模数转换技术在骨骼肌肌浆网形态功能研究中的应用
雷长海 龚华礼 杨勇骥
摘 要 目的：利用模数转换技术进行骨骼肌肌浆网确定时间内功能形态变化的研究。方法：采用双向红外线探测器、模数转换卡、计算机和Reichert Jung KF-80快速冷冻仪组成计算机控制的电刺激超低温快速冷冻固定系统，在蟾蜍骨骼肌兴奋-收缩偶联变化的瞬间，实时测定功能变化经历的精确时间。结果：测量得到骨骼肌肌浆网功能变化的0.8，5.6，8.4 ms时间间隔，并同步获得骨骼肌肌浆网的超微结构形态图像。结论：计算机模数转换技术控制电刺激超低温快速固定技术有效地实现了生物学中功能形态瞬时变化的同步研究。
关键词：模数转换技术 骨骼肌 功能形态
肌组织兴奋-收缩偶联发生时的变化时相极快，达到毫秒级，因此采用常规化学固定方法(固定时间以分钟计)无法保留肌组织兴奋-收缩偶联发生瞬间的超微结构形态及离子浓度的变化，这是目前在肌组织兴奋-收缩偶联研究领域中的最大难题[1]。
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国外从90年代初提出毫秒级实时处理与超低温快速冷冻固定相结合，进行在已知时间段内细胞生理功能变化时的超微结构形态的系统研究[2,3]。但始终无法解决的是：如何在已知的毫秒级水平上，控制超低温快速冷冻固定，使固定与细胞功能变化同步，进而获得在功能变化时的有关形态学数据。国内到目前为止尚无有关毫秒级实时处理细胞功能变化时的超微结构形态及组分变化研究的报道。
我们采用双向红外线探测器、模数转换卡、计算机和Reichert Jung KF-80快速冷冻仪组成计算机控制的电刺激-超低温快速冷冻固定系统，用于从毫秒级变化的水平研究骨骼肌组织兴奋-收缩偶联发生时肌浆网的形态功能变化。
1 方法和结果
1.1 系统结构与设计 本系统作为一个利用计算机控制的生物信号处理系统，其重要的功能是通过计算机监视、获取、控制肌组织兴奋-收缩偶联发生瞬间的生理参数。
, 百拇医药
首先，利用传感器(Transducer)获取双向红外线探测器产生的脉冲信号并转换成电信号(mV-μV)，由量程放大器放大至模数转换卡的信号输入范围，低通滤波器压低干扰，增加信噪比，通过采样-保持电路进行A/D转换，进入计算机。计算机进行信号实时定位。整个系统结构如图1所示：
图 1 系统设计示意图
Fig 1 System design's sketch map
在实验中，我们以5 V电压为输入电压，选用逐次逼近式电路，自行设计开发了计算机模数转换卡。选用A/D 574JD作为主芯片，它是12位逐次逼近式单片A/D转换器，内含DAC、参考电压、比较器、逐次逼近寄存器SAR 和三态输出缓冲器，转换时间为25 μs。该计算机模数转换卡具备较高的精度和较快的转换速度，可以满足电刺激-超低温快速冷冻固定计算机实时处理的毫秒级响应要求[4]。
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系统软件利用80486汇编语言和C语言编写，其中采样程序用汇编语言编写，软件界面和数据处理程序用C语言编写。
1.2 操作和结果 利用上述系统对蟾蜍骨骼肌组织实施电脉冲刺激，刺激参数为：单触发；脉冲触发电位：2 V；波宽：0.2 ms。在肌组织受激发产生兴奋-收缩偶联变化的各功能时间段内，对其进行超低温快速冷冻固定，实时测定其功能变化的经历时间，并获得骨骼肌肌浆网超微结构形态变化,与静息后处于舒张状态的肌组织比较得到以下几点实验结果[1]：(1)在骨骼肌兴奋-收缩偶联变化时，观察发现存在两种不同的肌浆网结构，即三联管结构和三层的膜结构，经铅-铀染色发现肌浆网前端有致密的颗粒物质。当兴奋-收缩偶联变化发生的瞬间约10 ms的潜伏期内，该内容物发生位移，其位移方向朝T管，而在偶联变化结束后，又恢复至原中心位置。(2)骨骼肌在电刺激后0.8,5.6,8.4 ms时均发现肌浆网近T管端产生两个孔样结构，而在骨骼肌处于完全舒张时肌浆网并无此形态结构。(3)骨骼肌在电刺激兴奋-收缩偶联变化发生后约10 ms
, 百拇医药
的潜伏期内，从结构形态上似乎还未观察到肌丝开始收缩，骨骼肌组织I带宽度基本与舒张时I带宽度相同，10 ms后的收缩期内，可以观察到骨骼肌肌膜明显变窄，并发生去极化现象，在骨骼肌完全舒张时，观察其超微结构形态发现骨骼肌肌膜增宽。
2 讨 论
