抗鼠IgD特异性单克隆抗体414/DF可变区基因的克隆和cDNA序列测定
葛乐 韩骅 苏成芝 药立波 王字玲 陈萍 陈梅红
摘 要 目的：克隆鼠抗鼠D型免疫球蛋白特异性单克隆抗体414/DF可变区基因. 方法：从培养的可分泌高亲和力抗鼠IgD特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞414/DF提取总RNA，反转录成cDNA，用合成的一对寡核苷酸引物从中扩增了抗体可变区基因，经克隆入pUC19质粒，进行核苷酸序列分析. 结果：所克隆基因分别长357 bp和327 bp，编码119和109个氨基酸，均含3个抗原互补决定区和4个框架区，并含有维持抗体结构所必须的2个半胱氨酸，计算机分析与发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性. 结论：所克隆基因为新的功能性重排的小鼠抗体可变区基因.
关键词：IgD 单克隆抗体 基因 克隆 碱基序列
0 引言
D型免疫球蛋白在血清中含量很低，存在于90%以上的成熟B淋巴细胞表面，是一种膜表面免疫球蛋白(sIg). 近年来IgD作为B淋巴细胞表面的重要受体，在识别抗原，激发B淋巴细胞和调节免疫反应上的重要作用受到越来越多的关注[1]. 也有研究表明，抗免疫球蛋白的抗体与成熟B淋巴细胞表面的膜免疫球蛋白交联，可导致B细胞周期停滞于G1期，进而发生细胞凋亡[2]. 所以抗Ig抗体被广泛应用于研究sIg受体在B细胞活化及活化后凋亡中的作用，在清除自身反应性B淋巴细胞及治疗相关疾病方面也具有很大的潜在应用价值[3]. 本实验旨在用基因工程抗体技术，从分泌鼠anti-IgD特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株414/DF中扩增和克隆重、轻链可变区基因，并测定其核苷酸序列，为其进一步应用打下基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 小鼠杂交瘤细胞株414/DF为日本京都大学Tokuhisa博士建株并提供，此细胞可分泌高亲和力特异性鼠抗鼠IgD单克隆抗体IgG2a[4]. 克隆载体及菌种 为本室保存. 所用试剂除特殊提到外均为德国Boehringer Mannhein公司和华美公司产品.
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取 用异硫氰酸胍一步法按文献[5]进行，将从1×107细胞中所提取的细胞总RNA溶解于50 μL水中，紫外定量. 取10 μg胞浆总RNA在20 μL体积中用美国Promega公司反转录试剂盒进行反转录，cDNA第一链于-20 ℃保存.
1.2.2 PCR反应及其产物克隆 根据抗体可变区基因序列的保守性，合成了针对重链和轻链可变区的通用引物[6]，引物序列如下.
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VH-1 (正向) 5' GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG 3'
VH-2 (反向) 5' ATGTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC 3'
VL-1 (正向) 5' GTGAATTCATGGACATTGTGATGACCCAGTCTCC 3'
VL-2 (反向) 5' CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 3'
在MJ RESEARCH公司的PCR反应仪上进行聚合酶链式反应扩增重、轻链可变区基因，取20 μL PCR产物经EcoRI和Sal I酶切，用Glassmilk回收琼脂糖凝胶电泳所见的扩增片段，克隆入pUC19载体，酶切筛选出含插段的阳性克隆.
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1.2.3 核苷酸序列测定 取经FPLC Q柱纯化过的质粒(0.2 g/L) 10 μL为模板，以荧光标记引物，用美国PE317A型DNA自动测序仪进行核苷酸序列测定，计算机分析所得结果.
2 结果
2.1 414/DF可变区基因的扩增 用通用引物扩增414/DF的可变区基因，20 g/L琼脂糖凝胶电泳分别观察到360 bp和330 bp大小的片段(Fig 1).
