降钙素在种植窗期子宫内膜的表达及其与不孕的关系
作者：付志红 陈士岭 邢福祺
单位：第一军医大学南方医院妇产科，广州 510515
关键词：子宫内膜；降钙素；不育症，女性
同济医科大学学报000422 摘要 为探讨降钙素(CT)在子宫内膜中的表达规律及其与不孕的关系。运用特异单克隆抗体，采用 免疫组化方法，对37份分别取自正常月经周期第7～28 d的内膜及20份不同原因不孕症患 者“种植窗”期的子宫内膜，进行了CT表达的检测。结果发现：CT特异性表达于“种植窗” 期子宫内膜，与正常妇女相比，输卵管阻塞性不孕患者子宫内膜中CT表达无差异，子宫内膜 异位症、不明原因不孕患者子宫内膜中CT表达明显减少。提示：CT参与种植窗期子宫内膜容 受性形成，CT表达异常，可能是导致不孕的重要因素。
中图法分类号 R322.6， R711.6
, 百拇医药
Expression of Calcitonin in Cycling Endo metrium and Its
Relationship with Infertility
Fu Zhihong Chen Shiling Xing Fuqi
(Department of Obstetrics and Gynecology, Nangfang Hosp ital,The First Military Medical University, Guangzhou 510515)
Abstract The changes of calcitonin expression in cycling endometrium and its relationship with infertility were investigated. Expression of calcit onin in endometrium was detected in 37 normal cycling women during different men strual phases and 26 cases of infertility during mid-luteal phase by immunohi stochemisty technique. Results showed calcitonin was expressed only in the mid- luteal. Compared with normal women, immunostaining of CT in the mid-luteal endo metrium with endometrasis, unexplained infertility was significantly weaker. These findings suggest calcitonin may play important roles in the process of im plantation.It might be a new reliable marker of uterine receptivity.Abnomal endo metrial calcitonin expression might be the major cause of infertility.
, 百拇医药
Key words endometrium； calcitonin； infertility,female
正常子宫内膜仅在一个极短的关键时期内允许胚胎着床，这一时期代表着子宫内膜接受 性达到最高，被称为“种植窗”(implantation window)。在人类和啮齿动物，着床发生 在 受精后4～6 d。虽然已知道“种植窗”的形成受卵巢激素的精细调控，但其分子机制还不清 楚 。推测：卵巢激素调节子宫内膜特定基因表达，合成新的蛋白质，使子宫内膜能接受胚胎植 入。Ying-Qing Ding等[1] 用基因表达筛选技术(gene express screen techniqu e)分离 出小鼠“种植窗”期子宫内膜特异性增强表达的基因，DNA测序发现其中之一为降钙素(Calc it onin ，CT)，其表达与“种植窗”的开放相吻合。阻断其表达，导致着床失败，说明CT在子 宫 内膜“种植窗”的形成中起重要作用。有关人类子宫内膜中CT的表达规律的研究，国内外均 未 见系统报道。本研究采用免疫组化技术，对正常妇女不同月经时期子宫内膜和不孕症患者子 宫内膜中CT进行了研究。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 研究对象
正常子宫内膜来自我院门诊因患阴道炎治疗后复查或上环的妇女37例，年龄25～32岁， 月经周期正常(28～30 d)，有正常生育史，3个月内未用任何激素类药物,分别取自周期第 7～27 d。不孕症患者20例来自1999年6月至9月在我院生殖中心行体外受精-胚胎移植(IVF -ET)的不孕妇女，年龄27～36岁。其中11例为输卵管阻塞性因素， 4例为子宫内膜异位症 ，5例为不明原因不孕。在月经第20～23 d行子宫内膜活检术。
