HIV-1感染者外周血单个核细胞缺损病毒基因的研究
作者：徐小元 陈力 斯崇文 王勤环 Jean-Claude Chermann
单位：徐小元 陈力 斯崇文 王勤环(北京大学第一医院感染疾病科，北京 100034)；Jean-Claude Chermann(法国马赛逆转录病毒研究所)
关键词：HIV-1；获得性免疫缺陷综合征；单核细胞；基因缺失；基因；病毒
北京医科大学学报000426 [摘 要] 目的：研究HIV-1感染者缺损HIV-1 DNA的特性。方法：用长片段PCR法(LD-PCR)研究分析HIV-1感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear, PBMCs)和体外培养感染淋巴细胞中HIV-1基因特征，使用位于HIV-1 DNA链两端的LTR(U5)、LTR(R)为引物，插入有全长HIV-1基因片段的大肠杆菌质粒PNL4-3等为标准对照，并对部分标本克隆测序。结果：经扩增9.1 kb是LD-PCR的主要产物，但在10例HIV-1感染者中有9例PBMCs检测出大小不一、范围较广的缺失HIV-1基因片段，经用基因探针杂交，发现近HIV-1基因中心部位缺失频率增加，缺失结合点常存在3～4个核苷酸短片段直接重复，体外培养中HIV-1基因缺损量减少，完整和缺失基因的存在与培养中病毒分离的时间密切相关。结论：HIV-1感染者PBMCs中存在大量HIV-1基因重组和缺损片段。
, 百拇医药
[中图分类号] R512.91 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0374-04
Character of viral genomes in peripheral blood mononuclear of HIV-1 infected persons
XU Xiao-Yuan
(Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
CHEN Li
(Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
, 百拇医药
SI Chong-Wen
(Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
WANG Qin-Huan
(Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
Jean-Claude Chermann
(Unite de Rechercher sur les Retrovirus et Maladies Associees, INSERM U322)
, 百拇医药
ABSTRACT Objective:
To study the character of defective HIV-1 DNA genomes of HIV-1 infected persons. Methods: HIV-1 DNA was amplified by long-distance PCR (LD-PCR) from lymphocytes infected in vitro and peripheral blood mononuclears (PBMCs) in individuals infected. As primers located between both long terminal repeats LTR(U5)-LTR(R)， controls were pNL4-3 with full-length HIV-1 genomes which was inserted to plasmid prepared in E.coli and several examples were cloned and sequenced etc. Results: 9.1 kb band was the major LD-PCR product. However，defected HIV-1 genomes of variable size were extensively detected in PBMCs of 9/10 HIV-1 infected persons. Using oligonucleotide probes the frequency of deletions was found to increase with their proximity to the center of the HIV-1 genome. Short direct repeat of three or four nucleotides was present at the deletion junctions in analyzing further detail; the quantity of defective HIV-1 genomes decreased after in vitro; persistence of defective genomes and full-length in vitro correlated with the time of isolation of infectious virus. Conclusion: All this showed a great number of intragenomic rearrangements in HIV-1 genomes and defective genomes accumulated in PBMCs of persons infected.
, 百拇医药
KEY WORDS HIV-1; Acquired immunodeficiency syndrome; Monocytes; Gene deletion; Genes, viral
(J Beijing Med Univ, 2000,32:374-377)
艾滋病病毒(human immunodeficiency virus, HIV)是一种RNA逆转录病毒，其基因组由 RNA 向 DNA 反向转录，再由 DNA 向 RNA 正向转录的过程均是由病毒本身逆转录酶所催化，该酶无核酸外切酶活性，不能把错配的核苷酸从已生成的核苷酸链上切除，也不能修补为逃避免疫攻击适合生存环境而缺损部分片段的核苷酸链，含有缺损基因片段的病毒叫缺损病毒，机体免疫系统不能清除含有无表达功能的HIV缺损病毒细胞[1～3]，因此，研究缺损HIV基因片段，观察HIV缺损的特征，了解HIV缺损的影响因素，有助于进一步阐明HIV致病机制、母婴传播的原因，同时也有利于更好地进行抗HIV治疗。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本
10例HIV-1血清学阳性的住院患者(法国马赛市St.Marquetite医院)，年龄21～54岁。一般病毒学特征如表1所示，两人存活超过10年(SUFED，QEUNE)属无症状感染者。
表1 HIV-1 感染者一般病毒学特征
Table 1 Characteristics of HIV-1 infected individuals No.
