扇贝多肽对淋巴细胞的保护作用和反相液相色谱分析
作者：杜卫 刘晓萍 梁惠 王玉贞 王春波
单位：杜卫 刘晓萍 梁惠 王玉贞 王春波(青岛大学医学院，青岛 266021)
关键词：多肽，淋巴细胞，免疫作用，反相液相色谱
中国海洋药物000508 摘 要 为进一步研究扇贝多肽(海洋肽，PCF)对淋巴细胞的作用及其成分。采用地塞米松(DEX)与脾脏和胸腺淋巴细胞共同培养，建立了淋巴细胞免疫抑制实验模型。并利用反相液相色谱法(RPLC)对PCF进行了分析。结果表明，DEX能显著降低脾脏和胸腺淋巴细胞的活性，DEX组吸收度值明显降低(P<0.01)；而PCF不仅能显著地减轻其对免疫细胞的抑制作用，同时还可以促进免疫细胞的活性，使DEX+PCF组吸收度值明显增高(P<0.01)。相对分子质量为800～1000D的PCF经RPLC分析含有保留时间为3.923，4.865，5.033，5.441等4个组分。实验证明，PCF对DEX引起的淋巴细胞抑制具有保护作用。
, 百拇医药
THE PROTECTIVE ACTION OF PCF ON LYMPHOCYTE AND THE ANALYSIS OF IT BY A REVERSED PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (RPLC)
Du wei Liu Xiaoping Liang Hui
(Medical college of Qingdao University, Qingdao 266021)
ABSTRACT In order to study the inhibitory function of the PCF on lymphocyte and the composition of it, the culture of the lymphocyte of spleen and thymus with DEX was used as an experimental model of inhibitory immunity for the lymphocyte. PCF was assayed by RPLC. The results showed: DEX can reduce the activities of lymphocyte in spleen and thymus, and cause a significant reduction of A value for DEX group (P<0.01) and a significant rise of A value of DEX+PCF group (P<0.01), after the analysis of the PCF (Mr=800-1000D) which has the four kind of retention time 3.923,4.865,5.033,5.441. These result indicate that PCF may be albe to protect the lymphocyte from the inhibition caused by DEX.
, 百拇医药
KEY WORDS Polypeptide, Lymphocyte, Inhibition, Reversed phase high performance liquid chromatography (RPLC)
自由基医学是近20年迅速发展而建立起来的一门新兴科学。自由基作为一个新发现的致病因子，可引起机体的衰老、老年性疾病和癌症等。因此，对氧自由基和抗氧化剂的研究，自然就成为引人注目的一个领域[1]。抗氧化剂已应用于临床并取得一定效果。因此，自海洋中寻找天然抗氧化剂意义更为突出。扇贝多肽系栉孔扇贝中提取的水溶性多肽。相对分子质量为800～1000D。我们的工作已表明扇贝多肽能有效地清除皮肤中的超氧负离子(O-2)和羟自由基(OH·)，抑制脂质过氧化，具有显著的抗皮肤老化作用[2、3]。为了进一步研究扇贝多肽对淋巴细胞的作用和扇贝多肽的成分,我们建立了DEX免疫抑制病理模型并利用反相液相色谱对扇贝多肽进行了分析。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
甲醇(色谱纯)：天津市可密欧科技有限公司，批号：990517；二甲基亚砜(DMSO)：江苏洪声化工厂，批号：951130；甲基噻唑基四唑(商品名：噻唑蓝，MTT)：Fluka公司；酶联免疫检测仪：BIO-RAD公司；扇贝多肽：中国水产科学院黄海水产研究所提供；高效液相色谱仪：Beckmamn公司，带168二级管阵检测器，125双溶剂微量泵；UV260-型紫外可见光束自动分光光度计：日本岛津。
