心血管外科中基因转移技术的研究
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国外医学心血管疾病分册 2000年第27卷第1期
心血管外科中基因转移技术的研究
浙江大学医学院附属第一医院心胸外科(310003) 梁宏立(综述) 朱洪生* 陈诗忆**(审校)
摘 要 如何将目的基因导入心脏和血管是基因治疗和基因预防在心血管外科中应用的特殊问题，本文概述目前采用的几种方法。
关键词：心血管疾病 基因治疗 基因转移 方法
基因工程技术应用于心血管外科的研究是一个新兴领域。人们已经在应用血管内皮生长因子(VEGF)基因施行分子搭桥术，预防心脏移植术后心肌缺血再灌注损伤和免疫排斥反应，以及冠状动脉旁路术后移植血管再狭窄的防治等方面作了有益的偿试。然而，如何将携带外源基因的载体导入心肌组织、冠脉系统和移植血管等是动物体内研究，以及进一步的临床研究首先面临的特殊问题[1]。
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1 心脏及其血管的基因转移
从90年代初期开始，人们偿试将外源基因导入心脏及其血管。早先的研究有心肌直接注射法和冠状动脉腔内基因定位转移技术两种方法：(1)心肌内直接注射裸DNA或带有报告基因的腺病毒载体可以成功地将外源基因导入心脏及其血管，并表达出相应的蛋白质[2]。但是，这种方法使外源基因在心肌内分布均匀，并可导致注射部位的炎症反应。Kawaguchi等[3]在超声心动图引导下，将Sendai病毒脂质体包裹的内皮细胞源性一氧化氮合成酶(ecNOS)基因经皮注射至左心室壁，结果显示这种载体系统可以减轻局部炎症反应。(2)冠状动脉腔内基因定位转移是采用动脉插管技术及转移基因的各种球囊、血管支架等装置，将携带有目的基因的载体，选择性转移至拟治疗部位，在载体与病灶部位血管细胞紧密接触及压力作用下完成基因定位转移[4～6]。这种精确的基因定位转移具有能够与介入治疗同时进行的独特优势，是心血管疾病基因治疗研究中较多采用的方法。其缺点是加压造成内皮损伤以及血流冲洗使基因转染效率降低；对于需要在心脏进行广泛基因转移的疾病，该方法亦不宜采用。
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近年来，人们使用冠状动脉内灌注法进行心脏移植中供体心脏的基因转移。Sawa等[7～9]在供体心脏灌注心肌保护液的同时，将脂质体包裹的重组DNA(1～2mg/kg)导入冠脉系统，结果显示外源基因不但在心脏血管内皮细胞和平滑肌细胞中有表达，而且还通过血管进入心肌细胞。应用同样的方法，亦可将腺病毒载体介导的外源基因转移至心脏组织[10～13]。这种方法使心脏组织和外源基因有很大的接触面积，因而分布均匀，也没有局部炎症反应的副作用。另外，虽然现有的研究结果来自于心脏移植的手术模型，但是外源基因冠状动脉内灌注，在所有心内直视手术可以和心脏停搏液的灌注结合使用，为今后开展基因治疗的临床研究奠定了基础。
2 移植血管的基因转移
2.1 病毒溶液浸泡法
病毒是基因治疗和基因预防采用的重要载体之一。常用的有逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。将移植血管浸泡在病毒溶液中实现基因的转移是一种方便可行的方法。有作者将静脉移植物在含有报告基因LacZ的腺病毒溶液(浓度为5×1012个颗粒/毫升)中室温下浸泡90～120分钟，动脉旁路术后3天在移植静脉中检测到β-半乳糖苷酶的活性[14]。该方法的缺是等待时间长，影响手术的顺利进行。病毒进入体内的安全性也有待进一步评价。
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2.2 移植血管内加压注射
Mann等[15]在颈总动脉颈外静脉旁路手术模型中，于移植取植材时，施以100mmHg外加压力，将500μl脂质体包裹的反义增殖细胞核抗原(PCNA)和反义细胞分裂周期2激酶(cdc2)注入血管段，作用20分钟，术后证实选择性阻断了PCNA和edc2的表达。该方法的优点是直接正确，效果可靠。然而，和基因定位转移一样，不可避免地造成移植物内膜不同程度的损伤，旁路建立后动脉血流的冲洗作用外源基因的转移效率下降。
