抗脆弱类杆菌单克隆抗体的研制与鉴定
甘 露张雅萍 肖光夏
提 要 目的：为了获得高效价和高特异性的抗Bf抗体。方法：以脆弱类杆菌的标准株免疫BALB/C小鼠，采用杂交瘤技术选择能稳定分泌抗脆弱类杆菌的杂交瘤细胞株。结果：建立了3株稳定的杂交瘤细胞株，ELISA法测定腹水McAb效价分别为1∶6000，1∶6000和1∶12000，敏感性为102～103 cfu，与其它杆菌、梭菌无交叉反应，竞争抑制试验表明3株McAb作用于细胞表面不同的抗原决定簇。将3株单克隆抗体两两混合制成单克隆抗体池用ELISA测定其敏感性较一株单克隆抗体提高2～4倍。结论：高效价和高特异性抗脆弱类杆菌的McAb对于研究脆弱类杆菌及其引起的感染性疾病有十分重要的意义。
关键词：脆弱类杆菌 单克隆抗体 ELISA
脆弱类杆菌(Bacteroids fragilis，Bf)是引起外科感染尤其是化脓性感染最常见也是最重要的无芽胞厌氧菌[1，2]，其98%产生β-内酰胺酶[3]，因此对许多头孢类抗生素不敏感，对氨基甙类抗生素则天然耐药。本研究的目的是期望制备出高效价的抗Bf的McAb，并建立快速、简便、敏感性和特异性都较高的检测方法，为临床诊断及治疗及时提供依据，并为保护性抗体的筛选及疫苗的研制打下基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 免疫原及主要试剂
Bf标准株(ATCC 25285)购自美国ATCC公司，HRP标记的猪抗鼠IgG抗体、胎牛血清(FCS)及PEG等为华美生物工程公司产品，BALB/C小鼠由本校动物所提供，其它试剂为分析纯或化学纯。
1.2 单克隆抗体的制备
Bf经0.5%甲醛生理盐水固定，0.9%生理盐水反复清洗3次，以109 cfu/ml常规腹腔免疫BALB/C小鼠3次，融合前3 d加强免疫1次。将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下融合，HAT培养液选择性培养，采用间接ELISA法对杂交瘤培养上清进行检测筛选，经有限稀释法将阳性孔进行克隆化培养至100%孔均为阳性。扩大培养后将杂交瘤细胞接种于已腹腔注射降植烷0.5 ml一周以上的BALB/C小鼠腹腔制备腹水。
, http://www.100md.com
1.3 腹水单克隆抗体效价测定及纯化
1.3.1采用间接ELISA法测定腹水McAb效价 将Bf超声粉碎后紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以5～10 μg/ml包被酶连板，0.5%BSA-PBC封闭，加入待检样品(腹水或培养上清)，设培养液阴性对照及鼠抗Bf多抗血清的阳性对照；HRP-猪抗鼠IgG染色，ODP显色系统。
1.3.2 单克隆抗体的提纯 采用饱和硫酸胺法(ASA)对腹水IgG进行粗提。沉淀物以2/3腹水量的PBS重悬。粗提后的McAb装入透析袋，置于0.01 mol/L pH7.4的PBS液中透析，透析过的McAb，过滤除菌后分装-20℃保存备用。
1.4 McAb特性分析
1.4.1杂交瘤染色体检查 在已克隆化培养的杂交瘤细胞中加入终浓度为0.4μg/ml的秋水仙素继续培养4h，按常规方法低渗处理和固定，冰水滴片，空气干燥，Giemsa染色。干燥后封片计算染色体众数。
, http://www.100md.com
1.4.2 McAb类型测定 用羊抗鼠IgG各亚类抗血清(上海生物制品研究所)与所获腹水做琼脂免疫双向扩散。
1.4.3 McAb特异性分析 用多种杆菌及梭菌进行ELISA交叉试验。即包被相同浓度的Bf和其它各菌，再用ELISA间接法检测，同时设不包被抗原的阴性对照。
1.4.4 McAb敏感性鉴定 以Bf稀释成不同浓度(100～106 cfu/ml)的菌液进行包被，再用间接ELISA法检测。