1.2 方法
1.2.1 标本收集及处理：用刮匙搔刮少许子宫内膜组织，经中性福尔马林液固定，石蜡包埋切片，其中1张切片经常规HE染色，行组织学检查，确定其月经周期阶段，另2张切片行免疫组化染色备用。
, 百拇医药
1.2.2 检测方法：采用单克隆抗体免疫组化法，测定子宫内膜组织石蜡切片中的CT。CT 抗体为美国ZYMED产品，SABC试剂盒为武汉博士德产品。Ⅰ抗为兔抗人CT单克隆抗体， Ⅱ抗 为羊抗兔IgG，Ⅲ抗为辣根过氧化酶标记的链霉素卵白素。用PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照，阳 性对照由博士德公司提供。
1.2.3 分组情况：根据病理检查结果将37例正常生育期妇女分为增生早期(周期第6～9 d) 7例，增生晚期(周期第10～15 d)6例，黄体早期(周期第16～19 d)8例，黄体中期(周 期第20～23 d)10例，黄体晚期(周期第24～27 d)6例。
1.2.4 判断标准:在高倍显微镜下(10×10)观察细胞着色情况,以细胞内出现棕黄色颗粒 为阳性,空白对照为阴性,阳性对照为阳性。
1.2.5 半定量测定:用图像分析仪对每张切片进行半定量测定,记录所得的吸光度(A) 值。
, 百拇医药
1.3 统计分析
采用方差分析进行统计学处理。
2 结果
2.1 正常妇女月经周期中子宫内膜CT表达
CT特异性表达于黄体中期子宫内膜腺上皮细胞浆中，黄体早期开始有表达，黄体中期达 到最高，增殖期、黄体晚期均无表达。
2.2 不孕患者“种植窗”期子宫内膜CT表达
不孕患者“种植窗”期子宫内膜CT表达见表1。
表1 CT在正常月经周期子宫内膜中的表达
(±s) 组别
例数
, 百拇医药
A值
分泌中期
10
0.066768±0.001231
输卵管阻塞
11
0.058673±0.001124
内异症
4
0.012344±0.001154
不明原因
5
, 百拇医药
0.020534±0.001117
与正常妇女分泌中期比较 *P<0.013 讨论
CT是含有32个氨基酸残基的肽类激素，与相应受体结合区集中在9～32位氨基酸序列， 生 物活性区集中在3～6位氨基酸序列中。CT两端高度保守，对其生物活性很重要。CT 主要由 甲 状腺滤泡旁C细胞合成、分泌 。近几年发现，人全身各处的神经内分泌细胞都具有这种功能 ，只是甲状腺中的C细胞最强罢了。在其他组织如：肺、肝、小肠、垂体、下丘脑都有微量 合成。最近的研究表明：子宫也可合成CT。在这些组织中合成的精确部位和功能还了解不多 ，但其在全身广泛分布，并存在于无脊椎动物，说明CT具有广泛的生理功能。CT的主要生理 功能是通过抑制骨盐吸收和促进肾脏对钙的排泄，降低血浆Ca2+的水平。Lin HY 等 [2] 已克隆出人类编码对CT有高度亲和力的膜受体基因。CT和其受体结合后，促进CT受体与异三 聚体G蛋白的结合，活化腺苷酸环化酶和磷脂酶Cβ,参与多种细胞功能如：分化、增殖、变 形。
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3.1 CT特异性表达于种植窗期子宫内膜
Ding YQ 等研究发现：小鼠子宫内膜CT的mRNA和蛋白在交配后2 d开始增加，着床前1 d即交 配后第4 d达到顶峰，第5 d即着床日，CT表达开始下降，第6 d降到检测水平以下。在人类 ，着床发生在分泌中期(20～24 d)，即“种植窗”期。本研究结果显示，CT在增殖期子宫内膜中无表达，分泌早期开始增加，分泌中期达到最高，晚期消失。CT特异性表达于分泌中 期子宫内膜腺上皮细胞浆内，与子宫内膜“种植窗”的开放相吻合,提示：CT可能在子宫内 膜容受性形成中起重要作用。CT的主要功能是调节靶细胞的Ca2+水平，其参与着床 的可能机制 ：1，内膜腺上皮分泌CT，通过旁分泌方式作用于着床部位宫腔上皮细胞，促进细胞外Ca 2+内流，降低子宫腔Ca2+水平，促使上皮细胞之间紧密连接松弛，有利于着床。 研究发现[3]，向体外培养的人类极性上皮细胞中加入Ca2+可促进细胞 间紧密连接形 成，若去除Ca2+，则使连接松解。Ca2+还可促进重要的粘附分子和连接复合体 再分布和表达 ，这些因子使极性上皮细胞转化为非极性状态，有利于内膜腔上皮细胞和滋养细胞的紧密接 触；2，在妊娠早期，CT有助于维持子宫静息状态。研究发现：平滑肌细胞肌浆网内储存Ca 2+，血管紧张素、催产素等可促进Ca2+释放，提高肌浆Ca2+浓度，使肌 细胞收缩。子宫局部 释放CT可以抑制小鼠子宫和输卵管自发性和诱发性收缩[4] ，防止着床期间子宫收 缩，有 利于胚胎着床。最近研究发现[5]：小鼠4～8细胞阶段胚胎表面存在CT受体，CT参 与种植前 胚胎分化。在体外向培养基中加入CT，小鼠囊胚分化加快。这些结果提示：子宫内膜与胚胎 同步表达CT，CT一方面参与子宫内膜容受性形成，另一方面促进胚胎发育，以多种机制参与 着床。