图1 414/DF可变区基因的扩增
Fig 1 PCR amplification of variable region genes of 414/DF
M: pGEM-7zf/Hea Ⅲ; H: PCR product of VH gene; L: PCR product of VL gene.
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2.2 扩增片段的克隆 PCR产物经酶切后分别克隆入pUC19载体中，并转化DH5 α感受态细胞.经蓝白筛选，随机各挑选4个白色克隆，小量提取质粒后酶切鉴定 ，分别得到含插入片段的克隆3个(Fig 2).
图2 pUC19-VH,pUC19-VL阳性克隆的鉴定
Fig 2 Checking of the positive clones of pUC19-VH, pUC19-VL
1～4:Digestion of recombinant of pUC19-VH with EcoR Ⅰ plus Sal Ⅰ; 5～8: Digestion of recombinant of pUC19-VL with EcoRⅠ plus Sal Ⅰ; M:pGEM-7zf/Hea Ⅲ.
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2.3 核苷酸序列测定 挑选阳性克隆各2个,大量提取质粒，经FPLC纯化后测序，得到符合抗体重、轻链可变区结构的基因序列各1个，结果见Fig 3，4. 其特点为：①序列两端含PCR引物及正确的酶切位点. 重、轻链分别长357 bp和327 bp，与PCR结果相符. ②重、轻链基因分别编码119和109个氨基酸，含3个CDR区和4个FR区，并含有维持抗体结构所必须的2个半胱氨酸残基. ③序列经计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性，而无相同序列.
3 讨论
自从本世纪80年代中期PCR技术问世以来，经杂交瘤技术制备单克隆抗体，用反转录PCR法从杂交瘤细胞中扩增和克隆单抗可变区基因的技术已日臻成熟. 我们采用针对可变区基因5'端信号肽序列和J基因3'端序列设计合成的通用引物，成功地从杂交瘤细胞中扩增出重、轻链可变区基因，经在计算机网络GENE BANK数据库同源性分析表明，与已发表的小鼠抗体可变区基因序列有较高的同源性[7,8]，而无相同序列的基因，获得了新的功能性重排的小鼠抗体可变区基因，为抗IgD基因工程抗体的进一步研究奠定了基础. 实验中还得到了一个突变基因和一个错误重排的可变区基因片段, 我们研究室也有过类似报道[9]. 用通用引物扩增抗体基因时，会扩增出一些非功能性基因,因此实验中多挑几个克隆进行序列测定及与最新的基因数据库进行计算机同源性分析非常必要.
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近年来有很多关于利用抗免疫球蛋白抗体与B淋巴细胞表面的sIg交联进行免疫耐受和B淋巴细胞与T淋巴细胞间相互作用及信号转导方面的研究报道[10]. 本实验成功地从培养的可分泌高亲和力特异性抗鼠IgD单克隆抗体的杂交瘤细胞414/DF中扩增和克隆了抗体可变区基因，序列分析表明可编码正确的小鼠抗体可变区，为在基因水平上对该抗体进行基因工程改造,或与其它功能性基团如特异性识别自身反应性B淋巴细胞的基因相连构建双功能抗体奠定了基础. 单链抗体基因的拼接与表达工作正在进行中.
