NO与小鼠病毒性心肌炎发生发展的关系
作者：黄志刚 曾宪惠 周令望 钟学宽 于维汉
单位：黄志刚(中国人民解放军305医院 老年病研究中心，北京 100017)；曾宪惠 周令望 钟学宽 于维汉(哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：一氧化氮；病毒；心肌炎；凋亡；潜伏感染
中国地方病学杂志000504 [摘要] 目的 探讨NO在小鼠病毒性心肌炎发生发展中的作用。方法 建立柯萨奇病毒B3(CVB3)病毒性心肌炎BALB/C小鼠模型及BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞(Mф)培养体系。酶法测定小鼠心肌及Mф分泌NO含量；免疫组化法检测心肌iNOS；微量滴定法测定心肌内感染性病毒；RT-PCR法检测心肌病毒RNA；TUNEL法检测凋亡细胞；光镜、电镜检查心肌损伤状况。结果 ①小鼠心肌内 NO于CVB3感染后7～30 d持续增高，与正常组比较差异有显著意义，P<0.01。iNOS感染急性期高表达、慢性期低表达。正常组无表达。②CVB3可诱导Mф产生高浓度的NO，并于24 h内呈持续性增高。③CVB3于心肌炎急性期后建立了无感染性病毒复制的潜伏感染状态。④凋亡参与了心肌炎的发生发展过程。结论 NO参与了病毒性心肌炎的发生发展过程，并在致心肌细胞坏死及凋亡、清除或抑制病毒、维持CVB3呈潜伏感染状态方面起重要作用。
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[中图分类号] R373.2+3 [文献标识码] A [文章编号]1000-4955(2000)05-330-03
Relationship between nitric oxide and the development of viral myocarditis in mice
HUANG Zhi-gang，ZENG Xian-hui，ZHOU Ling-wang，et al
(PLA 305th Hospital Genealogy Research Center,Beijing 100017,China)
Abstract：Objective To study the effect of Nitric Oxide (NO) on the pathogenesis of viral myocarditis in mice.Methods To determine the content of NO secreted by mice cardiac muscle and Mф by enzymatic method;iNOS by immunohistochemical technique;infectious virus by minimtitration method;cardiac muscle virus RNA by RT-PCR;apoptosis by TDT/Dutp Nick End Labeling (TUNEL).Results ①The concentration of NO inside cardiac muscle kept rising during 7～30 days after infection by CVB3,significant difference was found when compared with the normal group (P<0.01).Higher expression of iNOS in acute stage of infection,low expression in chronic stage and no expression in normal control group were found.②CVB3 could induce the production of higher concentration of NO,and keep rising with the time lapse within 24 hours.③CVB3 built the latent infectious situation with no infectious viral replication after acute stage of myocarditis.④Apoptosis took part in the development of myocarditis.Conclusions NO took part in the development of myocarditis and had an important role in the necrosis of cardiac muscle cell and its apoptosis,clearance or inhibition of virus and maintenance of latent infections state of the CVB3.