, 百拇医药
3.2 CT与不孕的关系
本研究发现，存在一些不孕患者内膜组织正常，而功能异常，与正常妇女相比，子宫 内膜异位症、不明原因不孕患者“种植窗”期子宫内膜中CT表达明显减少，也许，这正是其 不孕的原因之一。输卵管阻塞性不孕患者CT表达比正常妇女下降，但无显著性意义。其CT表 达较少原因还不清楚。这些患者中，胚泡到达子宫腔后，由于内膜“种植窗”期的开放延迟 或功能缺陷而致“种植窗”缺乏，胚泡无法着床以致流产。目前尚无一个公认的评价子宫内 膜功能的良好指标，CT 特异性表达于“种植窗”期子宫内膜及在不孕症患者中的异常表达 ，使其可作为评价子宫内膜功能的良好指标。Li ji-zhu等[6]应用RIA技 术发现，小 鼠内膜腺上皮合成CT后可能分泌到宫腔，其检测方便是其他子宫内膜标志所无法比拟的。Su shma K等[7]的动物试验表明，孕激素通过其受体促进子宫内膜CT表达，雌激素则 抑制CT 表达，但在分泌晚期和孕期高水平孕激素却不能诱导CT表达，说明由其他未知因子参与其表 达调节，但其调节机制和具体作用机理还不清楚，有待于进一步探讨。
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付志红,女,1971年生,医学硕士
参 考 文 献
1，Ying-Qing Ding ,Li-Ji Zhu,Milan K et al. Progesterone stimulat es calcitonin g ene expression in the uterus during implantation.Endocrinology,1994,135:2265
2，Lin H Y, harris T L, Flannery M S et al. Expression cloning of a n adenylate cyclase-coupled calcitonin receptor.Science,1991,254:1022
3，Yoshinaga K. Future propect of research on endocrinology of embryo -endometrial interactions. In: Glasser S R, Mulholl J eds. Embryo-endometri al interactions. New York:Plenum Press,1994.151
, 百拇医药
4，Naghashpour M, Rosenblatt M I, Dickerson I M et al.Inhibitory effect of calc itonin gene-ralated peptide on myometrial contractility is diminished at partur tion. Endocrinology,1997,138:4207
5，Wang J, Rout U K, Bagchi I C et al. Expression of calcitonin re ceptors in mou se preimplantation embryo and their function in the regulation of blastocyst dif ferentiation by calcitonin. Development,1998,125:4293
6，Zhu L J, Milan K, Bagchi K et al. Attenuation of calcitonin gene expressio n in pregnant rat uterus leads to a block in embryonic implantation. Endocrinolo gy,1998,139:330
7，Sushma K, Zhu Li, Mary P et al. Progesterone induces calcit onin gene expression in endometrium within the putative window of implantation.J Clinic endocrinology and meta，1998,83：4443
(2000-02-28 收稿), http://www.100md.com
单位：第一军医大学南方医院妇产科，广州 510515
关键词：子宫内膜；降钙素；不育症，女性