2.3 血管外膜基因转移
最新的研究显示，外膜在损伤血管的重要塑和新内膜形成中扮演重要角色，血管损伤后外膜出现肌成纤维细胞是慢性外膜收缩的原因，并可能向内移行参与新内膜的形成[16]。另有报道，血管外膜还与粥样病变的形成有关[17]。因此，外膜可以作为血管壁定位治疗的途径之一。而且外膜基因转移避免了目前使用的血管内加压灌注造成的内皮损伤和血流冲洗两大缺陷。
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2.3.1 血管鞘内基因转移 Kullo等[18]通过兔颈动脉鞘切口滴入携带有标记基因的腺病毒载体溶液，对外膜的基因转染效率为18%，虽然不能明确被转染细胞的确切类型，但包括外膜成纤维细胞。未发现外源基因被转移至中膜平滑肌细胞和内皮细胞。作者认为这是一种小剂量载体外膜基因转移的良好途径。由于解剖结构上送别，静脉血管难以进行鞘内基因转移。
2.3.2 生物材料介导的外膜基因转移 受组织工程技术的启示，人们偿试了由生物材料介导的血管外膜基因转移。F-127Fluronic凝胶是其中之一，这是一种聚合体，共新颖特性是4℃时溶解，而在37℃和组织接触时固化。Villa等[19]将荧光素异硫氰酸(FIFC)和溴脱氧核苷(BrdU)标记的寡核苷酸在4℃条件下掺入F-127 fluronic凝胶，术中包裹在移植血管周围。术后24小时可见外膜染色。由于生物材料被吸收的非特异性，血管周围组织亦有外源基因的表达。
2.4 基因缝线技术
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利用基因缝线，使手术缝合线内携带大量外源基因，进行局部血管缝合，可提高基因转移效率。除良万等[20]应用含有尿激酶原基因的逆转录病毒载体(pN2-pro-uk)，通过基因缝线，进行大鼠颈总动脉端端吻合，证明能有效制止吻合口内膜增生。
3 心血管的间接基因转移途径
上述方法都是将外源基因直接导入心脏和血管(in vivo)；基因治疗的另一策略间接基因转移途径(in vitro)在心血管疾病的研究中也得了到应用。所谓基因的间接转移途径是指在体外将外源基因转染培养的中介细胞，然后移植至体内器官。血管内皮细胞，血管平滑肌细胞和胚胎细胞等均可以作为心血管间接基因转移途径的中介细胞。Flugelman等[21]同样用外源基因修饰培养的内皮细胞，证实基因转移成功后，种植至金属支架，再将金属支架置于狭窄的冠状动脉内，结果显示这种种植在支架上的内皮细胞有很好的粘附力和生命力。
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间接基因转移途径在心肌细胞移植(俗称“心脏内搭桥术”)中十分有用。Soonpaa等[22]的研究首先建立转基因鼠动物模型，该模型携带有α-心肌细胞肌浆球蛋白重链(MHC)启动子和β-半乳糖苷酶报告基因的融合基因，于胚胎第15天从转基因鼠中分离得到心肌细胞，直接种植至同源宿主的心肌坏死区域，通过检测β-半乳糖苷酶活性，最迟于移植2个月，可见稳定的心肌内“桥”形成，并未见对宿主心肌细胞的不良作用和慢性免疫排斥反应。
间接基因转移途径需要在体外筛选成功转染了外源基因的中介细胞并大量培养；中介细胞折个体特异性强，通常只适合于自体移植，因而在实际应用中受到一定限制。
4 结 语
心血管外科中基因治疗和基因预防的研究还比较少，有关基因转移技术的专题研究更是不多。可以根据基因转移的不同目的，选择不同的方法，但在外源基因的剂量和转移时间上需要进一步探讨。发展新的心血管基因转移技术，要求方便操作，并在尽可能小的剂量和较短的转移时间内获得较高的基因转染效率。
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* 上海第二医科大学附属仁济医院心胸外科(200001)
**上海第二医科大学人类基因治疗研究中心(200025)
参考文献
1 Baek S et al.Circ Res,1998;8292):295～305
2 Guzman RJ et al.Circ Res,1993;73(6):1202～1207