1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞损伤病理模型的建立与PCF对淋巴细胞的保护作用
无菌小鼠脾脏和胸腺，分别剪碎后过网，利用常规方法分离淋巴细胞，制成1×109*L-1的细胞悬液，并用台盼蓝染色，观察其细胞活度[4]。将细胞悬液置入24孔培养板中，每孔1mL。分3组，每组3个复孔。第1组为对照组，加入1640培养液；第2组为地塞米松(DEX)组，加入DEX(10-9mol*L-1)；第3组为DEX+PCF组，加入DEX(10-9mol*L-1)和PCF(1%)。在加入MTT液100uL，4h后，终止培养，吸出培养上清液。对悬浮细胞，离心(1000rpm,5min)，弃去孔内的培养液。每孔加入150uL DMSO,振荡10min使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，记录结果。
, 百拇医药
1.2.2 反相液相色谱分析
1.2.2.1 色谱条件：采用Ultraphere ODS-C18(4.6mm×250mm,ID 5μm)色谱柱；检测波长：270nm；柱温：室温；进样量：5ul；流动相：甲醇和水进行梯度洗脱(表1)；流速1.0mL*min-1。
Table 1: The washing process of flowing phase Time
(min)
Methanol
(mL)
Water
(mL)
, 百拇医药 0
90
10
4
98
2
8
100
0
1.2.2.2 UV扫描条件
选择190～350nm波长对PCF溶液(0.2g*L-1)进行紫外光吸收扫描，狭缝宽度：5nm；扫描速度：200nm*min-1。
, 百拇医药
1.2.3统计处理 全部数据均以
±s表示，各组间比较采用方差分析(F检验)。
2 结果
2.1 PCF对淋巴细胞的保护作用
由表2所示，在脾淋巴细胞和胸腺淋巴细胞悬液中加入DEX后，其吸收度值(A)明显降低，与对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。而加入DEX和PCF后，其吸收度值明显增高，与对照组和DEX组比较均有极显著性差异(P<0.01)。
Table 2 The protective action of PCF on lymphocyte group
Absobance value (±s,n=3)
, 百拇医药
spleen
thymus
control group
DEX group
DEX+PCF group
0.397±0.020
0.218±0.012**
0.464±0.013**△△
0.171±0.013
0.119±0.003**
, 百拇医药 0.568±0.010**△△
**P<0.01，vs control group
△△P<0.01,vs control and DEX group
2.2 PCF的反相液相色谱
在进行反相液相色谱之前，选择190～350nm波长对PCF进行紫外吸收光谱扫描，发现在270nm波长处有一最大吸收峰。进一步用RPLC对PCF进行梯度洗脱，得到保留时间为1 ：3.923；2： 4.865；3：5.033；4：5.441的4个峰(见图1)。
Retention time (t*min-1)
, 百拇医药
Fig.1 Chromatogram of PCF
3 讨论
本实验利用MTT法检测细胞的存活和生长。MTT是一种能接受氢原子的染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸收度，可间接反映活细胞的数量和活性，它的特点是灵敏度高，重复性好，操作简便、快速，并与其它检测细胞活力的方法有良好的相关性。
有研究报道，糖皮质激素(glucocorticoid hormones, GCH) 是一种免疫抑制剂，能引起免疫器官萎缩和免疫机能的抑制，对胸腺未成熟淋巴细胞的分化起着重要的选择作用[5]。DEX等糖皮质类固醇药物具与GCH相似的作用[6]。我们采用MTT比色检测法检测PCF对免疫细胞的影响，用DEX与脾脏和胸腺淋巴细胞共同培养，发现其对淋巴细胞的活性有明显的抑制作用，建立了淋巴细胞免疫抑制病理模型。胸腺是中枢淋巴细胞器官，是培育T淋巴细胞的场所；而脾脏为周围淋巴细胞，T、B淋巴细胞受到抗原刺激后产生免疫反应的场所，因此，PCF对免疫细胞的刺激作用是广泛的。同时发现PCF能明显地减弱DEX对淋巴细胞的抑制作用，从而对淋巴细胞的活性具有促进作用。为了进一步了解PCF的功能组分，在PCF反相液相色谱中，我们采用梯度洗脱技术分离PCF，目的是为了缩短分离时间，提高分离度，改善峰形，使微量组分容易被检出，而提高检测的灵敏度。由分析结果可见，测定紫外光谱可在270nm波长处得到1个吸收峰，进一步用反相液相色谱可分离得到4个峰，且分离良好，说明PCF中尚存在着4个组分。