同济医科大学学报000422 摘要 为探讨降钙素(CT)在子宫内膜中的表达规律及其与不孕的关系。运用特异单克隆抗体，采用 免疫组化方法，对37份分别取自正常月经周期第7～28 d的内膜及20份不同原因不孕症患 者“种植窗”期的子宫内膜，进行了CT表达的检测。结果发现：CT特异性表达于“种植窗” 期子宫内膜，与正常妇女相比，输卵管阻塞性不孕患者子宫内膜中CT表达无差异，子宫内膜 异位症、不明原因不孕患者子宫内膜中CT表达明显减少。提示：CT参与种植窗期子宫内膜容 受性形成，CT表达异常，可能是导致不孕的重要因素。
中图法分类号 R322.6， R711.6
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Expression of Calcitonin in Cycling Endo metrium and Its
Relationship with Infertility
Fu Zhihong Chen Shiling Xing Fuqi
(Department of Obstetrics and Gynecology, Nangfang Hosp ital,The First Military Medical University, Guangzhou 510515)
Abstract The changes of calcitonin expression in cycling endometrium and its relationship with infertility were investigated. Expression of calcit onin in endometrium was detected in 37 normal cycling women during different men strual phases and 26 cases of infertility during mid-luteal phase by immunohi stochemisty technique. Results showed calcitonin was expressed only in the mid- luteal. Compared with normal women, immunostaining of CT in the mid-luteal endo metrium with endometrasis, unexplained infertility was significantly weaker. These findings suggest calcitonin may play important roles in the process of im plantation.It might be a new reliable marker of uterine receptivity.Abnomal endo metrial calcitonin expression might be the major cause of infertility.
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Key words endometrium； calcitonin； infertility,female
正常子宫内膜仅在一个极短的关键时期内允许胚胎着床，这一时期代表着子宫内膜接受 性达到最高，被称为“种植窗”(implantation window)。在人类和啮齿动物，着床发生 在 受精后4～6 d。虽然已知道“种植窗”的形成受卵巢激素的精细调控，但其分子机制还不清 楚 。推测：卵巢激素调节子宫内膜特定基因表达，合成新的蛋白质，使子宫内膜能接受胚胎植 入。Ying-Qing Ding等[1] 用基因表达筛选技术(gene express screen techniqu e)分离 出小鼠“种植窗”期子宫内膜特异性增强表达的基因，DNA测序发现其中之一为降钙素(Calc it onin ，CT)，其表达与“种植窗”的开放相吻合。阻断其表达，导致着床失败，说明CT在子 宫 内膜“种植窗”的形成中起重要作用。有关人类子宫内膜中CT的表达规律的研究，国内外均 未 见系统报道。本研究采用免疫组化技术，对正常妇女不同月经时期子宫内膜和不孕症患者子 宫内膜中CT进行了研究。
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1 资料与方法
1.1 研究对象
正常子宫内膜来自我院门诊因患阴道炎治疗后复查或上环的妇女37例，年龄25～32岁， 月经周期正常(28～30 d)，有正常生育史，3个月内未用任何激素类药物,分别取自周期第 7～27 d。不孕症患者20例来自1999年6月至9月在我院生殖中心行体外受精-胚胎移植(IVF -ET)的不孕妇女，年龄27～36岁。其中11例为输卵管阻塞性因素， 4例为子宫内膜异位症 ，5例为不明原因不孕。在月经第20～23 d行子宫内膜活检术。
