高血脂兔主动脉粘附分子VCAM-1基因表达的研究
徐荣良 张国元 秦永文 吴宗贵 赵仙先 陈晓东 刘延玲
摘 要 目的：研究高血脂对主动脉血管细胞粘附分子1(VCAM-1)基因表达的影响。方法：采用胆固醇喂饲法建立兔高血脂模型，在喂饲后1，6周处死动物，应用组织原位杂交、免疫组织化学等方法检测主动脉VCAM-1的表达，并与正常组对比。结果：喂饲胆固醇1周后高血脂很快诱导主动脉内皮细胞表达VCAM-1，并在6周后动脉粥样硬化(AS)病灶内也有丰富表达。结论：高血脂促进动脉VCAM-1表达，是其促进AS发病的机制之一。
关键词：细胞粘附分子 基因表达 高脂血症 动脉粥样硬化
单核细胞与血管内皮细胞粘附是动脉粥样硬化(AS)形成过程中最早的现象之一，也是AS发生的重要环节，因此对介导两者粘附的粘附分子的研究已成为当前AS研究的热点。高血脂是AS的主要危险因素之一，已有研究表明它能促进单核细胞-血管内皮细胞的粘附[1]，其机制可能与粘附分子表达有关。为此我们采用组织原位杂交及免疫组织化学方法同时观察高血脂对血管细胞粘附分子1(VCAM-1)表达的影响。
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1 材料和方法
1.1 动物模型建立及标本的制备 雄性纯种新西兰兔12只，体质量2～2.5 kg，分为正常对照组4只，喂养1周高血脂组4只，喂养6周高血脂组4只。正常组喂饲普通颗粒饲料，高血脂组喂饲含0.5%胆固醇、5%鸡蛋黄粉、4%花生油的颗粒饲料，自由饮水。定期检测血清总胆固醇水平。到期时用戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉动物，放血处死后迅速剪取升主动脉，浸入液氮保存备用。
1.2 cRNA 探针的合成与标记 VCAM-1 cDNA探针由美国加里福尼亚大学Zhu Yi博士惠赠，载体为pCRⅡ质粒， 扩增后抽提、纯化、回收。质粒分别经XbaⅠ及HindⅢ 酶切并线形化后作为模板，合成反义及正义cRNA探针，长度约1.2 kb。标记试剂盒用Dig RNA Labeling Kit SP6/T7(Boehringer Mannheim 产品)。
1.3 组织原位杂交[2] 标本经4%多聚甲醛、蔗糖固定，冰冻切片，再用4%多聚甲醛固定，烘片后依次用PBS、TritonX-100/PBS洗，蛋白酶K消化，继用4%多聚甲醛-PBS固定，PBS-0.2%乙酸酐和2×SSC洗后进行杂交。杂交液成分：50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，5×SSC，5×Denhardt液，2% SDS，100 μg/ml鲑精DNA，3 ng/μl VCAM-1反义cRNA探针，48℃杂交12～16 h。之后经SSC、PBS梯度洗脱，碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab片段(Boehringer Mannheim 产品)25℃孵育4 h，PBS 洗后用洗脱液Ⅰ和洗脱液Ⅱ漂洗，NBT-BICP避光显色。经脱水、透明后封片，显微镜下观察。阳性反应为紫蓝色。实验设VCAM-1正义cRNA探针替代组作为阴性对照组。
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1.4 免疫组织化学 参照Cybulsky等[3]方法进行，略加改进。动脉组织冰冻切片-20℃丙酮固定5 min，然后按照免疫组织化学ABC法进行组织染色，一抗采用抗兔VCAM-1单克隆抗体(加拿大多伦多大学Myron Cybulsky博士惠赠，1∶100稀释)。用DAB显色，苏木精衬染，封片后在显微镜下观察。另设PBS阴性对照组。
1.5 统计学处理 实验数据均采用X±s表示，用非配对资料t检验方法统计处理。
2 结果
2.1 血清胆固醇测定 正常组血清总胆固醇浓度为(1.97±0.63) mmol/L，而高血脂组喂饲高脂饲料后1周血清总胆固醇达(11.29±0.34) mmol/L，3，6周分别为(13.06±0.1.70) mmol/L，(14.40±0.31) mmol/L，均比正常组明显增高(P<0.001)。
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2.2 原位杂交检测 组织原位杂交显示正常组动脉无VCAM-1 mRNA表达。而高脂喂饲后1周，升主动脉内膜即可见局灶性VCAM-1 mRNA显色；6周可见AS病灶处VCAM-1 mRNA显色较深，从内膜面到病灶深部均有，并且病灶内部显色更深。 正义cRNA探针组结果为阴性。
2.3 免疫组织化学检测 正常主动脉组织中无VCAM-1染色。高脂喂饲1周后升主动脉内膜表面内皮细胞即有VCAM-1染色，呈棕黄色(图1)。抗Ⅷ因子染色可见内皮细胞层完整。6周后出现明显的AS病灶，且VCAM-1染色更深，可见到病灶表面及内部均有染色，病灶内部染色更深(图2)。SMA免疫染色显示病灶内平滑肌细胞较多。PBS替代VCAM-1单抗组结果为阴性。
图1 高脂喂饲1周后主动脉内膜面VCAM-1免疫组织化学染色阳性(×400)
