206例静脉毒瘾者和211例性乱者HGV感染状况
马伟杭 范骏 许毅 俞云松 陈亚岗 马亦林
摘 要：对206例静脉毒瘾者和211例性乱女子进行了HGV感染状况的研究。HGV PCR选择扩增位于5’非结构区基因组(NS5区)，扩增产物为190bp。结果：206例静脉毒瘾者HGV感染率为18.4%(38/206)，其抗HGV-IgG和HGV-RNA的检出率分别为12.1%(25/206)、9.2%(19/206)，两者同时阳性的检出率为2.9%(6/206)；211例性乱者HGV感染率6.6%(14/211)，其抗HGV-IgG和HGV-RNA的检出率分别为1.4%(3/211)、5.2%(11/211)，没有检测到两者同时阳性。HGV标志阳性52例中HBV-DNA均为阴性。HCV-RNA阳性10例，其中8例为抗HGV-IgG阳性，2例为HGV-RNA阳性。HCV-RNA阳性者8例分布在静脉毒瘾组，性乱组仅为2例。检测52例HGV感染者ALT均属正常范围。我们的研究发现静脉毒瘾者和性乱者HGV血清标志的检出率显著高于献血员和非甲—戊肝炎患者的HGV血清标志检出率，证实了静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群，HGV也可通过性接触而传播。
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关键词：肝炎病毒 庚型 静脉毒瘾者 性乱者 PCR▲
庚型肝炎病毒(HGV)是一种RNA病毒，其主要经输血及注射途径传播，常常导致持续病毒血症，但不表现临床症状或仅表现出轻微的临床症状。据报道：静脉毒瘾者、性乱者和输血者是HGV感染的高危人群。为了解HGV在这些人群中的感染状况，我们对206例静脉毒瘾者和211例性乱女子进行了HGV感染状况的研究，现报告如下。
材料与方法
1.标本来源：取自浙江某强制戒毒所的静脉毒瘾者和女子监狱的性乱者共417例，均为女性；其中静脉毒瘾者206例，性乱者211例，年龄18～37岁。标本采集后分离血清，-20℃以下冻存，统一检测。
2.标本RNA的提取和血清的预处理：
2.1.取新鲜血清30μl，用TRizol(GibcoBRL公司)、氯仿、酒精处理，再用冰异丙醇沉淀2小时，上清用于DNA PCR，沉淀用于逆转录PCR。
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2.2.取新鲜血清5μl，用灭菌PBS 1∶20稀释，取100μl进行ELISA测定。
3.PCR引物及阳性对照：
3.1.根据已发表的HGV/GBV-C基因组序列，选择扩增位于5’非结构区基因组(NS5区)，外引物1：5’-GGCCAAAAGGTGGTGGATGG-3’，外引物2∶5’-GGTCCACGTCGCCCTTCAAT-3’，编码7182-7572基因组，扩增产物为390bp；内引物1∶5’-GTGATGACAGGGTTGGTAGG-3’，内引物2∶5’-GGCAAAC GACGCCCACGTAC-3’，编码7300-7489基因组，扩增产物为190bp。
3.2.根据已发表的HCV基因组序列，选择扩增位于5’非结构区基因组，外引物1∶5’-ACTCCACCATGAATCACTCCC-3’，外引物2∶5’-AACACTACTCGGCTAGCAGT-3’，编码9-332基因组，扩增产物为323bp；内引物1∶5’-TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3’，外引物2∶5’-GTTTATCCAAGAAAGGACCC-3’，编码36-265基因组，扩增产物为230bp。
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3.3.根据已发表的HBV基因组序列，选择扩增位于S区，引物1∶5’-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCT-3’，引物2∶5-CGAACCACTGAACAAATGGCACT-3’，编码1948-2297基因组，扩增产物为350(bp)。上述引物均由北京军事科学院合成并提供HGV、HCV阳性血清及HBV-DNA质粒。
4.PCR反应及产物的电泳分析：Taq聚合酶，AMV；10×扩增缓冲液，四种dNTP，100bp Ladder为Promega公司产品，PCR扩增仪为PERKIN ELMER公司生产的2400型，数字成像系统为美国Alpha innOtech Corporation生产的IS-1000型。