1.2 方法
1.2.1 标本收集及处理：用刮匙搔刮少许子宫内膜组织，经中性福尔马林液固定，石蜡包埋切片，其中1张切片经常规HE染色，行组织学检查，确定其月经周期阶段，另2张切片行免疫组化染色备用。
, 百拇医药
1.2.2 检测方法：采用单克隆抗体免疫组化法，测定子宫内膜组织石蜡切片中的CT。CT 抗体为美国ZYMED产品，SABC试剂盒为武汉博士德产品。Ⅰ抗为兔抗人CT单克隆抗体， Ⅱ抗 为羊抗兔IgG，Ⅲ抗为辣根过氧化酶标记的链霉素卵白素。用PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照，阳 性对照由博士德公司提供。
1.2.3 分组情况：根据病理检查结果将37例正常生育期妇女分为增生早期(周期第6～9 d) 7例，增生晚期(周期第10～15 d)6例，黄体早期(周期第16～19 d)8例，黄体中期(周 期第20～23 d)10例，黄体晚期(周期第24～27 d)6例。
1.2.4 判断标准:在高倍显微镜下(10×10)观察细胞着色情况,以细胞内出现棕黄色颗粒 为阳性,空白对照为阴性,阳性对照为阳性。
1.2.5 半定量测定:用图像分析仪对每张切片进行半定量测定,记录所得的吸光度(A) 值。
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1.3 统计分析
采用方差分析进行统计学处理。
2 结果
2.1 正常妇女月经周期中子宫内膜CT表达
CT特异性表达于黄体中期子宫内膜腺上皮细胞浆中，黄体早期开始有表达，黄体中期达 到最高，增殖期、黄体晚期均无表达。
2.2 不孕患者“种植窗”期子宫内膜CT表达
不孕患者“种植窗”期子宫内膜CT表达见表1。
表1 CT在正常月经周期子宫内膜中的表达
(±s) 组别
例数
, 百拇医药
A值
分泌中期
10
0.066768±0.001231
输卵管阻塞
11
0.058673±0.001124
内异症
4
0.012344±0.001154
不明原因
5
, 百拇医药
0.020534±0.001117
与正常妇女分泌中期比较 *P<0.013 讨论
CT是含有32个氨基酸残基的肽类激素，与相应受体结合区集中在9～32位氨基酸序列， 生 物活性区集中在3～6位氨基酸序列中。CT两端高度保守，对其生物活性很重要。CT 主要由 甲 状腺滤泡旁C细胞合成、分泌 。近几年发现，人全身各处的神经内分泌细胞都具有这种功能 ，只是甲状腺中的C细胞最强罢了。在其他组织如：肺、肝、小肠、垂体、下丘脑都有微量 合成。最近的研究表明：子宫也可合成CT。在这些组织中合成的精确部位和功能还了解不多 ，但其在全身广泛分布，并存在于无脊椎动物，说明CT具有广泛的生理功能。CT的主要生理 功能是通过抑制骨盐吸收和促进肾脏对钙的排泄，降低血浆Ca2+的水平。Lin HY 等 [2] 已克隆出人类编码对CT有高度亲和力的膜受体基因。CT和其受体结合后，促进CT受体与异三 聚体G蛋白的结合，活化腺苷酸环化酶和磷脂酶Cβ,参与多种细胞功能如：分化、增殖、变 形。
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3.1 CT特异性表达于种植窗期子宫内膜
Ding YQ 等研究发现：小鼠子宫内膜CT的mRNA和蛋白在交配后2 d开始增加，着床前1 d即交 配后第4 d达到顶峰，第5 d即着床日，CT表达开始下降，第6 d降到检测水平以下。在人类 ，着床发生在分泌中期(20～24 d)，即“种植窗”期。本研究结果显示，CT在增殖期子宫内膜中无表达，分泌早期开始增加，分泌中期达到最高，晚期消失。CT特异性表达于分泌中 期子宫内膜腺上皮细胞浆内，与子宫内膜“种植窗”的开放相吻合,提示：CT可能在子宫内 膜容受性形成中起重要作用。CT的主要功能是调节靶细胞的Ca2+水平，其参与着床 的可能机制 ：1，内膜腺上皮分泌CT，通过旁分泌方式作用于着床部位宫腔上皮细胞，促进细胞外Ca 2+内流，降低子宫腔Ca2+水平，促使上皮细胞之间紧密连接松弛，有利于着床。 研究发现[3]，向体外培养的人类极性上皮细胞中加入Ca2+可促进细胞 间紧密连接形 成，若去除Ca2+，则使连接松解。Ca2+还可促进重要的粘附分子和连接复合体 再分布和表达 ，这些因子使极性上皮细胞转化为非极性状态，有利于内膜腔上皮细胞和滋养细胞的紧密接 触；2，在妊娠早期，CT有助于维持子宫静息状态。研究发现：平滑肌细胞肌浆网内储存Ca 2+，血管紧张素、催产素等可促进Ca2+释放，提高肌浆Ca2+浓度，使肌 细胞收缩。子宫局部 释放CT可以抑制小鼠子宫和输卵管自发性和诱发性收缩[4] ，防止着床期间子宫收 缩，有 利于胚胎着床。最近研究发现[5]：小鼠4～8细胞阶段胚胎表面存在CT受体，CT参 与种植前 胚胎分化。在体外向培养基中加入CT，小鼠囊胚分化加快。这些结果提示：子宫内膜与胚胎 同步表达CT，CT一方面参与子宫内膜容受性形成，另一方面促进胚胎发育，以多种机制参与 着床。
