疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因和更昔洛韦系统对恶性胶质瘤患者免疫功能的影响
者免疫功能的影响*
张晓鹏 胡加飞 李莉 蔡如珏 卢亦成 朱诚
摘 要 目的：探讨疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因和更昔洛韦(HSV-TK/GCV)系统对恶性胶质瘤患者体液免疫和细胞免疫功能的影响。方法：对12例恶性胶质瘤患者采用HSV-TK/GCV试验治疗。分别于治疗前、治疗过程中和治疗后采外周血和脑脊液，用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群，用免疫比浊法测定血清和脑脊液免疫球蛋白的含量。结果：血CD4+T细胞在治疗开始后2周显著升高；自然杀伤(NK)细胞在治疗过程中明显下降，治疗结束后则显著高于治疗前水平；细胞毒性细胞(CTL)在治疗结束后显著高于治疗前水平；血清IgM和脑脊液IgG、IgA和IgM水平在治疗结束后均显著高于治疗前水平。结论：HSV-TK/GCV系统对机体的体液和细胞免疫功能有明显的促进作用。
, 百拇医药
关键词：脑肿瘤 基因治疗 疱疹病毒胸苷激酶 更昔洛韦
体外、体内实验证实疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因(HSV-TK)结合更昔洛韦(ganciclovir, GCV)对啮齿类动物和人类恶性胶质瘤有明确的治疗作用[1，2]。经国家卫生部药政局批准，自1996年11月至1997年8月，我们对12例脑恶性胶质瘤患者进行了该方法的试验治疗，并对患者细胞免疫和体液免疫指标进行了监测，结果表明该方法对患者的免疫功能有明显的促进作用。
1 材料和方法
1.1 一般资料 12例中男女各6例，年龄10～61岁，平均36.4岁。其中原发性胶质瘤和复发性胶质瘤各6例，均经病理诊断。星形细胞瘤Ⅰ～Ⅱ级4例，Ⅲ～Ⅳ级8例。
1.2 细胞悬液和GCV 疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因逆转录病毒载体包装细胞pLTKcSN/VPC 由上海市肿瘤研究所制备，密度1×108 个/ml，以自制冻存液制成悬液，存放于液氮中。用于试验的细胞悬液均通过中国药品生物制品检定所的外源因子检测，其中包括无菌试验、支原体和鼠源性病毒检测。应用逆转录PCR，neo基因和LacZ基因的补救实验证实该细胞的培养上清中无野生型逆转录病毒存在。GCV由上海Roche制药公司提供，500 mg/支。注射时先以10 ml注射用水稀释，再按所需剂量抽取相应容积溶于生理盐水中经外周浅静脉缓慢滴注。
, 百拇医药
1.3 手术、细胞悬液的接种和GCV的应用方法 患者在全麻下接受开颅手术，尽量做到肿瘤的肉眼全切除，并且不能开放脑室。病理证实为恶性胶质瘤。残余肿瘤壁彻底止血，将冻存的包装细胞悬液直接复苏并抽吸于1 ml注射器中，采用多点注射法于残瘤壁注射细胞悬液。以1 cm左右的间距，每点进针深度约1.5 cm。用微量注射泵控制注射速度在50 μl/min。手术后第14天，经外周浅静脉滴注GCV，剂量为5 mg/kg, 每12 h 1次，每次静脉滴注的时间不少于1 h，疗程共14 d。
1.4 体液免疫和细胞免疫功能检测 检测时间为手术前、术后GCV用药前和GCV用药结束后。血清免疫球蛋白用免疫比浊法测定；T细胞亚群检测用直接免疫荧光双色标记法，所用抗体为CD3/CD(16+56)、CD4/CD29(美国Coulter-Immunotec产品)和CD8/CD28(美国Bectopn-Diki公司产品)，按照试剂说明标记。标记后用各公司配套溶血剂分步溶红细胞和固定样本，6 h内进行流式细胞仪(Coulter EPICS-XL型)检测。脑脊液免疫球蛋白检测时间为术前和术后1周，方法同血清免疫球蛋白检测。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 治疗后各次结果与治疗前基线水平比较，数值通过t检验确定显著性。
2 结 果
2.1 外周血T淋巴细胞比值变化 在手术及pLTKcSN/VPC细胞悬液注射后2周、GCV用药之前，患者血液中以CD4抗原为标记的T细胞亚群明显升高(P<0.01)，提示T辅助/诱导亚群活性升高。患者血液中NK细胞早期明显下降(P<0.005)，但手术后4周、GCV用药结束后，NK细胞明显回升，并显著高于术前基线水平(P<0.05)。手术、细胞悬液接种后第4周、GCV用药结束后，患者血液中CTL细胞明显高于术前基线水平(P<0.01，表1)。