, 百拇医药
Key words： NO; Virus; Myocarditis; Apoptosis; Latent infection
NO是新近发现的一种自由基性质的气体生物活性分子，具有较高的脂溶性，可直接扩散进入靶细胞。在神经信息传递、心脑血管功能调节、抗感染免疫及组织损伤方面起重要作用。EMC病毒性心肌炎小鼠血中NO含量增高，其增高水平与心肌损伤程度及心功能障碍程度呈正相关[1]。CVB3是引起人类病毒性心肌炎的主要病毒，NO是否参与了CVB3病毒性心肌炎的病理损伤过程尚无报道。故建立心肌炎模型，结合病理及病毒感染状态分析，动态观测NO的变化。旨在探讨NO在CVB3病毒性心肌炎发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型的建立 4～5周龄雄性BALB/C小鼠(白求恩医科大学实验动物部提供)随机分为2组。感染组(64只)腹腔接种0.1 ml 100TCID50CVB3病毒液(哈尔滨医科大学克山病研究所保存)；正常组(32只)腹腔接种等量的RPMI 1640病毒培养液。于病毒接种第7、14、30、90 d分批随机取鼠，无菌解剖取心脏用于相关检查。
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1.2 常规心肌组织检查 用光学显微镜、电子显微镜检查。
1.3 心肌匀浆的制备 无菌取部分小鼠心脏，微量电子天秤称重，按0.1 g/ml比例加生理盐水，在无菌的研磨器中制成匀浆，1 000 r/min离心10 min，取上清以每份0.12 ml分装-70℃冰箱冻存。
1.4 Mф的培养及感染 无菌取BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞，常规制备4×106/ml单细胞悬液，加入24孔平底组织培养板中(1 ml/孔)，并分为2组。感染组每孔加0.2 ml 100 TCID50的CVB3病毒液，正常组加病毒培养液0.2 ml。培养箱中吸附洗涤后，加1 ml/孔无血清培养液继续培养，测定0、2、12、24 h上清中NO含量。
1.5 酶法测定NO 取心肌匀浆上清及Mф培养上清，按深圳晶美生物工程有限公司提供的试剂盒方法检测NO。
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1.6 iNOS的检测 按北京中山生物工程有限公司提供的试剂盒方法，进行心肌组织内iNOS定性定位检查。显微镜检查阳性者胞浆呈淡棕色染色，阴性者胞浆不被染色。
1.7 心肌内感染性病毒滴度测定 采用常规微量滴定法。
1.8 RT-PCR方法检测心肌CVB3RNA 按北京天象人公司提供的试剂盒方法检测，扩增产物于2%琼脂糖凝胶上电泳后判断结果，出现300 bp的片段为阳性结果。
1.9 TUNEL法检测凋亡细胞 按美国Oncon公司生产的试剂盒方法检测。凋亡细胞DAB染色成棕褐色，正常细胞甲基绿染成淡绿色。
1.10 统计学分析 标本均数的比较用t检验。数据以(x±s)表示。
2 结果
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2.1 组织病理学 光学显微镜检查：正常组小鼠心肌未见病理损伤。感染组第7 d时心肌损伤检出率达100%，损伤最重，随后病变检出率逐渐降低，损伤减轻。病变主要位于心外膜下及血管周围，多呈灶状分布，甚至呈大片状。急性期病变主要为变性坏死、炎细胞浸润。慢性期可见钙化及心肌纤维化改变。电子显微镜检查：病变处除可见细胞坏死征象外，各时间内均可见典型的凋亡样改变。表现为细胞核变小，染色质浓缩边集呈环状或半月状，而细胞器无显著变化，偶有线粒体肿胀，结果见表1。 表1 不同时间感染组各项指标心肌检测结果 时间(h)
VMC
iNOS
凋亡细胞
病毒分离
CVB3RNA(+)
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7
14
30
90
7/7
6/7
4/7
1/7
6/7
5/7
4/7
1/7
5/7
, 百拇医药 7/7
3/7
1/7
7/7
2/7
0/5
3/3
4/4
4/4
4/4
注：各项指标的比值为阳性数/受检数
2.2 NO及iNOS的检测 感染组小鼠心肌NO含量于第7 d至第30 d显著高于对照组(P<0.01)，第90 d时降为正常，并呈逐渐降低趋势。感染组心肌内iNOS自第7～90 d均可见iNOS表达，7～14 d时高表达，随后呈下降趋势。正常组心肌内无iNOS表达。CVB3可诱导Mф产生高浓度的NO，并于24 h内呈持续性增高与正常组比较差异有显著意义(P<0.001)，见表2。
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表2 感染组小鼠心肌NO检测结果 心肌NO含量
CVB3诱导Mф分泌NO