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3.2 CT与不孕的关系
本研究发现，存在一些不孕患者内膜组织正常，而功能异常，与正常妇女相比，子宫 内膜异位症、不明原因不孕患者“种植窗”期子宫内膜中CT表达明显减少，也许，这正是其 不孕的原因之一。输卵管阻塞性不孕患者CT表达比正常妇女下降，但无显著性意义。其CT表 达较少原因还不清楚。这些患者中，胚泡到达子宫腔后，由于内膜“种植窗”期的开放延迟 或功能缺陷而致“种植窗”缺乏，胚泡无法着床以致流产。目前尚无一个公认的评价子宫内 膜功能的良好指标，CT 特异性表达于“种植窗”期子宫内膜及在不孕症患者中的异常表达 ，使其可作为评价子宫内膜功能的良好指标。Li ji-zhu等[6]应用RIA技 术发现，小 鼠内膜腺上皮合成CT后可能分泌到宫腔，其检测方便是其他子宫内膜标志所无法比拟的。Su shma K等[7]的动物试验表明，孕激素通过其受体促进子宫内膜CT表达，雌激素则 抑制CT 表达，但在分泌晚期和孕期高水平孕激素却不能诱导CT表达，说明由其他未知因子参与其表 达调节，但其调节机制和具体作用机理还不清楚，有待于进一步探讨。
, http://www.100md.com
付志红,女,1971年生,医学硕士
参 考 文 献
1，Ying-Qing Ding ,Li-Ji Zhu,Milan K et al. Progesterone stimulat es calcitonin g ene expression in the uterus during implantation.Endocrinology,1994,135:2265
2，Lin H Y, harris T L, Flannery M S et al. Expression cloning of a n adenylate cyclase-coupled calcitonin receptor.Science,1991,254:1022
3，Yoshinaga K. Future propect of research on endocrinology of embryo -endometrial interactions. In: Glasser S R, Mulholl J eds. Embryo-endometri al interactions. New York:Plenum Press,1994.151
, 百拇医药
4，Naghashpour M, Rosenblatt M I, Dickerson I M et al.Inhibitory effect of calc itonin gene-ralated peptide on myometrial contractility is diminished at partur tion. Endocrinology,1997,138:4207
5，Wang J, Rout U K, Bagchi I C et al. Expression of calcitonin re ceptors in mou se preimplantation embryo and their function in the regulation of blastocyst dif ferentiation by calcitonin. Development,1998,125:4293
6，Zhu L J, Milan K, Bagchi K et al. Attenuation of calcitonin gene expressio n in pregnant rat uterus leads to a block in embryonic implantation. Endocrinolo gy,1998,139:330
7，Sushma K, Zhu Li, Mary P et al. Progesterone induces calcit onin gene expression in endometrium within the putative window of implantation.J Clinic endocrinology and meta，1998,83：4443
(2000-02-28 收稿), http://www.100md.com