, 百拇医药
众所周知，HPLC具有分离效能好，分析速度快，灵敏度高，流出组分容易收集等特点[7]除了用其鉴定化合物外，尚可分离蛋白质和多肽[8]。由前所述，扇贝多肽具有抗皮肤老化的作用。但在相对分子质量为800～1000D的海洋肽中，其四个组分中究竟哪一种具有抗皮肤老化作用，或其抗皮肤老化作用最强?因此，可利用RPLC，经过半制备的方法，得到单一组分来进一步研究。
参考文献
1，Pryor WA. Free radicals in biology. New York: Academic Press, 1980:95
2，王春波，何孟泉，秦守哲，等.海洋肽的体外抗氧化作用.中国海洋药物杂志，1998，17(3)：15
3，王春波，何孟泉，秦守哲，等.海洋肽抗皮肤老化作用的实验研究.中华医学美容杂志，1998，4(4)：9
, 百拇医药
4，司徒镇强，吴军正主编.细胞培育.西安世界图书出版社，西安，1999，196
5，Rocha B, Von Boehmer H, Peripheral selection of the T-ceel repertoire. Science, 1991,251:1225
6，朱镇宇，潘景，赵群，等.地塞米松诱导裸鼠脾细胞程序性死亡的研究.中国病理生理杂志，1996，12(2)：113
7，孙毓庆.现代色谱法及其在医药中的应用.人民卫生出版社，北京，1998：140
8，夏其昌，屠红昊.蛋白质和多肽分离分析技术的一些新进展.生命的化学，1990，10(6)：34, 百拇医药
单位：杜卫 刘晓萍 梁惠 王玉贞 王春波(青岛大学医学院，青岛 266021)
关键词：多肽，淋巴细胞，免疫作用，反相液相色谱
中国海洋药物000508 摘 要 为进一步研究扇贝多肽(海洋肽，PCF)对淋巴细胞的作用及其成分。采用地塞米松(DEX)与脾脏和胸腺淋巴细胞共同培养，建立了淋巴细胞免疫抑制实验模型。并利用反相液相色谱法(RPLC)对PCF进行了分析。结果表明，DEX能显著降低脾脏和胸腺淋巴细胞的活性，DEX组吸收度值明显降低(P<0.01)；而PCF不仅能显著地减轻其对免疫细胞的抑制作用，同时还可以促进免疫细胞的活性，使DEX+PCF组吸收度值明显增高(P<0.01)。相对分子质量为800～1000D的PCF经RPLC分析含有保留时间为3.923，4.865，5.033，5.441等4个组分。实验证明，PCF对DEX引起的淋巴细胞抑制具有保护作用。
, 百拇医药
THE PROTECTIVE ACTION OF PCF ON LYMPHOCYTE AND THE ANALYSIS OF IT BY A REVERSED PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (RPLC)
Du wei Liu Xiaoping Liang Hui
(Medical college of Qingdao University, Qingdao 266021)
ABSTRACT In order to study the inhibitory function of the PCF on lymphocyte and the composition of it, the culture of the lymphocyte of spleen and thymus with DEX was used as an experimental model of inhibitory immunity for the lymphocyte. PCF was assayed by RPLC. The results showed: DEX can reduce the activities of lymphocyte in spleen and thymus, and cause a significant reduction of A value for DEX group (P<0.01) and a significant rise of A value of DEX+PCF group (P<0.01), after the analysis of the PCF (Mr=800-1000D) which has the four kind of retention time 3.923,4.865,5.033,5.441. These result indicate that PCF may be albe to protect the lymphocyte from the inhibition caused by DEX.