Code
Sex
Age
(years)
, http://www.100md.com
HIV
positivity(Y)
Antiviral
therapy
CD4 cell
(μl)
Decline of
CD4>50%/Y
gag copies/
μg DNA
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1.2 细胞培养和病毒分离
HIV-1阳性PBMCs通过Ficoll-Hypaque梯度离心分离，去除单核白细胞的淋巴细胞用植物血凝素处理3 d。病毒产物按Barre-Sinoussi法检测[4]。PNL4-3为插入有全长HIV-1基因片段的大肠杆菌质粒，HIV-PAR为从患有急性脑膜炎HIV-1血清学阳性患者脑脊液中分离的病毒株，在一健康脐带血淋巴细胞中(cord blood lymphocytes, CBL)传代，HIV-1 LAV为B亚型原型病毒株，在外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes, PBL)中传代。
1.3 PCR扩增病毒DNA
5×106细胞经100 mmol.L-1 NaCl，10 mmol.L-1 Tris-HCl (pH 7.6)10 mmol.L-1 EDTA和10g.L-1 Sarcosyl缓冲液溶解，每亳升加100 μg蛋白酶K，56℃孵育过夜，经酚提纯，酒精沉淀后，DNA溶解于TE或水中，光密度260 nm波长确定浓度，将1 μg DNA标本加1.75 u LD-PCR酶(Boehringer Mannheim公司产品)，在50 μl反应体积中含有50 mmol.L-1 Tris-HCl(pH 9.2)，14 mmol.L-1(NH4)2SO4，1.75 mmol.L-1 MgCl2，A，T，C，G各350 μmol.L-1，15 pmol顺向引物LTR(U5)(序列为5＇-GTCTGTTGTGTGACTCTGGT-3＇nt112-131，本文所提的全部碱基序列与Bukrinsky等所述的HIV-1 LAI序列一致[5]，逆向引物LTR(R)(5＇-GAGGCTTAAGCAGTGGGTTC-3＇nt9185-9204)，PCR为40个循环。变性15 s 94℃，退火30 s 55℃，延长8 min 68℃，每个循环不延长时间，最后为7 min 68℃，每份标本至少重复3次。普通PCR法使用Tag酶，引物gagA1(5＇-GATTTAAACACCA-TGCTAAACACAGTGG-3＇nt882-909顺向)，gagA2(5＇-TTTGGTCCCTGTCTTATGTCCAAAATGC-3＇，nt1177-1204逆向)，为避免可能存在的污染，全部PCR过程在PCR室进行与其它PCR隔离，阳性对照在PCR室外进行。
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1.4 PCR结果分析
用Southern blot转印杂交，杂交探针用32P标记5＇-NCS (5＇-TTGCTGAAGCGCGCACGGCAA-3＇nt249-269顺向NDK-1)，gag (5＇-TTTGTTCCTGA-AGGGTACTAGTAGTTCC-3＇nt1047-1074逆向gagDTRA)，pol (5＇-TGCCCACACTAATGATGTAA-AACAATTA-3＇nt3208-3235顺向polA1)，tat (5＇-TTGGGTGTCGACATAGCAGAATAGGCGT-3＇nt5361-5388顺向tatA2)，env (5＇-ATCCTCAGGAG-GGGACCCAGAAATT-3＇nt6906-6930顺向)，nef (5＇-TTTCCAGGTCTCGAGATACTGCTCC-3＇nt8480-8504逆向)，LTR(U3) (5＇-CTACAAGGGACTTTC-CGCTGG-3＇nt9022-9042顺向)。
, 百拇医药
1.5 HIV-1 DNA片段分子克隆
LD-PCR产物行琼脂电泳分离纯化，用纯5＇-NCS和NEF引物重复LD-PCR扩增，以期得到足够DNA制做克隆，引物5＇-NCS和NEF分别含有Bssh Ⅱ，Xho Ⅰ限制位点，保存HIV-1基本核酸序列，用Bssh Ⅱ和Xho Ⅰ消化产生粘合末端，经同源插入重组到质粒PNL4-3中。
1.6 缺失基因测定及定量分析
按限制竞争定量PCR法。
2 结果
2.1 标准对照经LD-PCR扩增，主要产物为完整HIV-DNA
用HIV-1 LAV和PAR感染CBL、PBL及插入有全长基因片段的PNL4-3做为标准对照，使用LTR(U5)和LTR(R)引物，9.1 kb是LD-PCR的主要产物(图1)，同时还可有一条短的595 bp LTR-LTR片段，普通PCR扩增片段为322 bp，以PNL4-3 10倍稀释做定量测定。
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图1 1～3号为体外培养中经HIV-1 LAV感染4 d,4～6号为CBL经HIV-1 PAR感染4d提取的DNA,10倍梯度稀释行LD-PCR扩增,32P gag基因片段探针杂交,7号为肠道HT29细胞经NDK感染,8号为MT4细胞经LAV感染,9号为MT4细胞经NDK感染,10～12号为插入有全长HIV-1基因片段的PNL4-3质粒杂交带。
Figure 1 Lanes 1 to 3 and 4 to 6 are LD-PCR of decatic dilutions