3 Kawaguchi H et al.Circulation,1997;95(10):2441～2447
4 Nabel EG et al.Science,1990;249::1285～1288
, 百拇医药
5 Rome JJ et al.Hum Gene The,1994;5(9);1249
6 Tahlil O et al.Cardiovasc Res,1997;33(1):181～187
7 Sawa Y et al.Circulation,1995;92(supppl Ⅱ)：479～482
8 Yoshiki S et al.J Thorac Cardiovase Surg,1997;113(3):512～519
9 Dalesandro J et al.j Thorac Cardiovac Surg,1996;111(2):416～422
10 Lee J et al.J Thorac Cardiovase Surg,1996;111(1):246～252
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11 Brauner R et al.J Thorac Cardiovasc Surg,1997;113(6):1059～1067
12 Kypson et al.J thorac Cardiovasc Surg,1998;115(3):623～630
13 Gojo S et al.Ann Thorac Surg,1998;65:647～652
14 Chen SJ et al.Girculation,1994;89(5):1922～1928
15 Mann MJ et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92(10):4502～4506
16 Andersen HR et al.Circulation,1996;93(9)L1716～1724
, 百拇医药
17 Barker SGE et al.Atherosclerssis,1993;105(1):131～144
18 Kullo IJ et al.Circulation,1997;96(7)2254～2261
19 Villa AE et al.Circ Res,1995;76(4):505～513
20 陈良万等，中华医学杂志，1996;76(3):187～190
21 Flugelman MY et al.Circ Res,1992;70(2):348～354
22 Soonpaa MH et al.Sience,1994;246:98～101, http://www.100md.com
浙江大学医学院附属第一医院心胸外科(310003) 梁宏立(综述) 朱洪生* 陈诗忆**(审校)
摘 要 如何将目的基因导入心脏和血管是基因治疗和基因预防在心血管外科中应用的特殊问题，本文概述目前采用的几种方法。
关键词：心血管疾病 基因治疗 基因转移 方法
基因工程技术应用于心血管外科的研究是一个新兴领域。人们已经在应用血管内皮生长因子(VEGF)基因施行分子搭桥术，预防心脏移植术后心肌缺血再灌注损伤和免疫排斥反应，以及冠状动脉旁路术后移植血管再狭窄的防治等方面作了有益的偿试。然而，如何将携带外源基因的载体导入心肌组织、冠脉系统和移植血管等是动物体内研究，以及进一步的临床研究首先面临的特殊问题[1]。
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1 心脏及其血管的基因转移
从90年代初期开始，人们偿试将外源基因导入心脏及其血管。早先的研究有心肌直接注射法和冠状动脉腔内基因定位转移技术两种方法：(1)心肌内直接注射裸DNA或带有报告基因的腺病毒载体可以成功地将外源基因导入心脏及其血管，并表达出相应的蛋白质[2]。但是，这种方法使外源基因在心肌内分布均匀，并可导致注射部位的炎症反应。Kawaguchi等[3]在超声心动图引导下，将Sendai病毒脂质体包裹的内皮细胞源性一氧化氮合成酶(ecNOS)基因经皮注射至左心室壁，结果显示这种载体系统可以减轻局部炎症反应。(2)冠状动脉腔内基因定位转移是采用动脉插管技术及转移基因的各种球囊、血管支架等装置，将携带有目的基因的载体，选择性转移至拟治疗部位，在载体与病灶部位血管细胞紧密接触及压力作用下完成基因定位转移[4～6]。这种精确的基因定位转移具有能够与介入治疗同时进行的独特优势，是心血管疾病基因治疗研究中较多采用的方法。其缺点是加压造成内皮损伤以及血流冲洗使基因转染效率降低；对于需要在心脏进行广泛基因转移的疾病，该方法亦不宜采用。