表1 HSV-TK/GCV治疗对患者外周血T淋巴细胞表型的影响
Tab 1 The effect of HSV-TK/GCV on the T lymphocyte phenotype
, 百拇医药
of peripheral blood in malignant glioma patients(n=12,X±s,%)
Time
CD3
CD4
CD8
NK
CTL
Before operation
69.32±5.91
35.70±6.45
30.96±5.79
, 百拇医药
12.04±7.46
16.11±4.81
Before GCV injection
71.07±6.24
40.08±5.04**
25.49±5.96
8.91±6.34***
16.39±4.90
After GCV injection
73.79±4.12
, 百拇医药
36.73±4.66
33.51±6.89
19.96±5.19*
21.96±4.60**
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005 vs before operation
2.2 血清抗体水平检测 患者血清IgM水平在手术后明显高于基线水平(P<0.01)。血IgG和IgA水平无明显变化。血清中补体水平也无明显变化(表2)。
表2 患者血清抗体水平变化
Tab 2 The changes of serum antibody level
, 百拇医药
in malignant glioma patients(n=12,X±s，ρB/μg.L-1)
Time
IgG
IgA
IgM
Before
operation
10.15±2.41
1.87±1.13
1.43±0.60
, 百拇医药
Before GCV
injection
9.12±1.43
2.09±1.40
1.92±0.60**
After GCV
injection
9.31±2.71
1.66±1.14
2.94±3.08**
**P<0.01 vs before operation
, 百拇医药
2.3 脑脊液中抗体水平的变化 术后脑脊液中IgG、IgA和IgM水平均明显升高(P<0.05，表3)。
表3 患者脑脊液中抗体水平的变化
Tab 3 The changes of CSF antibody level in
malignant glioma patients(n=12,X±s，ρB/μg.L-1)
Time
IgG
IgA
IgM
, http://www.100md.com
Before
operation
102.59±20.96
17.59±6.37
16.94±3.32
After
operation
171.18±30.66*
30.10±12.29*
27.44±11.06*
*P<0.05 vs before operation
, 百拇医药
3 讨 论
研究资料表明，胶质瘤患者的细胞免疫功能均有不同程度的降低，主要表现为外周血淋巴细胞总数下降和NK、CTL细胞比例降低[3]。其影响因素有：中枢神经系统是体内的免疫功能相对低下区域；
恶性胶质瘤的抗原性低；肿瘤可分泌诱导抑制免疫细胞的抗原；肿瘤和宿主细胞可产生前列腺素、肿瘤生长因子、免疫抑制性酸性糖蛋白和免疫调节性α巨球蛋白等抑制细胞免疫的血清抑制因子等。已经有大量的研究表明，通过激活机体的抗肿瘤细胞免疫作用可以达到治疗恶性胶质瘤的目的。而能否调动机体的抗肿瘤免疫作用也是影响某种治疗手段对恶性胶质瘤的治疗效果的决定性因素。
体外和动物实验表明，疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因和更昔洛韦系统(HSV-TK/GCV)对恶性胶质瘤有显著的抑制作用。目前美国和欧洲有多家医院进行了该方法的临床试验，初步结果表明，该法可延长患者的平均生存期[4]。但是关于该治疗系统对机体免疫功能的影响尚未见报道。我科与上海市肿瘤研究所合作在国内率先开展了该方法的基础和临床研究工作。在动物实验中，我们观察到HSV-TK/GCV系统对动物和人的胶质瘤细胞有明显的杀伤作用，同时对动物血NK和LAK活性有明显的促进作用。本研究在此基础上进一步观察了该系统对人体免疫功能的影响，以探讨其临床应用前景。
, http://www.100md.com