of DNA extracted from PBL and CBL 4 days postinfection with
HIV-1 LAV and PAR respectively, hybridized with 32P-labeled gag probe.
, 百拇医药
7 to 8 are HT29 MT4 4 days postinfection with HIV-1 NDK or LAV.
Lanes 10 to 12 : LD-PCR of decadic dilutions of purified pNL 4-3.
2.2 大多数感染者PBMCs中存在全长和广泛缺失的HIV-1基因片段
PCR产物用转移印迹法经gag，pol，tat，nef等7种探针杂交，10例标本中8例存在全长HIV-1 DNA，1例无进展患者(QEUNE)只发现7 kb条带：另1例进展患者(FYNWO)未发现全长HIV-1 DNA (图2，第8，10号)，除1例外，全部标本均发现2～7条从600 bp到全长序列的HIV-1 DNA条带[6]。体外培养后缺损HIV-1基因量逐渐减少，应用普通PCR从感染者PBMCs 1 μg的DNA中检测到2～300拷贝的gag基因片段。
, 百拇医药
图2 用32P标记gag, pol, tat和nef等不同基因片段探针
重复杂交同一张纤维膜,标本1～10同表1中1～10。
Figure 2 Same a nylon membrane reprobed by gag, pol, tat, and
nef respectively. Lanes 1 to 10: individuals 1 to 10 (Table 1).
2.3 近HIV-1基因中心部位缺失率增加
我们使用7种不同HIV-1基因片段探针确定了缺损HIV-1 DNA片段，每种探针没有HIV-1基因其余部分的同源序列，各种探针杂交到的带大部分是HIV-1基因的两端，越近中心部位杂交到的带越少，基因片段缺失越高，缺失频率与靠近HIV-1基因中心部位，围绕tat基因成正比，依次为env，pol，nef，gag，LTR(U3)，5′NCS等，在大多数情况下，缺损序列是互相毗邻的，这种现象提示：多数缺失片段是由单一缺损因素引起，探针显影随着缺损DNA片段相对分子质量的减少而逐渐消失。
, 百拇医药
2.4 缺失连接点存在短片段直接重复
为进一步仔细分析缺失特点，将感染者FOCEP、CESMO和NIPDJ的PCR产物克隆到质粒PNL4-3 BsshⅡ和xXhoⅠ位点，从5＇NCS到NEF基因片段经过缺失区域对质粒P△CESMO，P△FOCEP和P△NIPDJ进行序列分析，与HIV-1 LAI比较，3个质粒具有单基因片段缺失特征序列，在缺损连接点有短的直接重复特征(图3)。缺失范围P△CESMO为7 759个核苷酸，P△FOCEP为7 014个核苷酸，P△NIPDJ为5 394个核苷酸，直接重复片段P△ FOCEP和P△NIPDJ是3个核苷酸，P△CESMO是4个核苷酸，其余部位与HIV-1 LAI基因序列一致。
图3 缺损连接处缺损DNA病毒克隆序列
Figure 3 DNA squence of cloned defective proviruses at the deletion junction
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3 讨论
与体外感染相反，感染者PBMCs中聚集缺损基因，二者感染结果不同的主要原因很可能是免疫系统清除感染细胞产物，缺损病毒在体内聚集的可能性为他们能够避开杀伤细胞，体外培养中这种现象虽然同样能够发生，但体外培养PBMCs激活后，病毒竞争性复制，HIV-1缺损基因聚集复杂性降低，在突变水平上存在相似情况，HIV-1发育过程中体内比体外感染存在更多的不成熟病毒。
体外培养PBMCs激活后，LD-PCR扩增条带持续存在与孤立的HIV-1感染有关，缺损和完整HIV-1基因可以在未检测到病毒个体的PBMCs中查到，这可能是一种非活跃复制或是高减毒株病毒存在于这些个体的PBMCs中。体外培养时，激活的PBMCs中缺损HIV-1基因量减少，缺损和完整基因从没有检测到感染病毒激活的PBMCs中消失，与病毒竞争复制相反，缺损基因消失很可能是激活的PBMCs对缺损病毒有毒性作用，也可能是静止T细胞中大量HIV-DNA以无整合形式存在，并在细胞激活后整合到宿主基因中，即缺损基因的消失也可能是低整合效果引起，缺损基因依靠他们互补关系重新组合而恢复正常。
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基因缺失与近基因中心成正比，提示大量缺损病毒在体内通过选择拷贝机制复制，遵照这个模式，翻译过早终止，聚合酶按不成熟的线状链移到其它位点重新翻译，由于缺失DNA区域扩大，使基因中心部位缺失的可能性比外周部位缺失的可能性增加得更迅速。此外，缺损部位沿HIV-1基因部分呈现轻度不对称，缺损基因3′末端LTR(U3)序列较5′末端5′NCS序列出现率高，认为翻译终止同样可能发生在任何位点，然而，终止首先更可能发生在翻译的起点而不是终点，这种不对称与负链逆向转录从3′-5′HIV-1RNA末端单聚合酶链跳跃模式一致，聚合酶的分离也可发生在没有LTR重新开始合成和终止时，在我们实验中没有发现这种现象。这种情况在其它逆转录基因已描述[7]，我们还发现HIV-1缺损包括缺损接合处相同序列段的延长，重新合成只需要很少相同序列，目前，在缺失HIV-1基因结合处没有发现额外插入的短片段。
