缺氧再给氧对心肌细胞内游离钙浓度的影响
作者：朱甫祥 刘炜 王孝铭 马丽英 章顺国
单位：朱甫祥(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)；刘炜 王孝铭(河北省廊坊市管 道局中心医院手术室，河北 06500)；马丽英 章顺国(哈尔滨医科大学病理生理教研室， 哈尔滨 150086)
关键词：
中国应用生理学杂志000433
再灌注损伤是一个很复杂的病理生理现象。大量证据表明再灌注损伤或细胞死亡与细胞内的 钙超载有关。再灌注损伤发生与否和轻重程度，多认为与缺血时间的长短有关。根据我们的 研究，所谓再灌注损伤取决于缺血时间的问题。只是在一定缺血时限内有效，超过这个时限 就不存在再灌注损伤的问题。每种动物在心肌缺血再灌注损伤中都有一个由可逆向不可逆转 变的时间点，当缺血损伤达到不可逆的程度时，就无所谓再灌注损伤了。本文以成年大鼠体 外分离的心肌细胞氧反常模型，动态、定量地观察了细胞内游离钙浓度的变化，探讨了大鼠 心肌细胞氧反常变化的规律。
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1 材料与方法
(1)材料 灌流液成份与浓度：A液(mmol/L):NaCl 143.0,KCl 8.0,MgCl2 5.0,CaCl2 1. 8,Glucose 5.0,NaH2PO4 0.42,HEPES 5.0,pH7.4;B液：不含CaCl2,其他同A液；C液： B液加0.1%胶原酶和50.0 mmol/L CaCl2;D液(mmol/L):NaCl 118.0,KCl 30.0,MgCl2 0 .5,KH2PO4 10.0,Glucose 10.0谷氨酸 70.0，EGTA 0.5，BSA 2%，HEPES 10.0，pH7 .4;E液：D液中加10.0 mmol/L CaCl2。试剂：Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)；A23187(N AKARAI chemical Ltd);Fluo-3/AM(Dojin,KYOTO JAPAN);其它试剂均为国产分析纯。仪器 ：荧光分光光度计(RF-540型，日本岛津公司)。
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(2)大鼠心肌细胞的分离与实验分组 健康雄性Wistar大鼠，体重200～250 g。按Farmer的 方法加以改进体外分离心肌细胞。所分离的心肌细胞用胎盘蓝 染色杆形率达94%±2.50%。将分离得到的心肌细胞调节细胞浓度为6×105/2 ml。实验分 组如下：①对照组(持续通以95%O25%CO2，37℃温育40 min，n=11)；②缺氧10 min 组(I10 min，持续通以95%N25%CO2，37℃温育10 min，n=14)；③缺氧10 min再给 氧10 min组(I10 minR10 min，n=13);④缺氧20 min组(I20 min，n=12);⑤缺氧20 min再给氧20 min组(I20 minR20 min，n=10);⑥缺氧40 min组(I40 minR，n=11); ⑦缺氧40 min再给氧20 min组(I40 minR20 min，n=12);⑧缺氧60 min组(I60 min，n =13);⑨缺氧60 min再给氧20 min组(I60 minR20 min，n=12)。
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(3)Fluo-3/AM的负载及细胞内游离钙的测定 具体测定方法为：细胞悬液样品内加入Fluo -3/AM，37℃温育30 min后离心洗3次以除去未进入细胞的Fluo-3/AM。用单波长荧光分光 光度计先测静息状态下的荧光值(F)；加入A23187后测量最大荧光值(Fmax);最 后加入EGTA测最小荧光值(Fmin)。按下式计算细胞内游离钙浓度：
式中450为Ca2+与Fluo-3的解离常数。
2 结果
正常对照组的心肌细胞内游离钙浓度为(158.67±5.01)nmol/L，随着缺氧时间的延长，细 胞内游离钙浓度不断升高，与对照组相比，差异显著，相互比较，亦有明显差异。当再给 氧处理后，胞内游离钙浓度比单纯缺氧时更行升高，表现出明显的钙超载现象，其中以I40 minR20 min组最高[(596.71±20.29)nmol/L]。
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3 讨论
再灌注损伤是一种很复杂的病理生理现象，对于再灌注损伤的程度多认为与缺血时间长短有 关。事实上再灌注损伤的发生有其自身的规律，缺血时间固然是一个很重要的因素，但是缺 血本身亦是一种损伤因素，心肌缺血所导致的损伤一旦演变成不可逆，也就无所谓再灌注损 伤了。我们实验室根据自己的实验结果(再灌注时线粒体内钙以及儿茶酚胺含量的变化与缺 血时间的关系呈类似正态分布)表明再灌注损伤呈现反应→反应高峰→反应衰竭的规律， 提出再灌注损伤就其性质来说是细胞对应激刺激的反应，是一种适应综合征。钙超载是再灌 注损 伤的一个重要发病机制，本实验以体外分离的大鼠心肌细胞氧反常模型，通过不同时间缺氧 再给氧后细胞内游离钙的测定表明细胞内游离钙浓度表现出由低到高再到低的变化规律，进 一步证明了我们的上述设想。本实验模型的建立有赖于分离到高成活率的心肌细胞，我们在 Farmer的方法基础上，采用胶原酶一步消化法，所分离的细胞杆形率高达94%，保障了心肌 细胞氧反常模型的建立。关于细胞内钙超载的性质，研究表明实质上是线粒体内的钙超载 。 作为细胞内能量制造和储存的工厂，线粒体内大量聚集的钙抑制氧化磷酸化过程使细胞的能 量代谢发生障碍，最终导致细胞的死亡。
收稿日期：1999-06-28