Fig 1 Positive immunostaining of VCAM-1 in aorta intima after 1 week of cholesterol feeding (×400)
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图2 高脂喂饲6周后主动脉AS病灶VCAM-1免疫组织化学染色阳性(×400)
Fig 2 Positive immunostaining of VCAM-1 in aorta atherosclerotic plaque after 6 weeks of cholesterol feeding (×400)
3 讨论
本研究结果显示，喂饲高胆固醇饲料后1周，兔血清总胆固醇即由1.97 mmol/L上升至11.29 mmol/L，并一直维持在较高水平。与此同时，主动脉原位杂交显示，1周时血管内膜即有明显的VCAM-1 mRNA 表达，至6周出现AS病灶时仍有表达，且更加丰富，提示在高血脂促进AS形成的过程中，VCAM-1基因很早就被激活并持续表达。本研究免疫组织化学结果与Sakai等[1]的结果相似，且显示VCAM-1的表达在时间、部位及程度上与原位杂交结果相吻合，从而使VCAM-1基因表达在mRNA及蛋白质水平两个层面得到印证，表明VCAM-1表达是从mRNA转录水平开始的，而不像P-选择素那样先合成后贮藏在胞内，当受到刺激时仅从胞内释放至胞膜表面而起作用。另外，我们观察到：在高血脂早期，VCAM-1的表达仅局限于内膜表面抗Ⅷ因子阳性的细胞，即血管内皮细胞；而当AS病灶出现后，表达VCAM-1的不光是血管内皮细胞，还有病灶内的细胞，SMA免疫组织化学显示主要是平滑肌细胞。据最近报道[ 4 ]体外培养的平滑肌细胞受细胞因子刺激后可表达VCAM-1，据此，我们推测：在活体内单核细胞粘附、进入内膜后分化成为巨噬细胞，其合成分泌的某些细胞因子、炎性介质刺激了平滑肌细胞，使其表达VCAM-1。另外，随着低密度脂蛋白(LDL)的积聚，氧化低密度脂蛋白(oxLDL )生成增加，同样能刺激平滑肌细胞表达VCAM-1。因此，从时程上来看平滑肌细胞表达VCAM-1应晚于血管内皮细胞。至于平滑肌细胞表达VCAM-1对于AS形成的意义还有待进一步研究。
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已知正常动脉内皮细胞不表达VCAM-1，只有当其受到炎性介质或其他刺激时才会表达，而另一类重要的粘附分子ICAM-1在正常血管内皮细胞有持续表达[5]。另外，VCAM-1的配体是VLA4，后者存在于单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞，而中性粒细胞却缺乏该配体，这有助于解释AS早期为什么单核细胞、淋巴细胞与血管内皮细胞发生粘附，而中性粒细胞不与内皮细胞粘附。这也支持VCAM-1是介导AS早期单核细胞-血管内皮细胞粘附的主要粘附分子的观点，为此本研究选择了VCAM-1作为观察对象。当然参与单核细胞-血管内皮细胞粘附的可能还有P-选择素、E-选择素等粘附分子[ 1，6 ]。Peter 等[7]的研究结果显示，血VCAM-1含量与患者AS程度相关，而与血中ICAM-1、E-选择素、P-选择素含量无相关性，这从另一方面说明VCAM-1在AS形成中有重要作用。
高血脂激活VCAM-1基因表达机制尚未完全清楚。Pritchard等[ 8 ]研究认为，高血脂使血管内皮细胞生成氧自由基增多，后者可以激活转录因子NF-kB，从而启动粘附分子基因表达。另外，高血脂时动脉壁内生成的oxLDL及炎性介质均可促进粘附分子表达。
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(志谢 衷心感谢黄盛东博士、朱泉芳主任技师、周晓宁硕士给予的帮助与支持，感谢Myron Cybulsky博士、Zhu Yi博士惠赠VCAM-1单克隆抗体及cDNA 探针质粒。)
*国家自然科学基金资助项目,批准号39670316
作者简介：徐荣良，男，1963年4月生，博士，主治医师
作者单位：第二军医大学长海医院心血管内科，上海，200433；
张国元 吴宗贵 第二军攻大学长征医院心血管内科
陈晓东 刘延玲 第二军攻大学长海医院胸心外科
参考文献
1 Sakai A, Kume N, Nishi E, et al. P-selectin and vascular cell adhesion molecule-1 are focally expressed in aortas of hyper-cholesterolemic rabbits before intimal accumulation of macrophages and T lymphocytes[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17(2): 310
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2 苏慧慈 编. 原位杂交[M]. 北京: 中国科学技术出版社， 1994. 31～90