1.4.5 McAb决定簇分析 采用竞争抑制法在包被有Bf的微孔中加入一种(稀释10倍)单抗；另一孔加入两种(稀释20倍)单抗的混合液。以间接ELISA法测定D492值。抗体之间产生的相加效应程度用相加指数(AI)表示。AI=[(2A1+2)/(A1+A2)-1]×100%，其中A1和A2表示不同单抗分别与抗原作用时的D492值，A1+2表示两种单抗混合后与抗原作用时的D492值。当AI>40%时表示两种McAb识别不同的抗原决定簇，当AI<25%时表示两种McAb识别同一抗原决定簇。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立
经Bf免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞用50%PEG常规融合法进行细胞融合，融合率78%，特异性抗体阳性率为13.4%，经有限稀释法连续克隆3次后，选出效价较高阳性率达100%的3株抗Bf的杂交瘤细胞系，命名为1G10，3H9和3G9。经冻存复苏3月后仍能稳定分泌抗体。
2.2 McAb的鉴定
2.2.1McAb腹水效价的测定 3株杂交瘤细胞系腹水效价经间接ELISA法测定分别为1∶6000，1∶12000和1∶6000。纯化后蛋白含量测定抗体浓度5～10 mg/ml。
2.2.2 杂交瘤细胞染色体检查 3株(1G10、3H9和3G9)克隆细胞株的染色体众数分别为87，92，93，大多为端着丝点染色体，并有中部着丝点和亚中部着丝点的染色体。
, 百拇医药
2.2.3 McAb亚类鉴定 用琼脂免疫双向扩散测得3株McAb亚类为1G10和3H9属IgG1，3G9为IgG2a。
2.2.4 McAb特异性鉴定 以变形杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、产气荚膜杆菌、厌氧性链球菌、产黑类杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、白色念珠菌等包被，常规间接ELISA法检测，未发现有交叉反应孔。
2.2.5 McAb敏感性鉴定 1G10、3H9和3G9的敏感性分别为4×102、2×102、4×102cfu，任何两种单抗混合后敏感性为(1～2)×102cfu，敏感性可提高2～4倍。
2.2.6 McAb抗原决定簇的分析 竞争抑制试验表明3株McAb作用于不同的抗原决定簇，见表1。
, http://www.100md.com
表1 McAb所针对的抗原决定簇分析
1G10
3H9
3G9
1G10+3H9
1G10+3G9
3H9+3G9
D492
0.60
0.64
, http://www.100md.com
0.61
0.86
0.88
0.89
AI
38.7%
40.8%
42.4%
3 讨论
脆弱类杆菌是引起外科感染尤其是化脓性感染最常见，也是最重要的无芽孢厌氧菌，尤其是脑、耳、鼻、咽喉、口腔、胸腔、腹腔、盆腔及肛周等组织的化脓性感染，80%以上的脓肿都有脆弱类杆菌参与[3～5]，可见其重要性及致病性不一般。但目前的诊断主要靠分离培养法，此法除要求有特殊设备外，在临床样本的取材、送检及培养任何一个环节疏忽都将影响检出结果，临床上也往往出现许多脓液培养阴性的情况，且所需时间较长，工作较繁琐，不能及时为临床治疗提供细菌学依据。近年来，国内外学者在这方面也作大量的工作，如采用气相色谱法、多抗免疫萤光及酶标染色法，DNA探针、PCR等[1，6～8]。但上述各法均有优缺点，多抗免疫荧光及酶标染色法敏感性较高，但非特异性也强，气相色谱法及PCR特异性很高，但假阳性也不少，且设备昂贵，技术操作要求十分严格，不宜推广，本研究就是希望能找到一种不但快速、简便，而且特异性和敏感性都很高的方法。在实验中我们发现将不同抗原决定簇的单抗混在一起制成McAb池，不但不影响其特异性，且McAb池的敏感性也较单一的McAb抗体提高了2～4倍，有明显的放大效应，总之该实验研究为Bf的基础与临床研究提供了高度特异性的抗体，对Bf感染的快速诊断、治疗及预防(疫苗的研制)将有十分重要的意义。
, 百拇医药
*全军“九五”攻关项目，No.96L042
**甘 露，男，39岁，主治医师，讲师，博士
作者单位：甘 露张雅萍 肖光夏 第三军医大学附属西南医院烧伤研究所 重庆，400038
参考文献