4.1.HBV/HCV RT-nested-PCR第一轮反应取外引物，实验过程：42℃逆转录45分钟，94℃预变性3分钟；再按94℃35秒、55℃20秒、72℃45秒顺序，依次循环33次，72℃延伸5分钟；第二轮反应取内引物、1.5μl第一轮扩增产物，实验过程：94℃预变性3分钟；再按94℃30秒、55℃20秒、72℃40秒顺序，依次循环35次，72℃延伸10分钟。
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4.2.HBV PCR实验过程：94℃预变性2分钟；再按94℃30秒、55℃30秒、72℃60秒顺序，依次循环35次，72℃延伸5分钟。上述各PCR扩增产物均取20μl在2%琼脂糖上电泳(5v/cm)30分钟，并用溴化乙锭进行染色，紫外灯下观察结果。操作过程严格防止污染。
5.ELISA反应的检测：IgG-HGV试剂盒购自北京军科院，板条采用人工合成HGV基因组C区和NS3区的多肽包被，酶采用辣根过氧化物标记的单克隆抗人IgG，底物采用TMB显色系统。酶标仪为美国BIO-RAD3550型，洗板仪为美国Multiwash型。实验过程：血清加样(1∶20)37℃60分钟，加HRP-抗体37℃60分钟，加TMB显色。
6.ALT检测：采用日本HITACHI 7170型全自动生化分析仪检测。
结果
1.引物的特异性试验：为了测定所选择的引物是否只扩增HGV、HCV、HBV的特定序列，故对不同来源的模板DNA进行扩增反应，包括人巨细胞病毒(HCMV)、EB病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、阴性血清及军科院提供的阳性对照等。结果表明只有阳性对照出现特异性扩增条带，其余模板均未出现相应条带。说明合成的引物具有较强的特异性(图1)。
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图1 引物特异性试验结果
M.分子量标志 1.HGV 2.HCV 3.HBV 4.HCMV
5.EBV 6.HSV 7.VZV 8.阴性血清
2.检测结果：
2.1.HGV的感染情况：206例静脉毒瘾者HGV感染率为18.4%(38/206)，其抗HGV-IgG和HGV-RNA的检出率分别为12.1%(25/206)、9.2%(19/206)，两者同时阳性的检出率为2.9%(6/206)；211例性乱者HGV感染率6.6%(14/211)，其抗HGV-IgG和HGV-RNA的检出率分别为1.4%(3/211)、5.2%(11/211)，没有检测到两者同时阳性，见表1。PCR部分结果见图2。
表1 HGV标志阳性分布情况
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标本
例数
HGV感染 例数(%)
抗HGV-IgG
阳性例数(%)
HGV-RNA
阳性例数(%)
双阳性
例数(%)
毒瘾者
206
38(18.4)
25(12.1)
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19(9.2)
6(2.9)
性乱者
211
14(6.6)
3(1.4)
11(5.2)
0
图2 HGV PCR部分结果
M.分子量标志 1-6.检测标本 7.阳性对照 8.阴性对照
2.2.HGV感染者其它肝炎病毒的感染情况：
, http://www.100md.com 2.2.1.HGV标志阳性52例中HBV-DNA均为阴性。
2.2.2.HGV标志阳性52例中HCV-RNA阳性10例，其中8例为抗HGV-IgG阳性，2例为HGV-RNA阳性。静脉毒瘾组中有8例HCV-RNA阳性，而性乱组仅2例HCV-RNA阳性。
2.3.检测52例HGV感染者ALT均属正常范围。
讨论
HGV主要通过输血和注射途径传播。Wu等[1]报道85名静脉毒瘾者HGV RNA阳性率高达75.3%，而供血员仅为2%。Stark等[2]发现，长期静脉毒瘾者血清HGV RNA阳性率为33%，此均表明，静脉毒瘾者是感染HGV的高危人群。我们的研究发现206例静脉毒瘾者HGV血清标志的检出率为18.45%，显著高于我们报道的献血员和非甲—戊肝炎患者的HGV血清标志检出率(3.3%和11.1%)[3]，与李刚等报道相似(17.86%)[4]，此证实了静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群。本研究中211例性乱女子的HGV阳性率为6.64%，其阳性率也显著高于供血员。Persico等在精浆标本中检出HGV RNA，提示HGV可通过精液传播[5]，因而有理由相信性乱者也是HGV感染的高危人群，HGV可通过性接触而传播。