3 Cybulsky M, Gimbrone MA Jr. Endothelial expression of a mononuclear leukocyte adhesion molecule during atherogenesis[M]. Science， 1991，251(4995):788
4 Braun M, Pietsch P, Felix SB, et al. Modulation of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 on human coronary smooth muscle cells by cytokines[J]. J Mol Cell Cardiol，1995， 27(12): 2571
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5 苏静怡. 细胞粘附的生理与病理生理[J]. 生理科学进展，1996,27(4)：374
6 Kaneko M, Hayashi J, Saito I, et al. Probucol down regulates E-selectin expression on cultured human vascular endothelial cells[J].Arterioscler Thromb， 1996，16(8):1047
7 Peter K, Nawroth P, Conradt C, et al. Circulating vascular cell adhesion molecule-1 correlate with the extent of human atherosclerosis incontrast to circulating intercellular adhesion molecule-1, E-selectin, P-selectin, and thrombomodulin[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17(3): 505
8 Pritchard KA Jr, Groszek L, Smalley DM, et al. Low-density lipoprotein increases endothelial cell nitric oxide synthase generation of superoxide anion[J]. Circ Res，1995，77(3):510, 百拇医药
摘 要 目的：研究高血脂对主动脉血管细胞粘附分子1(VCAM-1)基因表达的影响。方法：采用胆固醇喂饲法建立兔高血脂模型，在喂饲后1，6周处死动物，应用组织原位杂交、免疫组织化学等方法检测主动脉VCAM-1的表达，并与正常组对比。结果：喂饲胆固醇1周后高血脂很快诱导主动脉内皮细胞表达VCAM-1，并在6周后动脉粥样硬化(AS)病灶内也有丰富表达。结论：高血脂促进动脉VCAM-1表达，是其促进AS发病的机制之一。
关键词：细胞粘附分子 基因表达 高脂血症 动脉粥样硬化
单核细胞与血管内皮细胞粘附是动脉粥样硬化(AS)形成过程中最早的现象之一，也是AS发生的重要环节，因此对介导两者粘附的粘附分子的研究已成为当前AS研究的热点。高血脂是AS的主要危险因素之一，已有研究表明它能促进单核细胞-血管内皮细胞的粘附[1]，其机制可能与粘附分子表达有关。为此我们采用组织原位杂交及免疫组织化学方法同时观察高血脂对血管细胞粘附分子1(VCAM-1)表达的影响。
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1 材料和方法
1.1 动物模型建立及标本的制备 雄性纯种新西兰兔12只，体质量2～2.5 kg，分为正常对照组4只，喂养1周高血脂组4只，喂养6周高血脂组4只。正常组喂饲普通颗粒饲料，高血脂组喂饲含0.5%胆固醇、5%鸡蛋黄粉、4%花生油的颗粒饲料，自由饮水。定期检测血清总胆固醇水平。到期时用戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉动物，放血处死后迅速剪取升主动脉，浸入液氮保存备用。
1.2 cRNA 探针的合成与标记 VCAM-1 cDNA探针由美国加里福尼亚大学Zhu Yi博士惠赠，载体为pCRⅡ质粒， 扩增后抽提、纯化、回收。质粒分别经XbaⅠ及HindⅢ 酶切并线形化后作为模板，合成反义及正义cRNA探针，长度约1.2 kb。标记试剂盒用Dig RNA Labeling Kit SP6/T7(Boehringer Mannheim 产品)。