许多研究已证实HIV-1序列变化，但很少发现HIV-1基因大片段缺失和大范围交换，大范围缺损病毒已从人大脑组织直接克隆而不需体外培养发现，但只能分析很少分子片段。LD-PCR表明了含有两侧LTR序列完整HIV-1基因的典型分布，并可确定在病毒聚集中基因内部重新排列，帮助了解缺损病毒性质及缺损HIV与母婴传播的关系，不同组织(大脑，各级淋巴组织等)HIV-1复制变化情况，跟踪HIV-1基因逆转录不同状态等，虽然还没有发现缺损基因和病人临床状态之间存在明显的关系，但仍不失为一种非常有价值的研究。
, 百拇医药
基金项目：法国ANRS和INSERM资助；
Jean-Claude Chermann是艾滋病/HIV-1发现者之一。
参考文献
1，Wei X, Ghost SK, Taylor ME, et al. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection[J]. Nature, 1995, 373: 117-122
2，Coffin JM. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy[J]. Science, 1995, 267: 483-489
, http://www.100md.com
3，Cao Y, Qin L, Zhang L, et al. Virologic and immunologic characterization of long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection[J]. N Engl J Med, 1995, 332 : 201-208
4，Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Ray F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)[J]. Science, 1983, 220: 868-871
5，Bukrinsky MI, Sharova N, McDonald TL, et al. Association of integrase, matrix, and reverse transcriptase antigens of human immunodeficiency virus type 1 with viral nucleic acids following acute infection[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 6125-6129
, 百拇医药
6，Sanchez G, Xu X, Chermann JC, et al. Accumulation of defective viral genomes in peripheral blood mononuclear cells of human immunodeficency virus type 1 infected individuals[J]. J Virol, 1997, 71: 2233-2240
7，Salminen MO, Koch C, Sanders-Buell E, et al. Recovery of virtually full-length HIV-1 provirus of diverse subtypes from primary virus cultures using the polymerase chain reaction[J]. Virology, 1995, 213: 80-86
(1999-06-24收稿), 百拇医药
单位：徐小元 陈力 斯崇文 王勤环(北京大学第一医院感染疾病科，北京 100034)；Jean-Claude Chermann(法国马赛逆转录病毒研究所)
关键词：HIV-1；获得性免疫缺陷综合征；单核细胞；基因缺失；基因；病毒
北京医科大学学报000426 [摘 要] 目的：研究HIV-1感染者缺损HIV-1 DNA的特性。方法：用长片段PCR法(LD-PCR)研究分析HIV-1感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear, PBMCs)和体外培养感染淋巴细胞中HIV-1基因特征，使用位于HIV-1 DNA链两端的LTR(U5)、LTR(R)为引物，插入有全长HIV-1基因片段的大肠杆菌质粒PNL4-3等为标准对照，并对部分标本克隆测序。结果：经扩增9.1 kb是LD-PCR的主要产物，但在10例HIV-1感染者中有9例PBMCs检测出大小不一、范围较广的缺失HIV-1基因片段，经用基因探针杂交，发现近HIV-1基因中心部位缺失频率增加，缺失结合点常存在3～4个核苷酸短片段直接重复，体外培养中HIV-1基因缺损量减少，完整和缺失基因的存在与培养中病毒分离的时间密切相关。结论：HIV-1感染者PBMCs中存在大量HIV-1基因重组和缺损片段。
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[中图分类号] R512.91 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0374-04
Character of viral genomes in peripheral blood mononuclear of HIV-1 infected persons