, 百拇医药
KEY WORDS Polypeptide, Lymphocyte, Inhibition, Reversed phase high performance liquid chromatography (RPLC)
自由基医学是近20年迅速发展而建立起来的一门新兴科学。自由基作为一个新发现的致病因子，可引起机体的衰老、老年性疾病和癌症等。因此，对氧自由基和抗氧化剂的研究，自然就成为引人注目的一个领域[1]。抗氧化剂已应用于临床并取得一定效果。因此，自海洋中寻找天然抗氧化剂意义更为突出。扇贝多肽系栉孔扇贝中提取的水溶性多肽。相对分子质量为800～1000D。我们的工作已表明扇贝多肽能有效地清除皮肤中的超氧负离子(O-2)和羟自由基(OH·)，抑制脂质过氧化，具有显著的抗皮肤老化作用[2、3]。为了进一步研究扇贝多肽对淋巴细胞的作用和扇贝多肽的成分,我们建立了DEX免疫抑制病理模型并利用反相液相色谱对扇贝多肽进行了分析。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
甲醇(色谱纯)：天津市可密欧科技有限公司，批号：990517；二甲基亚砜(DMSO)：江苏洪声化工厂，批号：951130；甲基噻唑基四唑(商品名：噻唑蓝，MTT)：Fluka公司；酶联免疫检测仪：BIO-RAD公司；扇贝多肽：中国水产科学院黄海水产研究所提供；高效液相色谱仪：Beckmamn公司，带168二级管阵检测器，125双溶剂微量泵；UV260-型紫外可见光束自动分光光度计：日本岛津。
1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞损伤病理模型的建立与PCF对淋巴细胞的保护作用
无菌小鼠脾脏和胸腺，分别剪碎后过网，利用常规方法分离淋巴细胞，制成1×109*L-1的细胞悬液，并用台盼蓝染色，观察其细胞活度[4]。将细胞悬液置入24孔培养板中，每孔1mL。分3组，每组3个复孔。第1组为对照组，加入1640培养液；第2组为地塞米松(DEX)组，加入DEX(10-9mol*L-1)；第3组为DEX+PCF组，加入DEX(10-9mol*L-1)和PCF(1%)。在加入MTT液100uL，4h后，终止培养，吸出培养上清液。对悬浮细胞，离心(1000rpm,5min)，弃去孔内的培养液。每孔加入150uL DMSO,振荡10min使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，记录结果。
, 百拇医药
1.2.2 反相液相色谱分析
1.2.2.1 色谱条件：采用Ultraphere ODS-C18(4.6mm×250mm,ID 5μm)色谱柱；检测波长：270nm；柱温：室温；进样量：5ul；流动相：甲醇和水进行梯度洗脱(表1)；流速1.0mL*min-1。
Table 1: The washing process of flowing phase Time
(min)
Methanol
(mL)
Water
(mL)
, 百拇医药 0
90
10
4
98
2
8
100
0
1.2.2.2 UV扫描条件
选择190～350nm波长对PCF溶液(0.2g*L-1)进行紫外光吸收扫描，狭缝宽度：5nm；扫描速度：200nm*min-1。
, 百拇医药
1.2.3统计处理 全部数据均以
±s表示，各组间比较采用方差分析(F检验)。2 结果
2.1 PCF对淋巴细胞的保护作用
由表2所示，在脾淋巴细胞和胸腺淋巴细胞悬液中加入DEX后，其吸收度值(A)明显降低，与对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。而加入DEX和PCF后，其吸收度值明显增高，与对照组和DEX组比较均有极显著性差异(P<0.01)。
Table 2 The protective action of PCF on lymphocyte group
Absobance value (