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图3 VH基因核苷酸序列及氨基酸序列推导
Fig 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of VH gene
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图4 VL基因核苷酸序列及氨基酸序列推导
Fig4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of VL gene
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作者简介：葛 乐，女，1965-10-12生，天津市人，汉族. 1989年第四军医大学毕业，1995年级博士研究生，导师苏成芝. 电话：(029)3375267
作者单位：葛 乐 韩 骅 苏成芝 药立波 王字玲 陈 萍 陈梅红 第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室 陕西 西安 710033
参考文献
1.Nitschke L,Kosco MH,Kohler G.Immunoglobulin D-deficient mice can mout normal immune responses to thymus-independent and dependent antigen.Proc Natl Acad Sci USA， 1993;90(5):1887-1891
2.Parry SL,Holman MJ.Plastic-immobilized anti-mu or anti-delta antibodies induce apoptosis in mature murine B lymphicytes.Eur J Immunol，1994;24(4):974-979
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3.Shirai A,Aoki I,Otani M.Treatment with dextran-conjugated anti-IgD delays the development of autoimmunity in MRL-lpr/lpr mice.J Immunol，1994;153(4):1889-1894
4.Nomura T,Han Hua,Honjo T.Antigen receptor-mediated B cell death is blocked by signaling via CD72 or treatment with dextran sulfate and is defective in autoimmunity-prone mice.Int Immunol，1995;8(6):867-875
5.Chromzynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenal-chloroform extraction.Anal Biochem.1987;162(2):156-163
, http://www.100md.com
6.杨安钢,吉昌华,韩 骅.抗人CD8单克隆抗体κ轻链可变区基因的克隆和序列测定.生物化学与生物物理进展，1992;19(4):286
7.Kettleborough CA,Saldanha J,Ansell KH. Optimization of primers for cloning libraries of mouse immunoglobulin genes using the polymerase chain reaction.Eur J Immunol，1993;23:206-211
8.Rodney MF,Brian G.Double recombination of a single immunoglobulin κ chain allele: Implications for the mechanisms of rearrangement.Proc Natl Acad Sci USA，1985;82(7):4793-4797
9.邓健蓓,韩 骅,苏成芝.抗人AFP抗体噬菌体呈现文库的构建筛选及基因序列测定.生物化学杂志，1996;12(6):648-653
10.Cooke MP,Heath AW,Shokat KM.Immunoglobulin signal transduction guides the specificity of B cell-T cell interactions and is blocked in tolerant self-reaction B cells.J Exp Med，1994;179(2):425-438, http://www.100md.com
摘 要 目的：克隆鼠抗鼠D型免疫球蛋白特异性单克隆抗体414/DF可变区基因. 方法：从培养的可分泌高亲和力抗鼠IgD特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞414/DF提取总RNA，反转录成cDNA，用合成的一对寡核苷酸引物从中扩增了抗体可变区基因，经克隆入pUC19质粒，进行核苷酸序列分析. 结果：所克隆基因分别长357 bp和327 bp，编码119和109个氨基酸，均含3个抗原互补决定区和4个框架区，并含有维持抗体结构所必须的2个半胱氨酸，计算机分析与发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性. 结论：所克隆基因为新的功能性重排的小鼠抗体可变区基因.
关键词：IgD 单克隆抗体 基因 克隆 碱基序列
0 引言
D型免疫球蛋白在血清中含量很低，存在于90%以上的成熟B淋巴细胞表面，是一种膜表面免疫球蛋白(sIg). 近年来IgD作为B淋巴细胞表面的重要受体，在识别抗原，激发B淋巴细胞和调节免疫反应上的重要作用受到越来越多的关注[1]. 也有研究表明，抗免疫球蛋白的抗体与成熟B淋巴细胞表面的膜免疫球蛋白交联，可导致B细胞周期停滞于G1期，进而发生细胞凋亡[2]. 所以抗Ig抗体被广泛应用于研究sIg受体在B细胞活化及活化后凋亡中的作用，在清除自身反应性B淋巴细胞及治疗相关疾病方面也具有很大的潜在应用价值[3]. 本实验旨在用基因工程抗体技术，从分泌鼠anti-IgD特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株414/DF中扩增和克隆重、轻链可变区基因，并测定其核苷酸序列，为其进一步应用打下基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 小鼠杂交瘤细胞株414/DF为日本京都大学Tokuhisa博士建株并提供，此细胞可分泌高亲和力特异性鼠抗鼠IgD单克隆抗体IgG2a[4]. 克隆载体及菌种 为本室保存. 所用试剂除特殊提到外均为德国Boehringer Mannhein公司和华美公司产品.