时间(d)
正常组
(μmol/L)
感染组
(μmol/L)
时间
(h)
NO含量
(μmol/L)
7
, 百拇医药
14
30
90
15.28±4.99
11.20±5.69
13.60±2.21
10.70±2.08
50.83±6.36**
28.57±6.54**
27.24±6.94**
9.84±4.92
, 百拇医药
0
2
12
24
44.19±2.33
69.76±2.33*
72.87±2.68*
86.82±9.68*
注：*与Oh比较P<0.001;**与正常组比较P<0.01
2.3 心肌内感染性CVB3及CVB3RNA的检测 正常组心肌内未见感染性病毒及病毒RNA存在。感染组7 d时心肌内100%存在感染性病毒，第14 d仅2例阳性，第30 d、90 d均为阴性。而病毒RNA可于心肌内持续存在90 d之久。结果如表1，图1。
, 百拇医药
图1 小鼠心肌CVB3RNA RT-PCR结果
1、2、3对照组心肌(PCR阴性)；4阳性对照；5标准分子量，6、7、8、9、10分别为感染CVB3 第3、7、14、30、90 d心肌(PCR阳性)
2.4 细胞凋亡的检测(TUNEL法) 感染组70%小鼠心肌TUNEL阳性表达，主要分布在心肌内外膜下及病灶周围。感染14 d时心肌内100%存在TUNEL阳性细胞，90 d时仍有1例呈阳性改变(表1)。
3 讨论
正常心肌组织中广泛存在内皮型NOS(eNOS)，不含诱导型NOS(iNOS)，但在炎性细胞因子等诱导下仍可产生iNOS[2]。可见心肌内存在产生NO的组织学基础。利用酶法检测发现：小鼠心肌内NO含量自感染CVB3第7 d至第30 d明显增高(P<0.01)，并呈逐渐降低趋势，90 d时恢复正常。iNOS于感染组小鼠心肌细胞及内皮细胞表达，支持心肌NO测定结果。受病毒攻击的小鼠腹腔Mф亦可产生高浓度的NO。表明心肌内增高的NO除来自CVB3感染的心肌组织外，尚可来自炎症区浸润的Mф或其它部位的Mф分泌的NO，最终使心肌内NO蓄积增多，发挥其广泛的生物效应。
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在心肌炎急性期，心肌病理损伤严重，可见大量坏死心肌细胞。于坏死区周边亦可见许多凋亡细胞。此时心肌iNOS表达增强，NO显著增加，C-myc表达增强[3]。表明NO参与了急性心肌炎的病理损伤过程。推测NO抑制了与能量代谢、抗氧化损伤及DNA合成有关酶的活性，干扰了细胞能量代谢、DNA合成以及自由基的清除等，使细胞发生坏死或凋亡[4]。
急性期后，心肌内炎细胞浸润减少或消失的同时，感染性病毒消失。但以RT-PCR方法仍可于心肌内检测到病毒RNA。表明急性期后CVB3于心肌内建立了无感染性病毒复制的潜伏感染状态。而此时心肌的NO仍增高至30 d，30 d后酶法检测阴性时，免疫组化法仍可于心肌内检测到iNOS表达。而以RT-PCR方法于慢性心肌炎后心肌病心肌组织中仍可检测到iNOS mRNA[5]。从而可以推测NO在抑制CVB3复制,促使CVB3改变其感染特性，形成持续感染状态，并在一定条件下，通过细胞凋亡作用清除残存的潜伏感染病毒等方面起重要作用。慢性期心肌细胞凋亡之检出率逐渐减少的趋势似亦支持此论点。但必须于凋亡细胞中检测到CVB3RNA，并做定量PCR检测CVB3RNA含量，才能真正证明此论点，有待于今后的进一步研究。
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[基金来源]黑龙江省自然科学基金(D 9718)
[作者简介]黄志刚(1963-)，男，主治医师，博士。
[参考文献]
[1] 松森昭.サイトカインと心不全[J].医学のあゆみ，1990,177(6):431-434.
[2] Oddis CV,Finkel MS.NF-kappa B and GTP cyclohydrolase regulate cytokine-induced nitric oxide production by cardiac myocytes[J].Am J Physiol,1996,270(5 Pt 2):H1864-H1868.
[3] 钱素娟，曾宪惠，于维汉.细胞凋亡与小鼠病毒性心肌炎发生发展的关系[J].中国地方病学杂志，1997，10(4)：203-206.
, 百拇医药
[4] Asahi M,Fujii J,Suzuki K,et al.Inactivation of glutathione peroxidase by nitric oxide.Implication for cytotoxicity[J].J Biol Chem,1995,270(36):21035-21039.
[5] 佐藤えい，平盛かち彦，田树元，他.ウイルス性心筋炎かろかくちよづ型心筋症ヘのか程におけゐアポトシス[J].日本临床，1996，54(7)：1982-1985.