12例患者的T细胞亚群检测表明，在手术及包装细胞悬液接种后2周、GCV用药前，患者血CD4+淋巴细胞显著升高，在GCV用药结束后，血CTL升高，同时血清IgM水平明显升高，在CD4+T诱导亚群中，升高的主要是T诱导/辅助亚群，而非T诱导/抑制亚群。
NK细胞活性在治疗开始后2周显著下降，而在第4周显著高于治疗前水平，其早期下降的原因可能是由于注射于肿瘤体内的包装细胞的鼠源性NIH3T3细胞，加上手术输入异体血液，在治疗后早期诱导B淋巴细胞的增高导致血清排异性抗体IgM水平显著升高，使NK细胞比例相应下降。而手术后4周，由于T诱导/辅助亚群活性的升高，NK细胞水平也随之升高。而我们认为治疗后脑脊液中免疫球蛋白水平升高的主要原因可能是对异种细胞的排斥反应。
综合动物实验和上述临床资料，我们的初步结论是HSV-TK/GCV系统在早期对恶性胶质瘤患者的体液免疫和细胞免疫功能有一定促进作用。该系统对免疫系统的长期影响作用尚有待进一步观察。
, 百拇医药
* 国家“863”基金资助项目，批准号BH-03-01-01
作者简介：张晓鹏，男，1967年7月生，博士，主治医师
作者单位：第二军医大学长征医院神经外科 ，上海，200003
△第二军医大学长征医院实验诊断科
参考文献
1 许秀兰，张晓鹏，郭 忠，等. 疱疹病毒Ⅰ型中国株胸苷激酶基因治疗脑瘤的临床前研究[J]. 中华医学杂志，1997，77(1)：35
2 张晓鹏，胡加飞，蔡如珏，等. pLTKcSN/VPC和GCV系统的旁观者效应初探[J]. 第二军医大学学报，1997，18(4)：325
3 Inoue M,Plautz GE, Shu S. Treatment of intracranial tumors by systemic transfer of superantigen-activated tumor-draining lymph node T cells[J]. Cancer Res, 1996,56(20):4720
4 Ram Z, Culver K, Oshiro E, et al. Summary of results and conclusions of the gene therapy of malignant brain tumors: clinical study[J]. J Neurosurg, 1995, 82(Suppl):343A, 百拇医药(者免疫功能的影响*)
张晓鹏 胡加飞 李莉 蔡如珏 卢亦成 朱诚
摘 要 目的：探讨疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因和更昔洛韦(HSV-TK/GCV)系统对恶性胶质瘤患者体液免疫和细胞免疫功能的影响。方法：对12例恶性胶质瘤患者采用HSV-TK/GCV试验治疗。分别于治疗前、治疗过程中和治疗后采外周血和脑脊液，用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群，用免疫比浊法测定血清和脑脊液免疫球蛋白的含量。结果：血CD4+T细胞在治疗开始后2周显著升高；自然杀伤(NK)细胞在治疗过程中明显下降，治疗结束后则显著高于治疗前水平；细胞毒性细胞(CTL)在治疗结束后显著高于治疗前水平；血清IgM和脑脊液IgG、IgA和IgM水平在治疗结束后均显著高于治疗前水平。结论：HSV-TK/GCV系统对机体的体液和细胞免疫功能有明显的促进作用。
, 百拇医药
关键词：脑肿瘤 基因治疗 疱疹病毒胸苷激酶 更昔洛韦
体外、体内实验证实疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因(HSV-TK)结合更昔洛韦(ganciclovir, GCV)对啮齿类动物和人类恶性胶质瘤有明确的治疗作用[1，2]。经国家卫生部药政局批准，自1996年11月至1997年8月，我们对12例脑恶性胶质瘤患者进行了该方法的试验治疗，并对患者细胞免疫和体液免疫指标进行了监测，结果表明该方法对患者的免疫功能有明显的促进作用。
1 材料和方法
1.1 一般资料 12例中男女各6例，年龄10～61岁，平均36.4岁。其中原发性胶质瘤和复发性胶质瘤各6例，均经病理诊断。星形细胞瘤Ⅰ～Ⅱ级4例，Ⅲ～Ⅳ级8例。
1.2 细胞悬液和GCV 疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因逆转录病毒载体包装细胞pLTKcSN/VPC 由上海市肿瘤研究所制备，密度1×108 个/ml，以自制冻存液制成悬液，存放于液氮中。用于试验的细胞悬液均通过中国药品生物制品检定所的外源因子检测，其中包括无菌试验、支原体和鼠源性病毒检测。应用逆转录PCR，neo基因和LacZ基因的补救实验证实该细胞的培养上清中无野生型逆转录病毒存在。GCV由上海Roche制药公司提供，500 mg/支。注射时先以10 ml注射用水稀释，再按所需剂量抽取相应容积溶于生理盐水中经外周浅静脉缓慢滴注。
