献血员中TT病毒感染的检测及序列分析
任浩 钱宝华 朱分禄 倪武 戚中田
摘 要 目的： 研究ALT正常的献血员中TTV(transfusion transmitted virus) 的感染情况，探讨TTV感染的传播途径和致病性。方法： 设计TTV保守区域的特异性引物，聚合酶链反应(PCR)方法检测120例ALT正常的献血员，对1例TTV DNA阳性标本(TTVD026)进行PCR产物测序，并与已知TTV核苷酸序列比较同源性。结果： 120例ALT正常献血员中有20例为TTV DNA阳性，感染率为16.7%。同源性分析表明TTVD026与TA278,GH1,TTVCHN1和TTVCHN2的核苷酸同源性分别为99%，99%，99%和89%。结论： ALT正常的献血员中存在TTV的感染; TTVD026与TTV TA278,GH1,TTVCHN1和TTVCHN2可能属于同一个基因型;输血可能是TTV传播的主要途径。
, 百拇医药
关键词：肝炎病毒 TT病毒 序列分析
1997年，日本学者Nishizawa等[1]应用差异显示分析(RDA)技术发现了一株新的DNA病毒——TTV(transfusion transmitted virus)。TTV在正常人群及各型肝炎患者中分布广泛，尤其是在非甲-庚型暴发性肝炎和非甲-庚型慢性肝炎中，其感染率高达47%和46%[2]，故疑为一个新型肝炎病毒。为探讨TTV在人类肝炎中的作用及其传播途径，本研究检测了ALT正常的献血员中TTV的感染情况并进行了序列分析。
1 材料和方法
1.1 材料来源 所有献血员(120例，ALT正常)血浆标本采自第二军医大学长海医院血库，均符合国家献血员血液检验标准。PCR试剂均购自宝灵曼公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。
, 百拇医药 1.2 DNA抽提 100μl血清加300μl裂解液[13.3 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0, 6.7 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.67%十二烷基硫酸钠(SDS)，133μg/ml蛋白酶K]，70℃水浴1h，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于20μl1 × TE中。
1.3 PCR引物 参照TTV日本株序列设计两套引物。分别为：S1：5′-CCATTCACAGACAGAGG-
AGAAGGC-3′；S2：5′-CTAATAAGAAGTCCCT-
TTACAGACCC-3′；AS1：5′-GGAGTGGGTTTC-
GGGGCAGGG-3′。S3：5′-CAATAGAGTCCCTA-
GAAGCTTACA-3′；AS3：5′-GGTAACAAGGTA-
, 百拇医药
GGGTTGATATC-3′;S4：5′-GGAACTCACATT-
CCATACCTG-3′；AS4：5′-GTTTGACTCCCAG-
GATTCG-3′,其中S1/AS1、S3/AS3为外引物，S2/AS1、S4/AS4为内引物。
1.4 PCR扩增条件 取模板5μl，10×Taq缓冲液5μl，dNTP0.1mmol/L，Taq酶1U，引物浓度均为0.3μmol/L,共50μl反应体积；取第1次PCR产物5μl作模板，其他同第1轮。循环条件均为：94℃预变性180s，94℃35s，56℃35s，72℃45s，扩增30个循环，72℃延伸8min。取第2次PCR产物15μl，2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果。
1.5 PCR产物直接测序 PCR产物(TTVD026)纯化后用PE公司的ABI PRISM 377DNA自动测序仪行PCR产物直接测序，测序引物为S4/AS4。将所测序列通过Internet BLAST进行同源性分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 ALT正常献血员中TTV DNA 的PCR 检测结果 PCR方法检测120例ALT正常的献血员血清标本，阳性标本20例，阳性率为16.7%。两套引物扩增的片段分别为323 bp (S2/AS1)和329 bp (S4/AS4)，如图1所示。ABI PRISM 377自动测序结果及同源性分析如图2(见封三)所示。
图1 TTV DNA的PCR 凝胶电泳结果
Fig 1 PCR gel electrophoresis analysis
of TTV DNA fragments
, http://www.100md.com 1：PCR markers; 2,3：PCR products amplified by S4/AS4; 2：Nega-
tive sample; 3： Positive sample;4,5：PCR products amplified by
S2/AS1; 4：Negative sample; 5：Positive sample
图2 TTV分离(TTVDO26)部分序列的测定及同源性比较
Fig 2 Sequence and homology analysis of TTV DNA (TTVD026)fragments