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对本文中54例HGV感染者进行其它肝炎病毒指标的检测发现HBV DNA均阴性，而HCV-RNA有10例为阳性，其中8例分布在静脉毒瘾组，性乱组仅为2例，此也表明HGV和HCV混合感染的存在可能与同一感染途径——注射途径相关。
最近的研究发现，HGV感染者大多症状轻微或没有症状[6]，我们的研究也发现54例HGV感染者，其肝功能指标均在正常范围，有待进一步观察。■
作者单位：马伟杭(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
范骏(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
许毅(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
俞云松(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
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陈亚岗(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
马亦林(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
参考文献：
[1]Wu RR，et al.J Infect Dis，1997，175(1)：168-171
[2]Stark K，et al.J Infect Dis，1996，174(6)：1320-1323
[3]焦杨文，等.杭州地区某些人群中庚型肝炎病毒抗体分布.浙江医科大学学报，1997，26(6)
[4]李刚，陈青，姚集鲁，等.静脉毒瘾者84例HGV感染状况.中华传染病杂志，1998，16(1)：26～28
[5]江应安.庚型肝炎研究近况.《国外医学》流行病学传染病学分册，1997，24(6)：269～272
[6]凌斌华.庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)致病性的研究进展.《国外医学》流行病学传染病学分册，1998，25(1)：1～5, 百拇医药
摘 要：对206例静脉毒瘾者和211例性乱女子进行了HGV感染状况的研究。HGV PCR选择扩增位于5’非结构区基因组(NS5区)，扩增产物为190bp。结果：206例静脉毒瘾者HGV感染率为18.4%(38/206)，其抗HGV-IgG和HGV-RNA的检出率分别为12.1%(25/206)、9.2%(19/206)，两者同时阳性的检出率为2.9%(6/206)；211例性乱者HGV感染率6.6%(14/211)，其抗HGV-IgG和HGV-RNA的检出率分别为1.4%(3/211)、5.2%(11/211)，没有检测到两者同时阳性。HGV标志阳性52例中HBV-DNA均为阴性。HCV-RNA阳性10例，其中8例为抗HGV-IgG阳性，2例为HGV-RNA阳性。HCV-RNA阳性者8例分布在静脉毒瘾组，性乱组仅为2例。检测52例HGV感染者ALT均属正常范围。我们的研究发现静脉毒瘾者和性乱者HGV血清标志的检出率显著高于献血员和非甲—戊肝炎患者的HGV血清标志检出率，证实了静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群，HGV也可通过性接触而传播。
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关键词：肝炎病毒 庚型 静脉毒瘾者 性乱者 PCR▲
庚型肝炎病毒(HGV)是一种RNA病毒，其主要经输血及注射途径传播，常常导致持续病毒血症，但不表现临床症状或仅表现出轻微的临床症状。据报道：静脉毒瘾者、性乱者和输血者是HGV感染的高危人群。为了解HGV在这些人群中的感染状况，我们对206例静脉毒瘾者和211例性乱女子进行了HGV感染状况的研究，现报告如下。
材料与方法
1.标本来源：取自浙江某强制戒毒所的静脉毒瘾者和女子监狱的性乱者共417例，均为女性；其中静脉毒瘾者206例，性乱者211例，年龄18～37岁。标本采集后分离血清，-20℃以下冻存，统一检测。
2.标本RNA的提取和血清的预处理：
2.1.取新鲜血清30μl，用TRizol(GibcoBRL公司)、氯仿、酒精处理，再用冰异丙醇沉淀2小时，上清用于DNA PCR，沉淀用于逆转录PCR。