1.3 组织原位杂交[2] 标本经4%多聚甲醛、蔗糖固定，冰冻切片，再用4%多聚甲醛固定，烘片后依次用PBS、TritonX-100/PBS洗，蛋白酶K消化，继用4%多聚甲醛-PBS固定，PBS-0.2%乙酸酐和2×SSC洗后进行杂交。杂交液成分：50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，5×SSC，5×Denhardt液，2% SDS，100 μg/ml鲑精DNA，3 ng/μl VCAM-1反义cRNA探针，48℃杂交12～16 h。之后经SSC、PBS梯度洗脱，碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab片段(Boehringer Mannheim 产品)25℃孵育4 h，PBS 洗后用洗脱液Ⅰ和洗脱液Ⅱ漂洗，NBT-BICP避光显色。经脱水、透明后封片，显微镜下观察。阳性反应为紫蓝色。实验设VCAM-1正义cRNA探针替代组作为阴性对照组。
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1.4 免疫组织化学 参照Cybulsky等[3]方法进行，略加改进。动脉组织冰冻切片-20℃丙酮固定5 min，然后按照免疫组织化学ABC法进行组织染色，一抗采用抗兔VCAM-1单克隆抗体(加拿大多伦多大学Myron Cybulsky博士惠赠，1∶100稀释)。用DAB显色，苏木精衬染，封片后在显微镜下观察。另设PBS阴性对照组。
1.5 统计学处理 实验数据均采用X±s表示，用非配对资料t检验方法统计处理。
2 结果
2.1 血清胆固醇测定 正常组血清总胆固醇浓度为(1.97±0.63) mmol/L，而高血脂组喂饲高脂饲料后1周血清总胆固醇达(11.29±0.34) mmol/L，3，6周分别为(13.06±0.1.70) mmol/L，(14.40±0.31) mmol/L，均比正常组明显增高(P<0.001)。
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2.2 原位杂交检测 组织原位杂交显示正常组动脉无VCAM-1 mRNA表达。而高脂喂饲后1周，升主动脉内膜即可见局灶性VCAM-1 mRNA显色；6周可见AS病灶处VCAM-1 mRNA显色较深，从内膜面到病灶深部均有，并且病灶内部显色更深。 正义cRNA探针组结果为阴性。
2.3 免疫组织化学检测 正常主动脉组织中无VCAM-1染色。高脂喂饲1周后升主动脉内膜表面内皮细胞即有VCAM-1染色，呈棕黄色(图1)。抗Ⅷ因子染色可见内皮细胞层完整。6周后出现明显的AS病灶，且VCAM-1染色更深，可见到病灶表面及内部均有染色，病灶内部染色更深(图2)。SMA免疫染色显示病灶内平滑肌细胞较多。PBS替代VCAM-1单抗组结果为阴性。
图1 高脂喂饲1周后主动脉内膜面VCAM-1免疫组织化学染色阳性(×400)
Fig 1 Positive immunostaining of VCAM-1 in aorta intima after 1 week of cholesterol feeding (×400)
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图2 高脂喂饲6周后主动脉AS病灶VCAM-1免疫组织化学染色阳性(×400)
Fig 2 Positive immunostaining of VCAM-1 in aorta atherosclerotic plaque after 6 weeks of cholesterol feeding (×400)
3 讨论
本研究结果显示，喂饲高胆固醇饲料后1周，兔血清总胆固醇即由1.97 mmol/L上升至11.29 mmol/L，并一直维持在较高水平。与此同时，主动脉原位杂交显示，1周时血管内膜即有明显的VCAM-1 mRNA 表达，至6周出现AS病灶时仍有表达，且更加丰富，提示在高血脂促进AS形成的过程中，VCAM-1基因很早就被激活并持续表达。本研究免疫组织化学结果与Sakai等[1]的结果相似，且显示VCAM-1的表达在时间、部位及程度上与原位杂交结果相吻合，从而使VCAM-1基因表达在mRNA及蛋白质水平两个层面得到印证，表明VCAM-1表达是从mRNA转录水平开始的，而不像P-选择素那样先合成后贮藏在胞内，当受到刺激时仅从胞内释放至胞膜表面而起作用。另外，我们观察到：在高血脂早期，VCAM-1的表达仅局限于内膜表面抗Ⅷ因子阳性的细胞，即血管内皮细胞；而当AS病灶出现后，表达VCAM-1的不光是血管内皮细胞，还有病灶内的细胞，SMA免疫组织化学显示主要是平滑肌细胞。据最近报道[ 4 ]体外培养的平滑肌细胞受细胞因子刺激后可表达VCAM-1，据此，我们推测：在活体内单核细胞粘附、进入内膜后分化成为巨噬细胞，其合成分泌的某些细胞因子、炎性介质刺激了平滑肌细胞，使其表达VCAM-1。另外，随着低密度脂蛋白(LDL)的积聚，氧化低密度脂蛋白(oxLDL )生成增加，同样能刺激平滑肌细胞表达VCAM-1。因此，从时程上来看平滑肌细胞表达VCAM-1应晚于血管内皮细胞。至于平滑肌细胞表达VCAM-1对于AS形成的意义还有待进一步研究。