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取 用异硫氰酸胍一步法按文献[5]进行，将从1×107细胞中所提取的细胞总RNA溶解于50 μL水中，紫外定量. 取10 μg胞浆总RNA在20 μL体积中用美国Promega公司反转录试剂盒进行反转录，cDNA第一链于-20 ℃保存.
1.2.2 PCR反应及其产物克隆 根据抗体可变区基因序列的保守性，合成了针对重链和轻链可变区的通用引物[6]，引物序列如下.
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VH-1 (正向) 5' GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG 3'
VH-2 (反向) 5' ATGTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC 3'
VL-1 (正向) 5' GTGAATTCATGGACATTGTGATGACCCAGTCTCC 3'
VL-2 (反向) 5' CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 3'
在MJ RESEARCH公司的PCR反应仪上进行聚合酶链式反应扩增重、轻链可变区基因，取20 μL PCR产物经EcoRI和Sal I酶切，用Glassmilk回收琼脂糖凝胶电泳所见的扩增片段，克隆入pUC19载体，酶切筛选出含插段的阳性克隆.
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1.2.3 核苷酸序列测定 取经FPLC Q柱纯化过的质粒(0.2 g/L) 10 μL为模板，以荧光标记引物，用美国PE317A型DNA自动测序仪进行核苷酸序列测定，计算机分析所得结果.
2 结果
2.1 414/DF可变区基因的扩增 用通用引物扩增414/DF的可变区基因，20 g/L琼脂糖凝胶电泳分别观察到360 bp和330 bp大小的片段(Fig 1).
图1 414/DF可变区基因的扩增
Fig 1 PCR amplification of variable region genes of 414/DF
M: pGEM-7zf/Hea Ⅲ; H: PCR product of VH gene; L: PCR product of VL gene.
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2.2 扩增片段的克隆 PCR产物经酶切后分别克隆入pUC19载体中，并转化DH5 α感受态细胞.经蓝白筛选，随机各挑选4个白色克隆，小量提取质粒后酶切鉴定 ，分别得到含插入片段的克隆3个(Fig 2).
图2 pUC19-VH,pUC19-VL阳性克隆的鉴定
Fig 2 Checking of the positive clones of pUC19-VH, pUC19-VL
1～4:Digestion of recombinant of pUC19-VH with EcoR Ⅰ plus Sal Ⅰ; 5～8: Digestion of recombinant of pUC19-VL with EcoRⅠ plus Sal Ⅰ; M:pGEM-7zf/Hea Ⅲ.
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2.3 核苷酸序列测定 挑选阳性克隆各2个,大量提取质粒，经FPLC纯化后测序，得到符合抗体重、轻链可变区结构的基因序列各1个，结果见Fig 3，4. 其特点为：①序列两端含PCR引物及正确的酶切位点. 重、轻链分别长357 bp和327 bp，与PCR结果相符. ②重、轻链基因分别编码119和109个氨基酸，含3个CDR区和4个FR区，并含有维持抗体结构所必须的2个半胱氨酸残基. ③序列经计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性，而无相同序列.
3 讨论
自从本世纪80年代中期PCR技术问世以来，经杂交瘤技术制备单克隆抗体，用反转录PCR法从杂交瘤细胞中扩增和克隆单抗可变区基因的技术已日臻成熟. 我们采用针对可变区基因5'端信号肽序列和J基因3'端序列设计合成的通用引物，成功地从杂交瘤细胞中扩增出重、轻链可变区基因，经在计算机网络GENE BANK数据库同源性分析表明，与已发表的小鼠抗体可变区基因序列有较高的同源性[7,8]，而无相同序列的基因，获得了新的功能性重排的小鼠抗体可变区基因，为抗IgD基因工程抗体的进一步研究奠定了基础. 实验中还得到了一个突变基因和一个错误重排的可变区基因片段, 我们研究室也有过类似报道[9]. 用通用引物扩增抗体基因时，会扩增出一些非功能性基因,因此实验中多挑几个克隆进行序列测定及与最新的基因数据库进行计算机同源性分析非常必要.