[收稿日期]1999-10-22
[修订日期]2000-02-01, 百拇医药
单位：黄志刚(中国人民解放军305医院 老年病研究中心，北京 100017)；曾宪惠 周令望 钟学宽 于维汉(哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：一氧化氮；病毒；心肌炎；凋亡；潜伏感染
中国地方病学杂志000504 [摘要] 目的 探讨NO在小鼠病毒性心肌炎发生发展中的作用。方法 建立柯萨奇病毒B3(CVB3)病毒性心肌炎BALB/C小鼠模型及BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞(Mф)培养体系。酶法测定小鼠心肌及Mф分泌NO含量；免疫组化法检测心肌iNOS；微量滴定法测定心肌内感染性病毒；RT-PCR法检测心肌病毒RNA；TUNEL法检测凋亡细胞；光镜、电镜检查心肌损伤状况。结果 ①小鼠心肌内 NO于CVB3感染后7～30 d持续增高，与正常组比较差异有显著意义，P<0.01。iNOS感染急性期高表达、慢性期低表达。正常组无表达。②CVB3可诱导Mф产生高浓度的NO，并于24 h内呈持续性增高。③CVB3于心肌炎急性期后建立了无感染性病毒复制的潜伏感染状态。④凋亡参与了心肌炎的发生发展过程。结论 NO参与了病毒性心肌炎的发生发展过程，并在致心肌细胞坏死及凋亡、清除或抑制病毒、维持CVB3呈潜伏感染状态方面起重要作用。
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[中图分类号] R373.2+3 [文献标识码] A [文章编号]1000-4955(2000)05-330-03
Relationship between nitric oxide and the development of viral myocarditis in mice
HUANG Zhi-gang，ZENG Xian-hui，ZHOU Ling-wang，et al
(PLA 305th Hospital Genealogy Research Center,Beijing 100017,China)
Abstract：Objective To study the effect of Nitric Oxide (NO) on the pathogenesis of viral myocarditis in mice.Methods To determine the content of NO secreted by mice cardiac muscle and Mф by enzymatic method;iNOS by immunohistochemical technique;infectious virus by minimtitration method;cardiac muscle virus RNA by RT-PCR;apoptosis by TDT/Dutp Nick End Labeling (TUNEL).Results ①The concentration of NO inside cardiac muscle kept rising during 7～30 days after infection by CVB3,significant difference was found when compared with the normal group (P<0.01).Higher expression of iNOS in acute stage of infection,low expression in chronic stage and no expression in normal control group were found.②CVB3 could induce the production of higher concentration of NO,and keep rising with the time lapse within 24 hours.③CVB3 built the latent infectious situation with no infectious viral replication after acute stage of myocarditis.④Apoptosis took part in the development of myocarditis.Conclusions NO took part in the development of myocarditis and had an important role in the necrosis of cardiac muscle cell and its apoptosis,clearance or inhibition of virus and maintenance of latent infections state of the CVB3.