1 Tsarev V N, Iastrebova N E, Vaneeva N P, et al. The use of immunoenzyme analysis for diagnosis of an anaerobic infection of the maxillofacial area. Stomatologiia-Mosk,1995,74(1):38
2 Vazguez F, Mendez F J, Perez F, et al. Anaerobie bacteremia in general hospital-a retrospective five-year analysis. Rev Infect Dis,1987,9(5):1038
, 百拇医药
3 上野一惠.厌氧菌的分离频度与分离菌种.临床科学，1986，22(2)：322
4 张雅萍，肖光夏，秦孝健.烧伤厌氧菌感染的探索.中华外科杂志，1991，29(4)：240
5 吕文和，刘蓬蓬，张 军，等.腹腔内感染标本厌氧菌培养结果分析.临床检验杂志，1993，11(1)：27
6 Alvarez M, Rojo P, Latorre M, et al. Diagnosis of anaerobic infection of the pleural fluid using gas-liquid chromatography. Enferm Infect Microbiol Clin,1993,11(2):84
7 Kuritza A P, Getty C E, Shaughnessy P, et al. DNA probe for identification clinically important bacteroides species. J Clin Microbiol,1986,23(2):343
8 Yamashita Y, Kohno S, Koga H, et al. Detection of bacteroides fragilis in clinical specimens by PCR. J Clin Microbiol,1994,32(2):679, 百拇医药(甘 露张雅萍 肖光夏)
提 要 目的：为了获得高效价和高特异性的抗Bf抗体。方法：以脆弱类杆菌的标准株免疫BALB/C小鼠，采用杂交瘤技术选择能稳定分泌抗脆弱类杆菌的杂交瘤细胞株。结果：建立了3株稳定的杂交瘤细胞株，ELISA法测定腹水McAb效价分别为1∶6000，1∶6000和1∶12000，敏感性为102～103 cfu，与其它杆菌、梭菌无交叉反应，竞争抑制试验表明3株McAb作用于细胞表面不同的抗原决定簇。将3株单克隆抗体两两混合制成单克隆抗体池用ELISA测定其敏感性较一株单克隆抗体提高2～4倍。结论：高效价和高特异性抗脆弱类杆菌的McAb对于研究脆弱类杆菌及其引起的感染性疾病有十分重要的意义。
关键词：脆弱类杆菌 单克隆抗体 ELISA
脆弱类杆菌(Bacteroids fragilis，Bf)是引起外科感染尤其是化脓性感染最常见也是最重要的无芽胞厌氧菌[1，2]，其98%产生β-内酰胺酶[3]，因此对许多头孢类抗生素不敏感，对氨基甙类抗生素则天然耐药。本研究的目的是期望制备出高效价的抗Bf的McAb，并建立快速、简便、敏感性和特异性都较高的检测方法，为临床诊断及治疗及时提供依据，并为保护性抗体的筛选及疫苗的研制打下基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 免疫原及主要试剂
Bf标准株(ATCC 25285)购自美国ATCC公司，HRP标记的猪抗鼠IgG抗体、胎牛血清(FCS)及PEG等为华美生物工程公司产品，BALB/C小鼠由本校动物所提供，其它试剂为分析纯或化学纯。
1.2 单克隆抗体的制备
Bf经0.5%甲醛生理盐水固定，0.9%生理盐水反复清洗3次，以109 cfu/ml常规腹腔免疫BALB/C小鼠3次，融合前3 d加强免疫1次。将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下融合，HAT培养液选择性培养，采用间接ELISA法对杂交瘤培养上清进行检测筛选，经有限稀释法将阳性孔进行克隆化培养至100%孔均为阳性。扩大培养后将杂交瘤细胞接种于已腹腔注射降植烷0.5 ml一周以上的BALB/C小鼠腹腔制备腹水。