±s,n=3), 百拇医药
spleen
thymus
control group
DEX group
DEX+PCF group
0.397±0.020
0.218±0.012**
0.464±0.013**△△
0.171±0.013
0.119±0.003**
, 百拇医药 0.568±0.010**△△
**P<0.01，vs control group
△△P<0.01,vs control and DEX group
2.2 PCF的反相液相色谱
在进行反相液相色谱之前，选择190～350nm波长对PCF进行紫外吸收光谱扫描，发现在270nm波长处有一最大吸收峰。进一步用RPLC对PCF进行梯度洗脱，得到保留时间为1 ：3.923；2： 4.865；3：5.033；4：5.441的4个峰(见图1)。
Retention time (t*min-1)
, 百拇医药
Fig.1 Chromatogram of PCF
3 讨论
本实验利用MTT法检测细胞的存活和生长。MTT是一种能接受氢原子的染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸收度，可间接反映活细胞的数量和活性，它的特点是灵敏度高，重复性好，操作简便、快速，并与其它检测细胞活力的方法有良好的相关性。
有研究报道，糖皮质激素(glucocorticoid hormones, GCH) 是一种免疫抑制剂，能引起免疫器官萎缩和免疫机能的抑制，对胸腺未成熟淋巴细胞的分化起着重要的选择作用[5]。DEX等糖皮质类固醇药物具与GCH相似的作用[6]。我们采用MTT比色检测法检测PCF对免疫细胞的影响，用DEX与脾脏和胸腺淋巴细胞共同培养，发现其对淋巴细胞的活性有明显的抑制作用，建立了淋巴细胞免疫抑制病理模型。胸腺是中枢淋巴细胞器官，是培育T淋巴细胞的场所；而脾脏为周围淋巴细胞，T、B淋巴细胞受到抗原刺激后产生免疫反应的场所，因此，PCF对免疫细胞的刺激作用是广泛的。同时发现PCF能明显地减弱DEX对淋巴细胞的抑制作用，从而对淋巴细胞的活性具有促进作用。为了进一步了解PCF的功能组分，在PCF反相液相色谱中，我们采用梯度洗脱技术分离PCF，目的是为了缩短分离时间，提高分离度，改善峰形，使微量组分容易被检出，而提高检测的灵敏度。由分析结果可见，测定紫外光谱可在270nm波长处得到1个吸收峰，进一步用反相液相色谱可分离得到4个峰，且分离良好，说明PCF中尚存在着4个组分。
, 百拇医药
众所周知，HPLC具有分离效能好，分析速度快，灵敏度高，流出组分容易收集等特点[7]除了用其鉴定化合物外，尚可分离蛋白质和多肽[8]。由前所述，扇贝多肽具有抗皮肤老化的作用。但在相对分子质量为800～1000D的海洋肽中，其四个组分中究竟哪一种具有抗皮肤老化作用，或其抗皮肤老化作用最强?因此，可利用RPLC，经过半制备的方法，得到单一组分来进一步研究。
参考文献
1，Pryor WA. Free radicals in biology. New York: Academic Press, 1980:95
2，王春波，何孟泉，秦守哲，等.海洋肽的体外抗氧化作用.中国海洋药物杂志，1998，17(3)：15
3，王春波，何孟泉，秦守哲，等.海洋肽抗皮肤老化作用的实验研究.中华医学美容杂志，1998，4(4)：9
, 百拇医药
4，司徒镇强，吴军正主编.细胞培育.西安世界图书出版社，西安，1999，196
5，Rocha B, Von Boehmer H, Peripheral selection of the T-ceel repertoire. Science, 1991,251:1225
6，朱镇宇，潘景，赵群，等.地塞米松诱导裸鼠脾细胞程序性死亡的研究.中国病理生理杂志，1996，12(2)：113
7，孙毓庆.现代色谱法及其在医药中的应用.人民卫生出版社，北京，1998：140
8，夏其昌，屠红昊.蛋白质和多肽分离分析技术的一些新进展.生命的化学，1990，10(6)：34, 百拇医药