, 百拇医药
2.2 TTVD026与其他TTV分离株的同源性分析 Internet BLAST检索发现TTVD026与TA278(AB008394)[2],GH1(AF122913)[3],TTVCHN1(AF079173)和TTVCHN2(AF129887)相应部位的核苷酸序列同源性分别为99%，99%，99%和89%。
3 讨 论
在临床病毒性肝炎患者中，有相当一部分病例无法用已经建立的甲、乙、丙、丁、戊型肝炎的实验室诊断方法进行病原学分型，人们将其统称为非甲-戊型肝炎。1995年发现的GBV-C/HGV[4]，可能使10%～20%的非甲-戊型肝炎的病因获得解释，但目前对其致病性表示怀疑[5]，可能存在尚未发现的致急慢性肝炎的其他病毒。1997年， Nishizawa等[1]发现并克隆了另一种新的肝炎病毒TTV。
, 百拇医药
我国是肝炎高发区，相当一部分肝炎患者是经输血途径感染的。目前，由于献血员的严格筛选，大大降低了输血后肝炎的发生，但仍不能完全避免。新近发现的TTV就是从1例输血后肝炎患者血清中检测出的，且认为TTV和输血后肝炎有一定的相关性。有资料显示，多次输血者或接触血制品的人群感染TTV的机率较高[6,7]，英国Simmonds等[8]的研究提示,50%的血制品可能已经被TTV污染。鉴于上述情况，本研究根据已发表的TTV基因序列设计引物，PCR方法检测了ALT正常的献血员TTV的感染情况。为避免PCR操作的假阳性，弥补不同区域的引物造成检出率的差异，设计了不同区域的两套引物以相互补充。检测结果表明，ALT正常的献血员中的确存在TTV感染，且感染率相对较高。序列分析发现TTVD026与TA278，GH1，TTVCHN1的同源性较高，可能属同一基因型；与TTVCHN2的同源性较低，是否为不同的亚型，尚需进一步的研究。ALT正常献血员中TTV DNA的存在，一方面提示TTV可能存在隐性感染，或TTV的致病性较弱，不足以引起ALT异常；另一方面提示TTV可通过ALT正常的献血员传播。ALT正常献血员中的TTV携带者可能是导致TTV 高感染率的一个主要原因。
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* 国家自然科学基金资助项目,批准号 39680018
作者简介：任浩，女，1973 年7 月生，博士生
作者单位：任浩 朱分禄 戚中田 第二军医大学基础医学部微生物学教研室,上海，200433;
钱宝华 第二军医大学长海医院血库；
倪武 第二军医大学长征医院感染科
参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Biochem Biophy Res Commun,1997,241(1):92
, http://www.100md.com
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Hepatol Res, 1998,10(3):1
3 Mushahwar IK, Erker JC, Muerhoff AS, et al. Molecular and biophysical characterization of TT virus: evidence for a new virus family infecting humans[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1999, 96(6):3177
4 Linnen J, Wages J Jr, Zhang-Keck ZY , et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent[J]. Science,1996,271(5248):505
, http://www.100md.com
5 Theodore D, Lemon SM. GB virus C, hepatitis G virus, or human orphan Flavivirus[J] Hepatology, 1997,25(5):1285
6 Viazov S, Ross RS, Varenholz C, et al. Lack of evidence for an association between TTV infection and severe liver disease[J]. J Clin Virol,1998,11(3):183
7 Charlton M, Adjei P, Poterucha J, et al. TT virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure, and cryptogenic cirrhosis[J]. Hepatology,1998,28(3):839
8 Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products[J]. Lancet,1998,352(9123):191, 百拇医药