, http://www.100md.com
1.3 腹水单克隆抗体效价测定及纯化
1.3.1采用间接ELISA法测定腹水McAb效价 将Bf超声粉碎后紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以5～10 μg/ml包被酶连板，0.5%BSA-PBC封闭，加入待检样品(腹水或培养上清)，设培养液阴性对照及鼠抗Bf多抗血清的阳性对照；HRP-猪抗鼠IgG染色，ODP显色系统。
1.3.2 单克隆抗体的提纯 采用饱和硫酸胺法(ASA)对腹水IgG进行粗提。沉淀物以2/3腹水量的PBS重悬。粗提后的McAb装入透析袋，置于0.01 mol/L pH7.4的PBS液中透析，透析过的McAb，过滤除菌后分装-20℃保存备用。
1.4 McAb特性分析
1.4.1杂交瘤染色体检查 在已克隆化培养的杂交瘤细胞中加入终浓度为0.4μg/ml的秋水仙素继续培养4h，按常规方法低渗处理和固定，冰水滴片，空气干燥，Giemsa染色。干燥后封片计算染色体众数。
, http://www.100md.com
1.4.2 McAb类型测定 用羊抗鼠IgG各亚类抗血清(上海生物制品研究所)与所获腹水做琼脂免疫双向扩散。
1.4.3 McAb特异性分析 用多种杆菌及梭菌进行ELISA交叉试验。即包被相同浓度的Bf和其它各菌，再用ELISA间接法检测，同时设不包被抗原的阴性对照。
1.4.4 McAb敏感性鉴定 以Bf稀释成不同浓度(100～106 cfu/ml)的菌液进行包被，再用间接ELISA法检测。
1.4.5 McAb决定簇分析 采用竞争抑制法在包被有Bf的微孔中加入一种(稀释10倍)单抗；另一孔加入两种(稀释20倍)单抗的混合液。以间接ELISA法测定D492值。抗体之间产生的相加效应程度用相加指数(AI)表示。AI=[(2A1+2)/(A1+A2)-1]×100%，其中A1和A2表示不同单抗分别与抗原作用时的D492值，A1+2表示两种单抗混合后与抗原作用时的D492值。当AI>40%时表示两种McAb识别不同的抗原决定簇，当AI<25%时表示两种McAb识别同一抗原决定簇。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立
经Bf免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞用50%PEG常规融合法进行细胞融合，融合率78%，特异性抗体阳性率为13.4%，经有限稀释法连续克隆3次后，选出效价较高阳性率达100%的3株抗Bf的杂交瘤细胞系，命名为1G10，3H9和3G9。经冻存复苏3月后仍能稳定分泌抗体。
2.2 McAb的鉴定
2.2.1McAb腹水效价的测定 3株杂交瘤细胞系腹水效价经间接ELISA法测定分别为1∶6000，1∶12000和1∶6000。纯化后蛋白含量测定抗体浓度5～10 mg/ml。
2.2.2 杂交瘤细胞染色体检查 3株(1G10、3H9和3G9)克隆细胞株的染色体众数分别为87，92，93，大多为端着丝点染色体，并有中部着丝点和亚中部着丝点的染色体。
, 百拇医药
2.2.3 McAb亚类鉴定 用琼脂免疫双向扩散测得3株McAb亚类为1G10和3H9属IgG1，3G9为IgG2a。
2.2.4 McAb特异性鉴定 以变形杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、产气荚膜杆菌、厌氧性链球菌、产黑类杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、白色念珠菌等包被，常规间接ELISA法检测，未发现有交叉反应孔。
2.2.5 McAb敏感性鉴定 1G10、3H9和3G9的敏感性分别为4×102、2×102、4×102cfu，任何两种单抗混合后敏感性为(1～2)×102cfu，敏感性可提高2～4倍。
2.2.6 McAb抗原决定簇的分析 竞争抑制试验表明3株McAb作用于不同的抗原决定簇，见表1。
