值分别是1.115、1.115、1.114，与其对应的P21ras蛋白FI值分别是 1.543、1.117、0.970。高分化皮肤鳞癌有5例DNA异倍体(5/8)，其DI值分别是1.780、1.338、 1.221、1.154、1.127，与其对应的P21ras蛋白FI值分别是1.360、1.432、1.131、1.980、1.300。
, 百拇医药
三、讨论
P21ras蛋白是ras癌基因家族(H-rasK-rasN-ras)编码的蛋白质，在肿瘤细胞中因其ras基因 的点突变基因激活，导致P21ras蛋白过量表达，P21ras蛋白持续激活靶分子并向细胞传递 生长信号，使细胞持续增殖，最终导致细胞恶变[1]。另外，研究发现光暴露部位的AK及 SCC存在ras基因的点突变,并认为紫外线照射与皮损中的ras基因激活有关，AK细胞的恶性 转化与ras基因激活有关[5]。
本研究结果表明，27例光线性角化病皮损细胞的P21ras蛋白含量与正常皮肤组织细胞比较 差异无显著性，但前者的P21ras蛋白含量存在着增高的倾向。8例异形增生较重的光线性 角化病皮损细胞的P21ras蛋白含量高于另外19例光线性角化病皮损细胞及正常皮肤组织细 胞的P21ras蛋白含量，差异均具显著性，这表明P21ras蛋白含量可随光线性角化病皮损细 胞异形增生程度的加重而增高。另外，皮肤高分化鳞癌及光线性角化病皮损细胞的 P21ras蛋白含量的最高值病例(1.980及1.543)均是DNA异倍体细胞。上述这些变化均提示 P21ras蛋白与光线性角化病皮损细胞异形增生及细胞的恶性转化有关。
, http://www.100md.com
参考文献
[1]张继强，范顺才，刘华福.Ras癌基因产物P21在乳腺良、恶性病变中的表达.中华病理学
杂志,1994,23:302-303.
[2]李玉平，廖海鹰，孙修蓉，等.光线性角化病皮损细胞的DNA含量流式细胞分析.中华皮
肤科杂志,1997,30:246-247.
[3]四荣联，李玉平，姚春华，等.皮脂腺癌及汗腺癌细胞Bcl-2蛋白的定量分析.中华皮肤
科杂志,1997,30:258-259.
[4]Morkve O, Laerum OD. Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin-embedded tissue from bronchial carcinomas. Cytometry, 1991,12:438- 444.
[5]Spencer JM, Kahn SM, Jiang W, et al. Activated ras genes occur in human actinic keratoses, premalignant precursors to squamous cell carcinomas. Arch Dermatol, 1995,131:796- 800.
(收稿日期：1999-07-22), http://www.100md.com