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已知正常动脉内皮细胞不表达VCAM-1，只有当其受到炎性介质或其他刺激时才会表达，而另一类重要的粘附分子ICAM-1在正常血管内皮细胞有持续表达[5]。另外，VCAM-1的配体是VLA4，后者存在于单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞，而中性粒细胞却缺乏该配体，这有助于解释AS早期为什么单核细胞、淋巴细胞与血管内皮细胞发生粘附，而中性粒细胞不与内皮细胞粘附。这也支持VCAM-1是介导AS早期单核细胞-血管内皮细胞粘附的主要粘附分子的观点，为此本研究选择了VCAM-1作为观察对象。当然参与单核细胞-血管内皮细胞粘附的可能还有P-选择素、E-选择素等粘附分子[ 1，6 ]。Peter 等[7]的研究结果显示，血VCAM-1含量与患者AS程度相关，而与血中ICAM-1、E-选择素、P-选择素含量无相关性，这从另一方面说明VCAM-1在AS形成中有重要作用。
高血脂激活VCAM-1基因表达机制尚未完全清楚。Pritchard等[ 8 ]研究认为，高血脂使血管内皮细胞生成氧自由基增多，后者可以激活转录因子NF-kB，从而启动粘附分子基因表达。另外，高血脂时动脉壁内生成的oxLDL及炎性介质均可促进粘附分子表达。
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(志谢 衷心感谢黄盛东博士、朱泉芳主任技师、周晓宁硕士给予的帮助与支持，感谢Myron Cybulsky博士、Zhu Yi博士惠赠VCAM-1单克隆抗体及cDNA 探针质粒。)
*国家自然科学基金资助项目,批准号39670316
作者简介：徐荣良，男，1963年4月生，博士，主治医师
作者单位：第二军医大学长海医院心血管内科，上海，200433；
张国元 吴宗贵 第二军攻大学长征医院心血管内科
陈晓东 刘延玲 第二军攻大学长海医院胸心外科
参考文献
1 Sakai A, Kume N, Nishi E, et al. P-selectin and vascular cell adhesion molecule-1 are focally expressed in aortas of hyper-cholesterolemic rabbits before intimal accumulation of macrophages and T lymphocytes[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17(2): 310
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2 苏慧慈 编. 原位杂交[M]. 北京: 中国科学技术出版社， 1994. 31～90
3 Cybulsky M, Gimbrone MA Jr. Endothelial expression of a mononuclear leukocyte adhesion molecule during atherogenesis[M]. Science， 1991，251(4995):788
4 Braun M, Pietsch P, Felix SB, et al. Modulation of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 on human coronary smooth muscle cells by cytokines[J]. J Mol Cell Cardiol，1995， 27(12): 2571
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5 苏静怡. 细胞粘附的生理与病理生理[J]. 生理科学进展，1996,27(4)：374
6 Kaneko M, Hayashi J, Saito I, et al. Probucol down regulates E-selectin expression on cultured human vascular endothelial cells[J].Arterioscler Thromb， 1996，16(8):1047
7 Peter K, Nawroth P, Conradt C, et al. Circulating vascular cell adhesion molecule-1 correlate with the extent of human atherosclerosis incontrast to circulating intercellular adhesion molecule-1, E-selectin, P-selectin, and thrombomodulin[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17(3): 505
8 Pritchard KA Jr, Groszek L, Smalley DM, et al. Low-density lipoprotein increases endothelial cell nitric oxide synthase generation of superoxide anion[J]. Circ Res，1995，77(3):510, 百拇医药