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近年来有很多关于利用抗免疫球蛋白抗体与B淋巴细胞表面的sIg交联进行免疫耐受和B淋巴细胞与T淋巴细胞间相互作用及信号转导方面的研究报道[10]. 本实验成功地从培养的可分泌高亲和力特异性抗鼠IgD单克隆抗体的杂交瘤细胞414/DF中扩增和克隆了抗体可变区基因，序列分析表明可编码正确的小鼠抗体可变区，为在基因水平上对该抗体进行基因工程改造,或与其它功能性基团如特异性识别自身反应性B淋巴细胞的基因相连构建双功能抗体奠定了基础. 单链抗体基因的拼接与表达工作正在进行中.
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图3 VH基因核苷酸序列及氨基酸序列推导
Fig 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of VH gene
D
I
V
M
, http://www.100md.com
T
Q
S
P
G
T
L
S
L
S
S
G
E
GAC
, 百拇医药
ATT
GTG
ATG
ACC
CAG
TCT
CCA
GGC
ACC
CTG
TCT
TTG
TCT
, 百拇医药
TCA
GGG
GAA
12
24
36
48
G
A
T
L
S
C
R
, http://www.100md.com
A
S
Q
S
V
S
N
G
Q
L
GGC
GCC
ACC
CTC
, 百拇医药
TCC
TGC
AGG
GCC
AGT
CAG
AGT
GTT
AGC
AAC
GGC
CAA
TTA
, 百拇医药
63
CDR1
75
87
99
T
W
Y
Q
Q
K
P
G
Q
, http://www.100md.com
A
P
R
L
L
I
Y
G
ACC
TGG
TAC
CAG
CAG
AAG
, 百拇医药
CCT
GGC
CAG
GCT
CCC
AGG
CTC
CTC
ATC
TAT
GGT
114
126
, 百拇医药
138
150
A
S
S
R
A
T
G
I
P
D
R
F
, http://www.100md.com
S
G
S
G
S
GCA
TCC
AGC
AGG
GCC
ACT
GGC
ATC
CCA
, 百拇医药
GAC
AGG
TTC
AGT
GGC
AGT
GGG
TCT
CDR2
165
177
189
201
, 百拇医药
G
T
D
F
T
L
T
I
S
R
L
E
P
E
, 百拇医药
D
F
A
GGG
ACA
GAC
TTC
ACT
CTC
ACC
ATC
AGC
AGA
, http://www.100md.com CTG
GAG
CCT
GAA
GAT
TTT
GCA
216
228
240
252
V
Y
Y
, 百拇医药
C
H
Q
Y
D
G
S
P
E
T
F
G
Q
G
, 百拇医药
GTG
TAT
TAC
TGT
CAC
CAG
TAT
GAT
GGC
TCC
CCG
GAG
ACG
, 百拇医药
TTC
GGC
CAA
GGG
267
CDR3
279
291
303
T
K
L
E
, 百拇医药 I
K
R
ACC
AAG
CTG
GAG
ATC
AAA
CGT
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图4 VL基因核苷酸序列及氨基酸序列推导
Fig4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of VL gene
, 百拇医药
作者简介：葛 乐，女，1965-10-12生，天津市人，汉族. 1989年第四军医大学毕业，1995年级博士研究生，导师苏成芝. 电话：(029)3375267
作者单位：葛 乐 韩 骅 苏成芝 药立波 王字玲 陈 萍 陈梅红 第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室 陕西 西安 710033
参考文献
1.Nitschke L,Kosco MH,Kohler G.Immunoglobulin D-deficient mice can mout normal immune responses to thymus-independent and dependent antigen.Proc Natl Acad Sci USA， 1993;90(5):1887-1891
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