XU Xiao-Yuan
(Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
CHEN Li
(Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
, 百拇医药
SI Chong-Wen
(Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
WANG Qin-Huan
(Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
Jean-Claude Chermann
(Unite de Rechercher sur les Retrovirus et Maladies Associees, INSERM U322)
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ABSTRACT Objective:
To study the character of defective HIV-1 DNA genomes of HIV-1 infected persons. Methods: HIV-1 DNA was amplified by long-distance PCR (LD-PCR) from lymphocytes infected in vitro and peripheral blood mononuclears (PBMCs) in individuals infected. As primers located between both long terminal repeats LTR(U5)-LTR(R)， controls were pNL4-3 with full-length HIV-1 genomes which was inserted to plasmid prepared in E.coli and several examples were cloned and sequenced etc. Results: 9.1 kb band was the major LD-PCR product. However，defected HIV-1 genomes of variable size were extensively detected in PBMCs of 9/10 HIV-1 infected persons. Using oligonucleotide probes the frequency of deletions was found to increase with their proximity to the center of the HIV-1 genome. Short direct repeat of three or four nucleotides was present at the deletion junctions in analyzing further detail; the quantity of defective HIV-1 genomes decreased after in vitro; persistence of defective genomes and full-length in vitro correlated with the time of isolation of infectious virus. Conclusion: All this showed a great number of intragenomic rearrangements in HIV-1 genomes and defective genomes accumulated in PBMCs of persons infected.
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KEY WORDS HIV-1; Acquired immunodeficiency syndrome; Monocytes; Gene deletion; Genes, viral
(J Beijing Med Univ, 2000,32:374-377)
艾滋病病毒(human immunodeficiency virus, HIV)是一种RNA逆转录病毒，其基因组由 RNA 向 DNA 反向转录，再由 DNA 向 RNA 正向转录的过程均是由病毒本身逆转录酶所催化，该酶无核酸外切酶活性，不能把错配的核苷酸从已生成的核苷酸链上切除，也不能修补为逃避免疫攻击适合生存环境而缺损部分片段的核苷酸链，含有缺损基因片段的病毒叫缺损病毒，机体免疫系统不能清除含有无表达功能的HIV缺损病毒细胞[1～3]，因此，研究缺损HIV基因片段，观察HIV缺损的特征，了解HIV缺损的影响因素，有助于进一步阐明HIV致病机制、母婴传播的原因，同时也有利于更好地进行抗HIV治疗。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本
10例HIV-1血清学阳性的住院患者(法国马赛市St.Marquetite医院)，年龄21～54岁。一般病毒学特征如表1所示，两人存活超过10年(SUFED，QEUNE)属无症状感染者。
表1 HIV-1 感染者一般病毒学特征
Table 1 Characteristics of HIV-1 infected individuals No.