, 百拇医药
1.3 手术、细胞悬液的接种和GCV的应用方法 患者在全麻下接受开颅手术，尽量做到肿瘤的肉眼全切除，并且不能开放脑室。病理证实为恶性胶质瘤。残余肿瘤壁彻底止血，将冻存的包装细胞悬液直接复苏并抽吸于1 ml注射器中，采用多点注射法于残瘤壁注射细胞悬液。以1 cm左右的间距，每点进针深度约1.5 cm。用微量注射泵控制注射速度在50 μl/min。手术后第14天，经外周浅静脉滴注GCV，剂量为5 mg/kg, 每12 h 1次，每次静脉滴注的时间不少于1 h，疗程共14 d。
1.4 体液免疫和细胞免疫功能检测 检测时间为手术前、术后GCV用药前和GCV用药结束后。血清免疫球蛋白用免疫比浊法测定；T细胞亚群检测用直接免疫荧光双色标记法，所用抗体为CD3/CD(16+56)、CD4/CD29(美国Coulter-Immunotec产品)和CD8/CD28(美国Bectopn-Diki公司产品)，按照试剂说明标记。标记后用各公司配套溶血剂分步溶红细胞和固定样本，6 h内进行流式细胞仪(Coulter EPICS-XL型)检测。脑脊液免疫球蛋白检测时间为术前和术后1周，方法同血清免疫球蛋白检测。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 治疗后各次结果与治疗前基线水平比较，数值通过t检验确定显著性。
2 结 果
2.1 外周血T淋巴细胞比值变化 在手术及pLTKcSN/VPC细胞悬液注射后2周、GCV用药之前，患者血液中以CD4抗原为标记的T细胞亚群明显升高(P<0.01)，提示T辅助/诱导亚群活性升高。患者血液中NK细胞早期明显下降(P<0.005)，但手术后4周、GCV用药结束后，NK细胞明显回升，并显著高于术前基线水平(P<0.05)。手术、细胞悬液接种后第4周、GCV用药结束后，患者血液中CTL细胞明显高于术前基线水平(P<0.01，表1)。
表1 HSV-TK/GCV治疗对患者外周血T淋巴细胞表型的影响
Tab 1 The effect of HSV-TK/GCV on the T lymphocyte phenotype
, 百拇医药
of peripheral blood in malignant glioma patients(n=12,X±s,%)
Time
CD3
CD4
CD8
NK
CTL
Before operation
69.32±5.91
35.70±6.45
30.96±5.79
, 百拇医药
12.04±7.46
16.11±4.81
Before GCV injection
71.07±6.24
40.08±5.04**
25.49±5.96
8.91±6.34***
16.39±4.90
After GCV injection
73.79±4.12
, 百拇医药
36.73±4.66
33.51±6.89
19.96±5.19*
21.96±4.60**
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005 vs before operation
2.2 血清抗体水平检测 患者血清IgM水平在手术后明显高于基线水平(P<0.01)。血IgG和IgA水平无明显变化。血清中补体水平也无明显变化(表2)。
表2 患者血清抗体水平变化
Tab 2 The changes of serum antibody level
, 百拇医药
in malignant glioma patients(n=12,X±s，ρB/μg.L-1)
Time
IgG
IgA
IgM
Before
operation
10.15±2.41
1.87±1.13
1.43±0.60
, 百拇医药
Before GCV
injection
9.12±1.43
2.09±1.40
1.92±0.60**
After GCV
injection
9.31±2.71
1.66±1.14
2.94±3.08**
**P<0.01 vs before operation
, 百拇医药
2.3 脑脊液中抗体水平的变化 术后脑脊液中IgG、IgA和IgM水平均明显升高(P<0.05，表3)。
表3 患者脑脊液中抗体水平的变化