修回日期：1999-11-01, http://www.100md.com
单位：朱甫祥(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)；刘炜 王孝铭(河北省廊坊市管 道局中心医院手术室，河北 06500)；马丽英 章顺国(哈尔滨医科大学病理生理教研室， 哈尔滨 150086)
关键词：
中国应用生理学杂志000433
再灌注损伤是一个很复杂的病理生理现象。大量证据表明再灌注损伤或细胞死亡与细胞内的 钙超载有关。再灌注损伤发生与否和轻重程度，多认为与缺血时间的长短有关。根据我们的 研究，所谓再灌注损伤取决于缺血时间的问题。只是在一定缺血时限内有效，超过这个时限 就不存在再灌注损伤的问题。每种动物在心肌缺血再灌注损伤中都有一个由可逆向不可逆转 变的时间点，当缺血损伤达到不可逆的程度时，就无所谓再灌注损伤了。本文以成年大鼠体 外分离的心肌细胞氧反常模型，动态、定量地观察了细胞内游离钙浓度的变化，探讨了大鼠 心肌细胞氧反常变化的规律。
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1 材料与方法
(1)材料 灌流液成份与浓度：A液(mmol/L):NaCl 143.0,KCl 8.0,MgCl2 5.0,CaCl2 1. 8,Glucose 5.0,NaH2PO4 0.42,HEPES 5.0,pH7.4;B液：不含CaCl2,其他同A液；C液： B液加0.1%胶原酶和50.0 mmol/L CaCl2;D液(mmol/L):NaCl 118.0,KCl 30.0,MgCl2 0 .5,KH2PO4 10.0,Glucose 10.0谷氨酸 70.0，EGTA 0.5，BSA 2%，HEPES 10.0，pH7 .4;E液：D液中加10.0 mmol/L CaCl2。试剂：Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)；A23187(N AKARAI chemical Ltd);Fluo-3/AM(Dojin,KYOTO JAPAN);其它试剂均为国产分析纯。仪器 ：荧光分光光度计(RF-540型，日本岛津公司)。
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(2)大鼠心肌细胞的分离与实验分组 健康雄性Wistar大鼠，体重200～250 g。按Farmer的 方法加以改进体外分离心肌细胞。所分离的心肌细胞用胎盘蓝 染色杆形率达94%±2.50%。将分离得到的心肌细胞调节细胞浓度为6×105/2 ml。实验分 组如下：①对照组(持续通以95%O25%CO2，37℃温育40 min，n=11)；②缺氧10 min 组(I10 min，持续通以95%N25%CO2，37℃温育10 min，n=14)；③缺氧10 min再给 氧10 min组(I10 minR10 min，n=13);④缺氧20 min组(I20 min，n=12);⑤缺氧20 min再给氧20 min组(I20 minR20 min，n=10);⑥缺氧40 min组(I40 minR，n=11); ⑦缺氧40 min再给氧20 min组(I40 minR20 min，n=12);⑧缺氧60 min组(I60 min，n =13);⑨缺氧60 min再给氧20 min组(I60 minR20 min，n=12)。
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(3)Fluo-3/AM的负载及细胞内游离钙的测定 具体测定方法为：细胞悬液样品内加入Fluo -3/AM，37℃温育30 min后离心洗3次以除去未进入细胞的Fluo-3/AM。用单波长荧光分光 光度计先测静息状态下的荧光值(F)；加入A23187后测量最大荧光值(Fmax);最 后加入EGTA测最小荧光值(Fmin)。按下式计算细胞内游离钙浓度：
式中450为Ca2+与Fluo-3的解离常数。
2 结果
正常对照组的心肌细胞内游离钙浓度为(158.67±5.01)nmol/L，随着缺氧时间的延长，细 胞内游离钙浓度不断升高，与对照组相比，差异显著，相互比较，亦有明显差异。当再给 氧处理后，胞内游离钙浓度比单纯缺氧时更行升高，表现出明显的钙超载现象，其中以I40 minR20 min组最高[(596.71±20.29)nmol/L]。
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3 讨论
再灌注损伤是一种很复杂的病理生理现象，对于再灌注损伤的程度多认为与缺血时间长短有 关。事实上再灌注损伤的发生有其自身的规律，缺血时间固然是一个很重要的因素，但是缺 血本身亦是一种损伤因素，心肌缺血所导致的损伤一旦演变成不可逆，也就无所谓再灌注损 伤了。我们实验室根据自己的实验结果(再灌注时线粒体内钙以及儿茶酚胺含量的变化与缺 血时间的关系呈类似正态分布)表明再灌注损伤呈现反应→反应高峰→反应衰竭的规律， 提出再灌注损伤就其性质来说是细胞对应激刺激的反应，是一种适应综合征。钙超载是再灌 注损 伤的一个重要发病机制，本实验以体外分离的大鼠心肌细胞氧反常模型，通过不同时间缺氧 再给氧后细胞内游离钙的测定表明细胞内游离钙浓度表现出由低到高再到低的变化规律，进 一步证明了我们的上述设想。本实验模型的建立有赖于分离到高成活率的心肌细胞，我们在 Farmer的方法基础上，采用胶原酶一步消化法，所分离的细胞杆形率高达94%，保障了心肌 细胞氧反常模型的建立。关于细胞内钙超载的性质，研究表明实质上是线粒体内的钙超载 。 作为细胞内能量制造和储存的工厂，线粒体内大量聚集的钙抑制氧化磷酸化过程使细胞的能 量代谢发生障碍，最终导致细胞的死亡。
收稿日期：1999-06-28
修回日期：1999-11-01, http://www.100md.com