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2.2.取新鲜血清5μl，用灭菌PBS 1∶20稀释，取100μl进行ELISA测定。
3.PCR引物及阳性对照：
3.1.根据已发表的HGV/GBV-C基因组序列，选择扩增位于5’非结构区基因组(NS5区)，外引物1：5’-GGCCAAAAGGTGGTGGATGG-3’，外引物2∶5’-GGTCCACGTCGCCCTTCAAT-3’，编码7182-7572基因组，扩增产物为390bp；内引物1∶5’-GTGATGACAGGGTTGGTAGG-3’，内引物2∶5’-GGCAAAC GACGCCCACGTAC-3’，编码7300-7489基因组，扩增产物为190bp。
3.2.根据已发表的HCV基因组序列，选择扩增位于5’非结构区基因组，外引物1∶5’-ACTCCACCATGAATCACTCCC-3’，外引物2∶5’-AACACTACTCGGCTAGCAGT-3’，编码9-332基因组，扩增产物为323bp；内引物1∶5’-TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3’，外引物2∶5’-GTTTATCCAAGAAAGGACCC-3’，编码36-265基因组，扩增产物为230bp。
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3.3.根据已发表的HBV基因组序列，选择扩增位于S区，引物1∶5’-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCT-3’，引物2∶5-CGAACCACTGAACAAATGGCACT-3’，编码1948-2297基因组，扩增产物为350(bp)。上述引物均由北京军事科学院合成并提供HGV、HCV阳性血清及HBV-DNA质粒。
4.PCR反应及产物的电泳分析：Taq聚合酶，AMV；10×扩增缓冲液，四种dNTP，100bp Ladder为Promega公司产品，PCR扩增仪为PERKIN ELMER公司生产的2400型，数字成像系统为美国Alpha innOtech Corporation生产的IS-1000型。
4.1.HBV/HCV RT-nested-PCR第一轮反应取外引物，实验过程：42℃逆转录45分钟，94℃预变性3分钟；再按94℃35秒、55℃20秒、72℃45秒顺序，依次循环33次，72℃延伸5分钟；第二轮反应取内引物、1.5μl第一轮扩增产物，实验过程：94℃预变性3分钟；再按94℃30秒、55℃20秒、72℃40秒顺序，依次循环35次，72℃延伸10分钟。
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4.2.HBV PCR实验过程：94℃预变性2分钟；再按94℃30秒、55℃30秒、72℃60秒顺序，依次循环35次，72℃延伸5分钟。上述各PCR扩增产物均取20μl在2%琼脂糖上电泳(5v/cm)30分钟，并用溴化乙锭进行染色，紫外灯下观察结果。操作过程严格防止污染。
5.ELISA反应的检测：IgG-HGV试剂盒购自北京军科院，板条采用人工合成HGV基因组C区和NS3区的多肽包被，酶采用辣根过氧化物标记的单克隆抗人IgG，底物采用TMB显色系统。酶标仪为美国BIO-RAD3550型，洗板仪为美国Multiwash型。实验过程：血清加样(1∶20)37℃60分钟，加HRP-抗体37℃60分钟，加TMB显色。
6.ALT检测：采用日本HITACHI 7170型全自动生化分析仪检测。
结果
1.引物的特异性试验：为了测定所选择的引物是否只扩增HGV、HCV、HBV的特定序列，故对不同来源的模板DNA进行扩增反应，包括人巨细胞病毒(HCMV)、EB病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、阴性血清及军科院提供的阳性对照等。结果表明只有阳性对照出现特异性扩增条带，其余模板均未出现相应条带。说明合成的引物具有较强的特异性(图1)。
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图1 引物特异性试验结果
M.分子量标志 1.HGV 2.HCV 3.HBV 4.HCMV
5.EBV 6.HSV 7.VZV 8.阴性血清
2.检测结果：