Code
Sex
Age
(years)
, http://www.100md.com
HIV
positivity(Y)
Antiviral
therapy
CD4 cell
(μl)
Decline of
CD4>50%/Y
gag copies/
μg DNA
PBL virus
isolation
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1.2 细胞培养和病毒分离
HIV-1阳性PBMCs通过Ficoll-Hypaque梯度离心分离，去除单核白细胞的淋巴细胞用植物血凝素处理3 d。病毒产物按Barre-Sinoussi法检测[4]。PNL4-3为插入有全长HIV-1基因片段的大肠杆菌质粒，HIV-PAR为从患有急性脑膜炎HIV-1血清学阳性患者脑脊液中分离的病毒株，在一健康脐带血淋巴细胞中(cord blood lymphocytes, CBL)传代，HIV-1 LAV为B亚型原型病毒株，在外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes, PBL)中传代。
1.3 PCR扩增病毒DNA
5×106细胞经100 mmol.L-1 NaCl，10 mmol.L-1 Tris-HCl (pH 7.6)10 mmol.L-1 EDTA和10g.L-1 Sarcosyl缓冲液溶解，每亳升加100 μg蛋白酶K，56℃孵育过夜，经酚提纯，酒精沉淀后，DNA溶解于TE或水中，光密度260 nm波长确定浓度，将1 μg DNA标本加1.75 u LD-PCR酶(Boehringer Mannheim公司产品)，在50 μl反应体积中含有50 mmol.L-1 Tris-HCl(pH 9.2)，14 mmol.L-1(NH4)2SO4，1.75 mmol.L-1 MgCl2，A，T，C，G各350 μmol.L-1，15 pmol顺向引物LTR(U5)(序列为5＇-GTCTGTTGTGTGACTCTGGT-3＇nt112-131，本文所提的全部碱基序列与Bukrinsky等所述的HIV-1 LAI序列一致[5]，逆向引物LTR(R)(5＇-GAGGCTTAAGCAGTGGGTTC-3＇nt9185-9204)，PCR为40个循环。变性15 s 94℃，退火30 s 55℃，延长8 min 68℃，每个循环不延长时间，最后为7 min 68℃，每份标本至少重复3次。普通PCR法使用Tag酶，引物gagA1(5＇-GATTTAAACACCA-TGCTAAACACAGTGG-3＇nt882-909顺向)，gagA2(5＇-TTTGGTCCCTGTCTTATGTCCAAAATGC-3＇，nt1177-1204逆向)，为避免可能存在的污染，全部PCR过程在PCR室进行与其它PCR隔离，阳性对照在PCR室外进行。
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1.4 PCR结果分析
用Southern blot转印杂交，杂交探针用32P标记5＇-NCS (5＇-TTGCTGAAGCGCGCACGGCAA-3＇nt249-269顺向NDK-1)，gag (5＇-TTTGTTCCTGA-AGGGTACTAGTAGTTCC-3＇nt1047-1074逆向gagDTRA)，pol (5＇-TGCCCACACTAATGATGTAA-AACAATTA-3＇nt3208-3235顺向polA1)，tat (5＇-TTGGGTGTCGACATAGCAGAATAGGCGT-3＇nt5361-5388顺向tatA2)，env (5＇-ATCCTCAGGAG-GGGACCCAGAAATT-3＇nt6906-6930顺向)，nef (5＇-TTTCCAGGTCTCGAGATACTGCTCC-3＇nt8480-8504逆向)，LTR(U3) (5＇-CTACAAGGGACTTTC-CGCTGG-3＇nt9022-9042顺向)。
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1.5 HIV-1 DNA片段分子克隆
LD-PCR产物行琼脂电泳分离纯化，用纯5＇-NCS和NEF引物重复LD-PCR扩增，以期得到足够DNA制做克隆，引物5＇-NCS和NEF分别含有Bssh Ⅱ，Xho Ⅰ限制位点，保存HIV-1基本核酸序列，用Bssh Ⅱ和Xho Ⅰ消化产生粘合末端，经同源插入重组到质粒PNL4-3中。
1.6 缺失基因测定及定量分析
按限制竞争定量PCR法。
2 结果
2.1 标准对照经LD-PCR扩增，主要产物为完整HIV-DNA
用HIV-1 LAV和PAR感染CBL、PBL及插入有全长基因片段的PNL4-3做为标准对照，使用LTR(U5)和LTR(R)引物，9.1 kb是LD-PCR的主要产物(图1)，同时还可有一条短的595 bp LTR-LTR片段，普通PCR扩增片段为322 bp，以PNL4-3 10倍稀释做定量测定。
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图1 1～3号为体外培养中经HIV-1 LAV感染4 d,4～6号为CBL经HIV-1 PAR感染4d提取的DNA,10倍梯度稀释行LD-PCR扩增,32P gag基因片段探针杂交,7号为肠道HT29细胞经NDK感染,8号为MT4细胞经LAV感染,9号为MT4细胞经NDK感染,10～12号为插入有全长HIV-1基因片段的PNL4-3质粒杂交带。
Figure 1 Lanes 1 to 3 and 4 to 6 are LD-PCR of decatic dilutions
of DNA extracted from PBL and CBL 4 days postinfection with
HIV-1 LAV and PAR respectively, hybridized with 32P-labeled gag probe.