Tab 3 The changes of CSF antibody level in
malignant glioma patients(n=12,X±s，ρB/μg.L-1)
Time
IgG
IgA
IgM
, http://www.100md.com
Before
operation
102.59±20.96
17.59±6.37
16.94±3.32
After
operation
171.18±30.66*
30.10±12.29*
27.44±11.06*
*P<0.05 vs before operation
, 百拇医药
3 讨 论
研究资料表明，胶质瘤患者的细胞免疫功能均有不同程度的降低，主要表现为外周血淋巴细胞总数下降和NK、CTL细胞比例降低[3]。其影响因素有：中枢神经系统是体内的免疫功能相对低下区域；
恶性胶质瘤的抗原性低；肿瘤可分泌诱导抑制免疫细胞的抗原；肿瘤和宿主细胞可产生前列腺素、肿瘤生长因子、免疫抑制性酸性糖蛋白和免疫调节性α巨球蛋白等抑制细胞免疫的血清抑制因子等。已经有大量的研究表明，通过激活机体的抗肿瘤细胞免疫作用可以达到治疗恶性胶质瘤的目的。而能否调动机体的抗肿瘤免疫作用也是影响某种治疗手段对恶性胶质瘤的治疗效果的决定性因素。
体外和动物实验表明，疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因和更昔洛韦系统(HSV-TK/GCV)对恶性胶质瘤有显著的抑制作用。目前美国和欧洲有多家医院进行了该方法的临床试验，初步结果表明，该法可延长患者的平均生存期[4]。但是关于该治疗系统对机体免疫功能的影响尚未见报道。我科与上海市肿瘤研究所合作在国内率先开展了该方法的基础和临床研究工作。在动物实验中，我们观察到HSV-TK/GCV系统对动物和人的胶质瘤细胞有明显的杀伤作用，同时对动物血NK和LAK活性有明显的促进作用。本研究在此基础上进一步观察了该系统对人体免疫功能的影响，以探讨其临床应用前景。
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12例患者的T细胞亚群检测表明，在手术及包装细胞悬液接种后2周、GCV用药前，患者血CD4+淋巴细胞显著升高，在GCV用药结束后，血CTL升高，同时血清IgM水平明显升高，在CD4+T诱导亚群中，升高的主要是T诱导/辅助亚群，而非T诱导/抑制亚群。
NK细胞活性在治疗开始后2周显著下降，而在第4周显著高于治疗前水平，其早期下降的原因可能是由于注射于肿瘤体内的包装细胞的鼠源性NIH3T3细胞，加上手术输入异体血液，在治疗后早期诱导B淋巴细胞的增高导致血清排异性抗体IgM水平显著升高，使NK细胞比例相应下降。而手术后4周，由于T诱导/辅助亚群活性的升高，NK细胞水平也随之升高。而我们认为治疗后脑脊液中免疫球蛋白水平升高的主要原因可能是对异种细胞的排斥反应。
综合动物实验和上述临床资料，我们的初步结论是HSV-TK/GCV系统在早期对恶性胶质瘤患者的体液免疫和细胞免疫功能有一定促进作用。该系统对免疫系统的长期影响作用尚有待进一步观察。
, 百拇医药
* 国家“863”基金资助项目，批准号BH-03-01-01
作者简介：张晓鹏，男，1967年7月生，博士，主治医师
作者单位：第二军医大学长征医院神经外科 ，上海，200003
△第二军医大学长征医院实验诊断科
参考文献
1 许秀兰，张晓鹏，郭 忠，等. 疱疹病毒Ⅰ型中国株胸苷激酶基因治疗脑瘤的临床前研究[J]. 中华医学杂志，1997，77(1)：35
2 张晓鹏，胡加飞，蔡如珏，等. pLTKcSN/VPC和GCV系统的旁观者效应初探[J]. 第二军医大学学报，1997，18(4)：325
3 Inoue M,Plautz GE, Shu S. Treatment of intracranial tumors by systemic transfer of superantigen-activated tumor-draining lymph node T cells[J]. Cancer Res, 1996,56(20):4720
4 Ram Z, Culver K, Oshiro E, et al. Summary of results and conclusions of the gene therapy of malignant brain tumors: clinical study[J]. J Neurosurg, 1995, 82(Suppl):343A, 百拇医药(者免疫功能的影响*)