, http://www.100md.com
表1 McAb所针对的抗原决定簇分析
1G10
3H9
3G9
1G10+3H9
1G10+3G9
3H9+3G9
D492
0.60
0.64
, http://www.100md.com
0.61
0.86
0.88
0.89
AI
38.7%
40.8%
42.4%
3 讨论
脆弱类杆菌是引起外科感染尤其是化脓性感染最常见，也是最重要的无芽孢厌氧菌，尤其是脑、耳、鼻、咽喉、口腔、胸腔、腹腔、盆腔及肛周等组织的化脓性感染，80%以上的脓肿都有脆弱类杆菌参与[3～5]，可见其重要性及致病性不一般。但目前的诊断主要靠分离培养法，此法除要求有特殊设备外，在临床样本的取材、送检及培养任何一个环节疏忽都将影响检出结果，临床上也往往出现许多脓液培养阴性的情况，且所需时间较长，工作较繁琐，不能及时为临床治疗提供细菌学依据。近年来，国内外学者在这方面也作大量的工作，如采用气相色谱法、多抗免疫萤光及酶标染色法，DNA探针、PCR等[1，6～8]。但上述各法均有优缺点，多抗免疫荧光及酶标染色法敏感性较高，但非特异性也强，气相色谱法及PCR特异性很高，但假阳性也不少，且设备昂贵，技术操作要求十分严格，不宜推广，本研究就是希望能找到一种不但快速、简便，而且特异性和敏感性都很高的方法。在实验中我们发现将不同抗原决定簇的单抗混在一起制成McAb池，不但不影响其特异性，且McAb池的敏感性也较单一的McAb抗体提高了2～4倍，有明显的放大效应，总之该实验研究为Bf的基础与临床研究提供了高度特异性的抗体，对Bf感染的快速诊断、治疗及预防(疫苗的研制)将有十分重要的意义。
, 百拇医药
*全军“九五”攻关项目，No.96L042
**甘 露，男，39岁，主治医师，讲师，博士
作者单位：甘 露张雅萍 肖光夏 第三军医大学附属西南医院烧伤研究所 重庆，400038
参考文献
1 Tsarev V N, Iastrebova N E, Vaneeva N P, et al. The use of immunoenzyme analysis for diagnosis of an anaerobic infection of the maxillofacial area. Stomatologiia-Mosk,1995,74(1):38
2 Vazguez F, Mendez F J, Perez F, et al. Anaerobie bacteremia in general hospital-a retrospective five-year analysis. Rev Infect Dis,1987,9(5):1038
, 百拇医药
3 上野一惠.厌氧菌的分离频度与分离菌种.临床科学，1986，22(2)：322
4 张雅萍，肖光夏，秦孝健.烧伤厌氧菌感染的探索.中华外科杂志，1991，29(4)：240
5 吕文和，刘蓬蓬，张 军，等.腹腔内感染标本厌氧菌培养结果分析.临床检验杂志，1993，11(1)：27
6 Alvarez M, Rojo P, Latorre M, et al. Diagnosis of anaerobic infection of the pleural fluid using gas-liquid chromatography. Enferm Infect Microbiol Clin,1993,11(2):84
7 Kuritza A P, Getty C E, Shaughnessy P, et al. DNA probe for identification clinically important bacteroides species. J Clin Microbiol,1986,23(2):343
8 Yamashita Y, Kohno S, Koga H, et al. Detection of bacteroides fragilis in clinical specimens by PCR. J Clin Microbiol,1994,32(2):679, 百拇医药(甘 露张雅萍 肖光夏)