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7 to 8 are HT29 MT4 4 days postinfection with HIV-1 NDK or LAV.
Lanes 10 to 12 : LD-PCR of decadic dilutions of purified pNL 4-3.
2.2 大多数感染者PBMCs中存在全长和广泛缺失的HIV-1基因片段
PCR产物用转移印迹法经gag，pol，tat，nef等7种探针杂交，10例标本中8例存在全长HIV-1 DNA，1例无进展患者(QEUNE)只发现7 kb条带：另1例进展患者(FYNWO)未发现全长HIV-1 DNA (图2，第8，10号)，除1例外，全部标本均发现2～7条从600 bp到全长序列的HIV-1 DNA条带[6]。体外培养后缺损HIV-1基因量逐渐减少，应用普通PCR从感染者PBMCs 1 μg的DNA中检测到2～300拷贝的gag基因片段。
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图2 用32P标记gag, pol, tat和nef等不同基因片段探针
重复杂交同一张纤维膜,标本1～10同表1中1～10。
Figure 2 Same a nylon membrane reprobed by gag, pol, tat, and
nef respectively. Lanes 1 to 10: individuals 1 to 10 (Table 1).
2.3 近HIV-1基因中心部位缺失率增加
我们使用7种不同HIV-1基因片段探针确定了缺损HIV-1 DNA片段，每种探针没有HIV-1基因其余部分的同源序列，各种探针杂交到的带大部分是HIV-1基因的两端，越近中心部位杂交到的带越少，基因片段缺失越高，缺失频率与靠近HIV-1基因中心部位，围绕tat基因成正比，依次为env，pol，nef，gag，LTR(U3)，5′NCS等，在大多数情况下，缺损序列是互相毗邻的，这种现象提示：多数缺失片段是由单一缺损因素引起，探针显影随着缺损DNA片段相对分子质量的减少而逐渐消失。
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2.4 缺失连接点存在短片段直接重复
为进一步仔细分析缺失特点，将感染者FOCEP、CESMO和NIPDJ的PCR产物克隆到质粒PNL4-3 BsshⅡ和xXhoⅠ位点，从5＇NCS到NEF基因片段经过缺失区域对质粒P△CESMO，P△FOCEP和P△NIPDJ进行序列分析，与HIV-1 LAI比较，3个质粒具有单基因片段缺失特征序列，在缺损连接点有短的直接重复特征(图3)。缺失范围P△CESMO为7 759个核苷酸，P△FOCEP为7 014个核苷酸，P△NIPDJ为5 394个核苷酸，直接重复片段P△ FOCEP和P△NIPDJ是3个核苷酸，P△CESMO是4个核苷酸，其余部位与HIV-1 LAI基因序列一致。
图3 缺损连接处缺损DNA病毒克隆序列
Figure 3 DNA squence of cloned defective proviruses at the deletion junction
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3 讨论
与体外感染相反，感染者PBMCs中聚集缺损基因，二者感染结果不同的主要原因很可能是免疫系统清除感染细胞产物，缺损病毒在体内聚集的可能性为他们能够避开杀伤细胞，体外培养中这种现象虽然同样能够发生，但体外培养PBMCs激活后，病毒竞争性复制，HIV-1缺损基因聚集复杂性降低，在突变水平上存在相似情况，HIV-1发育过程中体内比体外感染存在更多的不成熟病毒。
体外培养PBMCs激活后，LD-PCR扩增条带持续存在与孤立的HIV-1感染有关，缺损和完整HIV-1基因可以在未检测到病毒个体的PBMCs中查到，这可能是一种非活跃复制或是高减毒株病毒存在于这些个体的PBMCs中。体外培养时，激活的PBMCs中缺损HIV-1基因量减少，缺损和完整基因从没有检测到感染病毒激活的PBMCs中消失，与病毒竞争复制相反，缺损基因消失很可能是激活的PBMCs对缺损病毒有毒性作用，也可能是静止T细胞中大量HIV-DNA以无整合形式存在，并在细胞激活后整合到宿主基因中，即缺损基因的消失也可能是低整合效果引起，缺损基因依靠他们互补关系重新组合而恢复正常。