2.1.HGV的感染情况：206例静脉毒瘾者HGV感染率为18.4%(38/206)，其抗HGV-IgG和HGV-RNA的检出率分别为12.1%(25/206)、9.2%(19/206)，两者同时阳性的检出率为2.9%(6/206)；211例性乱者HGV感染率6.6%(14/211)，其抗HGV-IgG和HGV-RNA的检出率分别为1.4%(3/211)、5.2%(11/211)，没有检测到两者同时阳性，见表1。PCR部分结果见图2。
表1 HGV标志阳性分布情况
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标本
例数
HGV感染 例数(%)
抗HGV-IgG
阳性例数(%)
HGV-RNA
阳性例数(%)
双阳性
例数(%)
毒瘾者
206
38(18.4)
25(12.1)
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19(9.2)
6(2.9)
性乱者
211
14(6.6)
3(1.4)
11(5.2)
0
图2 HGV PCR部分结果
M.分子量标志 1-6.检测标本 7.阳性对照 8.阴性对照
2.2.HGV感染者其它肝炎病毒的感染情况：
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2.2.2.HGV标志阳性52例中HCV-RNA阳性10例，其中8例为抗HGV-IgG阳性，2例为HGV-RNA阳性。静脉毒瘾组中有8例HCV-RNA阳性，而性乱组仅2例HCV-RNA阳性。
2.3.检测52例HGV感染者ALT均属正常范围。
讨论
HGV主要通过输血和注射途径传播。Wu等[1]报道85名静脉毒瘾者HGV RNA阳性率高达75.3%，而供血员仅为2%。Stark等[2]发现，长期静脉毒瘾者血清HGV RNA阳性率为33%，此均表明，静脉毒瘾者是感染HGV的高危人群。我们的研究发现206例静脉毒瘾者HGV血清标志的检出率为18.45%，显著高于我们报道的献血员和非甲—戊肝炎患者的HGV血清标志检出率(3.3%和11.1%)[3]，与李刚等报道相似(17.86%)[4]，此证实了静脉毒瘾者是HGV感染的高危人群。本研究中211例性乱女子的HGV阳性率为6.64%，其阳性率也显著高于供血员。Persico等在精浆标本中检出HGV RNA，提示HGV可通过精液传播[5]，因而有理由相信性乱者也是HGV感染的高危人群，HGV可通过性接触而传播。
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对本文中54例HGV感染者进行其它肝炎病毒指标的检测发现HBV DNA均阴性，而HCV-RNA有10例为阳性，其中8例分布在静脉毒瘾组，性乱组仅为2例，此也表明HGV和HCV混合感染的存在可能与同一感染途径——注射途径相关。
最近的研究发现，HGV感染者大多症状轻微或没有症状[6]，我们的研究也发现54例HGV感染者，其肝功能指标均在正常范围，有待进一步观察。■
作者单位：马伟杭(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
范骏(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
许毅(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
俞云松(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
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陈亚岗(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
马亦林(浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310003)
参考文献：
[1]Wu RR，et al.J Infect Dis，1997，175(1)：168-171
[2]Stark K，et al.J Infect Dis，1996，174(6)：1320-1323
[3]焦杨文，等.杭州地区某些人群中庚型肝炎病毒抗体分布.浙江医科大学学报，1997，26(6)
[4]李刚，陈青，姚集鲁，等.静脉毒瘾者84例HGV感染状况.中华传染病杂志，1998，16(1)：26～28
[5]江应安.庚型肝炎研究近况.《国外医学》流行病学传染病学分册，1997，24(6)：269～272
[6]凌斌华.庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)致病性的研究进展.《国外医学》流行病学传染病学分册，1998，25(1)：1～5, 百拇医药