摘 要 目的： 研究ALT正常的献血员中TTV(transfusion transmitted virus) 的感染情况，探讨TTV感染的传播途径和致病性。方法： 设计TTV保守区域的特异性引物，聚合酶链反应(PCR)方法检测120例ALT正常的献血员，对1例TTV DNA阳性标本(TTVD026)进行PCR产物测序，并与已知TTV核苷酸序列比较同源性。结果： 120例ALT正常献血员中有20例为TTV DNA阳性，感染率为16.7%。同源性分析表明TTVD026与TA278,GH1,TTVCHN1和TTVCHN2的核苷酸同源性分别为99%，99%，99%和89%。结论： ALT正常的献血员中存在TTV的感染; TTVD026与TTV TA278,GH1,TTVCHN1和TTVCHN2可能属于同一个基因型;输血可能是TTV传播的主要途径。
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关键词：肝炎病毒 TT病毒 序列分析
1997年，日本学者Nishizawa等[1]应用差异显示分析(RDA)技术发现了一株新的DNA病毒——TTV(transfusion transmitted virus)。TTV在正常人群及各型肝炎患者中分布广泛，尤其是在非甲-庚型暴发性肝炎和非甲-庚型慢性肝炎中，其感染率高达47%和46%[2]，故疑为一个新型肝炎病毒。为探讨TTV在人类肝炎中的作用及其传播途径，本研究检测了ALT正常的献血员中TTV的感染情况并进行了序列分析。
1 材料和方法
1.1 材料来源 所有献血员(120例，ALT正常)血浆标本采自第二军医大学长海医院血库，均符合国家献血员血液检验标准。PCR试剂均购自宝灵曼公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。
, 百拇医药 1.2 DNA抽提 100μl血清加300μl裂解液[13.3 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0, 6.7 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.67%十二烷基硫酸钠(SDS)，133μg/ml蛋白酶K]，70℃水浴1h，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于20μl1 × TE中。
1.3 PCR引物 参照TTV日本株序列设计两套引物。分别为：S1：5′-CCATTCACAGACAGAGG-
AGAAGGC-3′；S2：5′-CTAATAAGAAGTCCCT-
TTACAGACCC-3′；AS1：5′-GGAGTGGGTTTC-
GGGGCAGGG-3′。S3：5′-CAATAGAGTCCCTA-
GAAGCTTACA-3′；AS3：5′-GGTAACAAGGTA-
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GGGTTGATATC-3′;S4：5′-GGAACTCACATT-
CCATACCTG-3′；AS4：5′-GTTTGACTCCCAG-
GATTCG-3′,其中S1/AS1、S3/AS3为外引物，S2/AS1、S4/AS4为内引物。
1.4 PCR扩增条件 取模板5μl，10×Taq缓冲液5μl，dNTP0.1mmol/L，Taq酶1U，引物浓度均为0.3μmol/L,共50μl反应体积；取第1次PCR产物5μl作模板，其他同第1轮。循环条件均为：94℃预变性180s，94℃35s，56℃35s，72℃45s，扩增30个循环，72℃延伸8min。取第2次PCR产物15μl，2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果。
1.5 PCR产物直接测序 PCR产物(TTVD026)纯化后用PE公司的ABI PRISM 377DNA自动测序仪行PCR产物直接测序，测序引物为S4/AS4。将所测序列通过Internet BLAST进行同源性分析。
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2 结 果
2.1 ALT正常献血员中TTV DNA 的PCR 检测结果 PCR方法检测120例ALT正常的献血员血清标本，阳性标本20例，阳性率为16.7%。两套引物扩增的片段分别为323 bp (S2/AS1)和329 bp (S4/AS4)，如图1所示。ABI PRISM 377自动测序结果及同源性分析如图2(见封三)所示。
图1 TTV DNA的PCR 凝胶电泳结果
Fig 1 PCR gel electrophoresis analysis
of TTV DNA fragments
, http://www.100md.com 1：PCR markers; 2,3：PCR products amplified by S4/AS4; 2：Nega-
tive sample; 3： Positive sample;4,5：PCR products amplified by
S2/AS1; 4：Negative sample; 5：Positive sample
图2 TTV分离(TTVDO26)部分序列的测定及同源性比较
Fig 2 Sequence and homology analysis of TTV DNA (TTVD026)fragments