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基因缺失与近基因中心成正比，提示大量缺损病毒在体内通过选择拷贝机制复制，遵照这个模式，翻译过早终止，聚合酶按不成熟的线状链移到其它位点重新翻译，由于缺失DNA区域扩大，使基因中心部位缺失的可能性比外周部位缺失的可能性增加得更迅速。此外，缺损部位沿HIV-1基因部分呈现轻度不对称，缺损基因3′末端LTR(U3)序列较5′末端5′NCS序列出现率高，认为翻译终止同样可能发生在任何位点，然而，终止首先更可能发生在翻译的起点而不是终点，这种不对称与负链逆向转录从3′-5′HIV-1RNA末端单聚合酶链跳跃模式一致，聚合酶的分离也可发生在没有LTR重新开始合成和终止时，在我们实验中没有发现这种现象。这种情况在其它逆转录基因已描述[7]，我们还发现HIV-1缺损包括缺损接合处相同序列段的延长，重新合成只需要很少相同序列，目前，在缺失HIV-1基因结合处没有发现额外插入的短片段。
许多研究已证实HIV-1序列变化，但很少发现HIV-1基因大片段缺失和大范围交换，大范围缺损病毒已从人大脑组织直接克隆而不需体外培养发现，但只能分析很少分子片段。LD-PCR表明了含有两侧LTR序列完整HIV-1基因的典型分布，并可确定在病毒聚集中基因内部重新排列，帮助了解缺损病毒性质及缺损HIV与母婴传播的关系，不同组织(大脑，各级淋巴组织等)HIV-1复制变化情况，跟踪HIV-1基因逆转录不同状态等，虽然还没有发现缺损基因和病人临床状态之间存在明显的关系，但仍不失为一种非常有价值的研究。
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基金项目：法国ANRS和INSERM资助；
Jean-Claude Chermann是艾滋病/HIV-1发现者之一。
参考文献
1，Wei X, Ghost SK, Taylor ME, et al. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection[J]. Nature, 1995, 373: 117-122
2，Coffin JM. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy[J]. Science, 1995, 267: 483-489
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3，Cao Y, Qin L, Zhang L, et al. Virologic and immunologic characterization of long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection[J]. N Engl J Med, 1995, 332 : 201-208
4，Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Ray F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)[J]. Science, 1983, 220: 868-871
5，Bukrinsky MI, Sharova N, McDonald TL, et al. Association of integrase, matrix, and reverse transcriptase antigens of human immunodeficiency virus type 1 with viral nucleic acids following acute infection[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 6125-6129
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6，Sanchez G, Xu X, Chermann JC, et al. Accumulation of defective viral genomes in peripheral blood mononuclear cells of human immunodeficency virus type 1 infected individuals[J]. J Virol, 1997, 71: 2233-2240
7，Salminen MO, Koch C, Sanders-Buell E, et al. Recovery of virtually full-length HIV-1 provirus of diverse subtypes from primary virus cultures using the polymerase chain reaction[J]. Virology, 1995, 213: 80-86
(1999-06-24收稿), 百拇医药