, 百拇医药
Key words： NO; Virus; Myocarditis; Apoptosis; Latent infection
NO是新近发现的一种自由基性质的气体生物活性分子，具有较高的脂溶性，可直接扩散进入靶细胞。在神经信息传递、心脑血管功能调节、抗感染免疫及组织损伤方面起重要作用。EMC病毒性心肌炎小鼠血中NO含量增高，其增高水平与心肌损伤程度及心功能障碍程度呈正相关[1]。CVB3是引起人类病毒性心肌炎的主要病毒，NO是否参与了CVB3病毒性心肌炎的病理损伤过程尚无报道。故建立心肌炎模型，结合病理及病毒感染状态分析，动态观测NO的变化。旨在探讨NO在CVB3病毒性心肌炎发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型的建立 4～5周龄雄性BALB/C小鼠(白求恩医科大学实验动物部提供)随机分为2组。感染组(64只)腹腔接种0.1 ml 100TCID50CVB3病毒液(哈尔滨医科大学克山病研究所保存)；正常组(32只)腹腔接种等量的RPMI 1640病毒培养液。于病毒接种第7、14、30、90 d分批随机取鼠，无菌解剖取心脏用于相关检查。
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1.2 常规心肌组织检查 用光学显微镜、电子显微镜检查。
1.3 心肌匀浆的制备 无菌取部分小鼠心脏，微量电子天秤称重，按0.1 g/ml比例加生理盐水，在无菌的研磨器中制成匀浆，1 000 r/min离心10 min，取上清以每份0.12 ml分装-70℃冰箱冻存。
1.4 Mф的培养及感染 无菌取BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞，常规制备4×106/ml单细胞悬液，加入24孔平底组织培养板中(1 ml/孔)，并分为2组。感染组每孔加0.2 ml 100 TCID50的CVB3病毒液，正常组加病毒培养液0.2 ml。培养箱中吸附洗涤后，加1 ml/孔无血清培养液继续培养，测定0、2、12、24 h上清中NO含量。
1.5 酶法测定NO 取心肌匀浆上清及Mф培养上清，按深圳晶美生物工程有限公司提供的试剂盒方法检测NO。
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1.6 iNOS的检测 按北京中山生物工程有限公司提供的试剂盒方法，进行心肌组织内iNOS定性定位检查。显微镜检查阳性者胞浆呈淡棕色染色，阴性者胞浆不被染色。
1.7 心肌内感染性病毒滴度测定 采用常规微量滴定法。
1.8 RT-PCR方法检测心肌CVB3RNA 按北京天象人公司提供的试剂盒方法检测，扩增产物于2%琼脂糖凝胶上电泳后判断结果，出现300 bp的片段为阳性结果。
1.9 TUNEL法检测凋亡细胞 按美国Oncon公司生产的试剂盒方法检测。凋亡细胞DAB染色成棕褐色，正常细胞甲基绿染成淡绿色。
1.10 统计学分析 标本均数的比较用t检验。数据以(x±s)表示。
2 结果
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2.1 组织病理学 光学显微镜检查：正常组小鼠心肌未见病理损伤。感染组第7 d时心肌损伤检出率达100%，损伤最重，随后病变检出率逐渐降低，损伤减轻。病变主要位于心外膜下及血管周围，多呈灶状分布，甚至呈大片状。急性期病变主要为变性坏死、炎细胞浸润。慢性期可见钙化及心肌纤维化改变。电子显微镜检查：病变处除可见细胞坏死征象外，各时间内均可见典型的凋亡样改变。表现为细胞核变小，染色质浓缩边集呈环状或半月状，而细胞器无显著变化，偶有线粒体肿胀，结果见表1。 表1 不同时间感染组各项指标心肌检测结果 时间(h)
VMC
iNOS
凋亡细胞
病毒分离
CVB3RNA(+)
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7
14
30
90
7/7
6/7
4/7
1/7
6/7
5/7
4/7
1/7
5/7
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3/7
1/7
7/7
2/7
0/5
3/3
4/4
4/4
4/4
注：各项指标的比值为阳性数/受检数
2.2 NO及iNOS的检测 感染组小鼠心肌NO含量于第7 d至第30 d显著高于对照组(P<0.01)，第90 d时降为正常，并呈逐渐降低趋势。感染组心肌内iNOS自第7～90 d均可见iNOS表达，7～14 d时高表达，随后呈下降趋势。正常组心肌内无iNOS表达。CVB3可诱导Mф产生高浓度的NO，并于24 h内呈持续性增高与正常组比较差异有显著意义(P<0.001)，见表2。
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表2 感染组小鼠心肌NO检测结果 心肌NO含量
CVB3诱导Mф分泌NO
时间(d)
正常组
(μmol/L)
感染组
(μmol/L)
时间
(h)
NO含量
(μmol/L)
7
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14