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2.2 TTVD026与其他TTV分离株的同源性分析 Internet BLAST检索发现TTVD026与TA278(AB008394)[2],GH1(AF122913)[3],TTVCHN1(AF079173)和TTVCHN2(AF129887)相应部位的核苷酸序列同源性分别为99%，99%，99%和89%。
3 讨 论
在临床病毒性肝炎患者中，有相当一部分病例无法用已经建立的甲、乙、丙、丁、戊型肝炎的实验室诊断方法进行病原学分型，人们将其统称为非甲-戊型肝炎。1995年发现的GBV-C/HGV[4]，可能使10%～20%的非甲-戊型肝炎的病因获得解释，但目前对其致病性表示怀疑[5]，可能存在尚未发现的致急慢性肝炎的其他病毒。1997年， Nishizawa等[1]发现并克隆了另一种新的肝炎病毒TTV。
, 百拇医药
我国是肝炎高发区，相当一部分肝炎患者是经输血途径感染的。目前，由于献血员的严格筛选，大大降低了输血后肝炎的发生，但仍不能完全避免。新近发现的TTV就是从1例输血后肝炎患者血清中检测出的，且认为TTV和输血后肝炎有一定的相关性。有资料显示，多次输血者或接触血制品的人群感染TTV的机率较高[6,7]，英国Simmonds等[8]的研究提示,50%的血制品可能已经被TTV污染。鉴于上述情况，本研究根据已发表的TTV基因序列设计引物，PCR方法检测了ALT正常的献血员TTV的感染情况。为避免PCR操作的假阳性，弥补不同区域的引物造成检出率的差异，设计了不同区域的两套引物以相互补充。检测结果表明，ALT正常的献血员中的确存在TTV感染，且感染率相对较高。序列分析发现TTVD026与TA278，GH1，TTVCHN1的同源性较高，可能属同一基因型；与TTVCHN2的同源性较低，是否为不同的亚型，尚需进一步的研究。ALT正常献血员中TTV DNA的存在，一方面提示TTV可能存在隐性感染，或TTV的致病性较弱，不足以引起ALT异常；另一方面提示TTV可通过ALT正常的献血员传播。ALT正常献血员中的TTV携带者可能是导致TTV 高感染率的一个主要原因。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目,批准号 39680018
作者简介：任浩，女，1973 年7 月生，博士生
作者单位：任浩 朱分禄 戚中田 第二军医大学基础医学部微生物学教研室,上海，200433;
钱宝华 第二军医大学长海医院血库；
倪武 第二军医大学长征医院感染科
参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Biochem Biophy Res Commun,1997,241(1):92
, http://www.100md.com
2 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J]. Hepatol Res, 1998,10(3):1
3 Mushahwar IK, Erker JC, Muerhoff AS, et al. Molecular and biophysical characterization of TT virus: evidence for a new virus family infecting humans[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1999, 96(6):3177
4 Linnen J, Wages J Jr, Zhang-Keck ZY , et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent[J]. Science,1996,271(5248):505
, http://www.100md.com
5 Theodore D, Lemon SM. GB virus C, hepatitis G virus, or human orphan Flavivirus[J] Hepatology, 1997,25(5):1285
6 Viazov S, Ross RS, Varenholz C, et al. Lack of evidence for an association between TTV infection and severe liver disease[J]. J Clin Virol,1998,11(3):183
7 Charlton M, Adjei P, Poterucha J, et al. TT virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure, and cryptogenic cirrhosis[J]. Hepatology,1998,28(3):839
8 Simmonds P, Davidson F, Lycett C, et al. Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products[J]. Lancet,1998,352(9123):191, 百拇医药