肌组织受到电刺激将发生兴奋-收缩偶联变化。生理学实验提供了肌组织兴奋-收缩偶联的功能时间变化段，即受激后<10 ms为潜伏期，10～60 ms为收缩期，>60 ms为舒张期。但是，肌组织在兴奋-收缩偶联变化的各功能时间段内的结构变化怎样,肌浆网变化如何,对其进行功能形态的同步研究是细胞生物学及生物物理学中极感兴趣的课题之一。虽然研究已进行了100多年，但始终不能对其收缩机制有一定论。随着超低温快速冷冻固定技术和计算机技术的发展，从形态学角度证实兴奋-收缩偶联发生的机制是可能的，也是必须的。我们研制的计算机控制电刺激超低温快速冷冻固定系统，便是利用计算机模数转换技术和超低温快速冷冻固定技术对电刺激信号的产生及骨骼肌组织电刺激后在可测定时间内对其超低温快速冷冻固定进行同步控制，获得骨骼肌组织兴奋-收缩偶联发生时肌浆网毫秒级的形态功能变化，从而为肌浆网的主要功能的研究提供了形态学证明，对骨骼肌兴奋-收缩偶联发生的机制的论证提供了形态学依据，为生物学中功能形态的同步研究提供方法学。
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*国家自然科学基金资助项目，批准号 39570354，39670207
作者简介：雷长海，男，1974年3月生，硕士
作者单位：第二军医大学基础医学部计算机教研室，上海，200433；第二军医大学基础医学部生物物理研究所
参考文献
1 杨勇骥,雷长海,吴 越,等. 骨骼肌兴奋-收缩偶联超微结构瞬时变化研究[J]. 第二军医大学学报，1999,20(3):151
2 Stern MD,Lakatta EG. Excitation-contraction coupling in the heart: the state of the question[J]. FASEB J, 1992,6(12):3092
3 Sommer JR. Comparative anatomy: in praise of a powerful approach to elucidate mechanisms translating cardiac excitation into purposeful contraction[J]. J Mol Cell Cardiol, 1995,27(1):19
4 朱志年.微机心收缩性实时分析系统[J]. 生物医学工程学杂志, 1994,11(1):43, http://www.100md.com
摘 要 目的：利用模数转换技术进行骨骼肌肌浆网确定时间内功能形态变化的研究。方法：采用双向红外线探测器、模数转换卡、计算机和Reichert Jung KF-80快速冷冻仪组成计算机控制的电刺激超低温快速冷冻固定系统，在蟾蜍骨骼肌兴奋-收缩偶联变化的瞬间，实时测定功能变化经历的精确时间。结果：测量得到骨骼肌肌浆网功能变化的0.8，5.6，8.4 ms时间间隔，并同步获得骨骼肌肌浆网的超微结构形态图像。结论：计算机模数转换技术控制电刺激超低温快速固定技术有效地实现了生物学中功能形态瞬时变化的同步研究。
关键词：模数转换技术 骨骼肌 功能形态
肌组织兴奋-收缩偶联发生时的变化时相极快，达到毫秒级，因此采用常规化学固定方法(固定时间以分钟计)无法保留肌组织兴奋-收缩偶联发生瞬间的超微结构形态及离子浓度的变化，这是目前在肌组织兴奋-收缩偶联研究领域中的最大难题[1]。
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国外从90年代初提出毫秒级实时处理与超低温快速冷冻固定相结合，进行在已知时间段内细胞生理功能变化时的超微结构形态的系统研究[2,3]。但始终无法解决的是：如何在已知的毫秒级水平上，控制超低温快速冷冻固定，使固定与细胞功能变化同步，进而获得在功能变化时的有关形态学数据。国内到目前为止尚无有关毫秒级实时处理细胞功能变化时的超微结构形态及组分变化研究的报道。
我们采用双向红外线探测器、模数转换卡、计算机和Reichert Jung KF-80快速冷冻仪组成计算机控制的电刺激-超低温快速冷冻固定系统，用于从毫秒级变化的水平研究骨骼肌组织兴奋-收缩偶联发生时肌浆网的形态功能变化。
1 方法和结果
1.1 系统结构与设计 本系统作为一个利用计算机控制的生物信号处理系统，其重要的功能是通过计算机监视、获取、控制肌组织兴奋-收缩偶联发生瞬间的生理参数。
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首先，利用传感器(Transducer)获取双向红外线探测器产生的脉冲信号并转换成电信号(mV-μV)，由量程放大器放大至模数转换卡的信号输入范围，低通滤波器压低干扰，增加信噪比，通过采样-保持电路进行A/D转换，进入计算机。计算机进行信号实时定位。整个系统结构如图1所示：
图 1 系统设计示意图