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15.28±4.99
11.20±5.69
13.60±2.21
10.70±2.08
50.83±6.36**
28.57±6.54**
27.24±6.94**
9.84±4.92
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44.19±2.33
69.76±2.33*
72.87±2.68*
86.82±9.68*
注：*与Oh比较P<0.001;**与正常组比较P<0.01
2.3 心肌内感染性CVB3及CVB3RNA的检测 正常组心肌内未见感染性病毒及病毒RNA存在。感染组7 d时心肌内100%存在感染性病毒，第14 d仅2例阳性，第30 d、90 d均为阴性。而病毒RNA可于心肌内持续存在90 d之久。结果如表1，图1。
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图1 小鼠心肌CVB3RNA RT-PCR结果
1、2、3对照组心肌(PCR阴性)；4阳性对照；5标准分子量，6、7、8、9、10分别为感染CVB3 第3、7、14、30、90 d心肌(PCR阳性)
2.4 细胞凋亡的检测(TUNEL法) 感染组70%小鼠心肌TUNEL阳性表达，主要分布在心肌内外膜下及病灶周围。感染14 d时心肌内100%存在TUNEL阳性细胞，90 d时仍有1例呈阳性改变(表1)。
3 讨论
正常心肌组织中广泛存在内皮型NOS(eNOS)，不含诱导型NOS(iNOS)，但在炎性细胞因子等诱导下仍可产生iNOS[2]。可见心肌内存在产生NO的组织学基础。利用酶法检测发现：小鼠心肌内NO含量自感染CVB3第7 d至第30 d明显增高(P<0.01)，并呈逐渐降低趋势，90 d时恢复正常。iNOS于感染组小鼠心肌细胞及内皮细胞表达，支持心肌NO测定结果。受病毒攻击的小鼠腹腔Mф亦可产生高浓度的NO。表明心肌内增高的NO除来自CVB3感染的心肌组织外，尚可来自炎症区浸润的Mф或其它部位的Mф分泌的NO，最终使心肌内NO蓄积增多，发挥其广泛的生物效应。
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在心肌炎急性期，心肌病理损伤严重，可见大量坏死心肌细胞。于坏死区周边亦可见许多凋亡细胞。此时心肌iNOS表达增强，NO显著增加，C-myc表达增强[3]。表明NO参与了急性心肌炎的病理损伤过程。推测NO抑制了与能量代谢、抗氧化损伤及DNA合成有关酶的活性，干扰了细胞能量代谢、DNA合成以及自由基的清除等，使细胞发生坏死或凋亡[4]。
急性期后，心肌内炎细胞浸润减少或消失的同时，感染性病毒消失。但以RT-PCR方法仍可于心肌内检测到病毒RNA。表明急性期后CVB3于心肌内建立了无感染性病毒复制的潜伏感染状态。而此时心肌的NO仍增高至30 d，30 d后酶法检测阴性时，免疫组化法仍可于心肌内检测到iNOS表达。而以RT-PCR方法于慢性心肌炎后心肌病心肌组织中仍可检测到iNOS mRNA[5]。从而可以推测NO在抑制CVB3复制,促使CVB3改变其感染特性，形成持续感染状态，并在一定条件下，通过细胞凋亡作用清除残存的潜伏感染病毒等方面起重要作用。慢性期心肌细胞凋亡之检出率逐渐减少的趋势似亦支持此论点。但必须于凋亡细胞中检测到CVB3RNA，并做定量PCR检测CVB3RNA含量，才能真正证明此论点，有待于今后的进一步研究。
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[基金来源]黑龙江省自然科学基金(D 9718)
[作者简介]黄志刚(1963-)，男，主治医师，博士。
[参考文献]
[1] 松森昭.サイトカインと心不全[J].医学のあゆみ，1990,177(6):431-434.
[2] Oddis CV,Finkel MS.NF-kappa B and GTP cyclohydrolase regulate cytokine-induced nitric oxide production by cardiac myocytes[J].Am J Physiol,1996,270(5 Pt 2):H1864-H1868.
[3] 钱素娟，曾宪惠，于维汉.细胞凋亡与小鼠病毒性心肌炎发生发展的关系[J].中国地方病学杂志，1997，10(4)：203-206.
, 百拇医药
[4] Asahi M,Fujii J,Suzuki K,et al.Inactivation of glutathione peroxidase by nitric oxide.Implication for cytotoxicity[J].J Biol Chem,1995,270(36):21035-21039.
[5] 佐藤えい，平盛かち彦，田树元，他.ウイルス性心筋炎かろかくちよづ型心筋症ヘのか程におけゐアポトシス[J].日本临床，1996，54(7)：1982-1985.
[收稿日期]1999-10-22
[修订日期]2000-02-01, 百拇医药