Fig 1 System design's sketch map
在实验中，我们以5 V电压为输入电压，选用逐次逼近式电路，自行设计开发了计算机模数转换卡。选用A/D 574JD作为主芯片，它是12位逐次逼近式单片A/D转换器，内含DAC、参考电压、比较器、逐次逼近寄存器SAR 和三态输出缓冲器，转换时间为25 μs。该计算机模数转换卡具备较高的精度和较快的转换速度，可以满足电刺激-超低温快速冷冻固定计算机实时处理的毫秒级响应要求[4]。
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系统软件利用80486汇编语言和C语言编写，其中采样程序用汇编语言编写，软件界面和数据处理程序用C语言编写。
1.2 操作和结果 利用上述系统对蟾蜍骨骼肌组织实施电脉冲刺激，刺激参数为：单触发；脉冲触发电位：2 V；波宽：0.2 ms。在肌组织受激发产生兴奋-收缩偶联变化的各功能时间段内，对其进行超低温快速冷冻固定，实时测定其功能变化的经历时间，并获得骨骼肌肌浆网超微结构形态变化,与静息后处于舒张状态的肌组织比较得到以下几点实验结果[1]：(1)在骨骼肌兴奋-收缩偶联变化时，观察发现存在两种不同的肌浆网结构，即三联管结构和三层的膜结构，经铅-铀染色发现肌浆网前端有致密的颗粒物质。当兴奋-收缩偶联变化发生的瞬间约10 ms的潜伏期内，该内容物发生位移，其位移方向朝T管，而在偶联变化结束后，又恢复至原中心位置。(2)骨骼肌在电刺激后0.8,5.6,8.4 ms时均发现肌浆网近T管端产生两个孔样结构，而在骨骼肌处于完全舒张时肌浆网并无此形态结构。(3)骨骼肌在电刺激兴奋-收缩偶联变化发生后约10 ms
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的潜伏期内，从结构形态上似乎还未观察到肌丝开始收缩，骨骼肌组织I带宽度基本与舒张时I带宽度相同，10 ms后的收缩期内，可以观察到骨骼肌肌膜明显变窄，并发生去极化现象，在骨骼肌完全舒张时，观察其超微结构形态发现骨骼肌肌膜增宽。
2 讨 论
肌组织受到电刺激将发生兴奋-收缩偶联变化。生理学实验提供了肌组织兴奋-收缩偶联的功能时间变化段，即受激后<10 ms为潜伏期，10～60 ms为收缩期，>60 ms为舒张期。但是，肌组织在兴奋-收缩偶联变化的各功能时间段内的结构变化怎样,肌浆网变化如何,对其进行功能形态的同步研究是细胞生物学及生物物理学中极感兴趣的课题之一。虽然研究已进行了100多年，但始终不能对其收缩机制有一定论。随着超低温快速冷冻固定技术和计算机技术的发展，从形态学角度证实兴奋-收缩偶联发生的机制是可能的，也是必须的。我们研制的计算机控制电刺激超低温快速冷冻固定系统，便是利用计算机模数转换技术和超低温快速冷冻固定技术对电刺激信号的产生及骨骼肌组织电刺激后在可测定时间内对其超低温快速冷冻固定进行同步控制，获得骨骼肌组织兴奋-收缩偶联发生时肌浆网毫秒级的形态功能变化，从而为肌浆网的主要功能的研究提供了形态学证明，对骨骼肌兴奋-收缩偶联发生的机制的论证提供了形态学依据，为生物学中功能形态的同步研究提供方法学。
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*国家自然科学基金资助项目，批准号 39570354，39670207
作者简介：雷长海，男，1974年3月生，硕士
作者单位：第二军医大学基础医学部计算机教研室，上海，200433；第二军医大学基础医学部生物物理研究所
参考文献
1 杨勇骥,雷长海,吴 越,等. 骨骼肌兴奋-收缩偶联超微结构瞬时变化研究[J]. 第二军医大学学报，1999,20(3):151
2 Stern MD,Lakatta EG. Excitation-contraction coupling in the heart: the state of the question[J]. FASEB J, 1992,6(12):3092
3 Sommer JR. Comparative anatomy: in praise of a powerful approach to elucidate mechanisms translating cardiac excitation into purposeful contraction[J]. J Mol Cell Cardiol, 1995,27(1):19
4 朱志年.微机心收缩性实时分析系统[J]. 生物医学工程学杂志, 1994,11(1):43, http://www.100md.com