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近年来，人们使用冠状动脉内灌注法进行心脏移植中供体心脏的基因转移。Sawa等[7～9]在供体心脏灌注心肌保护液的同时，将脂质体包裹的重组DNA(1～2mg/kg)导入冠脉系统，结果显示外源基因不但在心脏血管内皮细胞和平滑肌细胞中有表达，而且还通过血管进入心肌细胞。应用同样的方法，亦可将腺病毒载体介导的外源基因转移至心脏组织[10～13]。这种方法使心脏组织和外源基因有很大的接触面积，因而分布均匀，也没有局部炎症反应的副作用。另外，虽然现有的研究结果来自于心脏移植的手术模型，但是外源基因冠状动脉内灌注，在所有心内直视手术可以和心脏停搏液的灌注结合使用，为今后开展基因治疗的临床研究奠定了基础。
2 移植血管的基因转移
2.1 病毒溶液浸泡法
病毒是基因治疗和基因预防采用的重要载体之一。常用的有逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。将移植血管浸泡在病毒溶液中实现基因的转移是一种方便可行的方法。有作者将静脉移植物在含有报告基因LacZ的腺病毒溶液(浓度为5×1012个颗粒/毫升)中室温下浸泡90～120分钟，动脉旁路术后3天在移植静脉中检测到β-半乳糖苷酶的活性[14]。该方法的缺是等待时间长，影响手术的顺利进行。病毒进入体内的安全性也有待进一步评价。
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2.2 移植血管内加压注射
Mann等[15]在颈总动脉颈外静脉旁路手术模型中，于移植取植材时，施以100mmHg外加压力，将500μl脂质体包裹的反义增殖细胞核抗原(PCNA)和反义细胞分裂周期2激酶(cdc2)注入血管段，作用20分钟，术后证实选择性阻断了PCNA和edc2的表达。该方法的优点是直接正确，效果可靠。然而，和基因定位转移一样，不可避免地造成移植物内膜不同程度的损伤，旁路建立后动脉血流的冲洗作用外源基因的转移效率下降。
2.3 血管外膜基因转移
最新的研究显示，外膜在损伤血管的重要塑和新内膜形成中扮演重要角色，血管损伤后外膜出现肌成纤维细胞是慢性外膜收缩的原因，并可能向内移行参与新内膜的形成[16]。另有报道，血管外膜还与粥样病变的形成有关[17]。因此，外膜可以作为血管壁定位治疗的途径之一。而且外膜基因转移避免了目前使用的血管内加压灌注造成的内皮损伤和血流冲洗两大缺陷。
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2.3.1 血管鞘内基因转移 Kullo等[18]通过兔颈动脉鞘切口滴入携带有标记基因的腺病毒载体溶液，对外膜的基因转染效率为18%，虽然不能明确被转染细胞的确切类型，但包括外膜成纤维细胞。未发现外源基因被转移至中膜平滑肌细胞和内皮细胞。作者认为这是一种小剂量载体外膜基因转移的良好途径。由于解剖结构上送别，静脉血管难以进行鞘内基因转移。
2.3.2 生物材料介导的外膜基因转移 受组织工程技术的启示，人们偿试了由生物材料介导的血管外膜基因转移。F-127Fluronic凝胶是其中之一，这是一种聚合体，共新颖特性是4℃时溶解，而在37℃和组织接触时固化。Villa等[19]将荧光素异硫氰酸(FIFC)和溴脱氧核苷(BrdU)标记的寡核苷酸在4℃条件下掺入F-127 fluronic凝胶，术中包裹在移植血管周围。术后24小时可见外膜染色。由于生物材料被吸收的非特异性，血管周围组织亦有外源基因的表达。
2.4 基因缝线技术
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利用基因缝线，使手术缝合线内携带大量外源基因，进行局部血管缝合，可提高基因转移效率。除良万等[20]应用含有尿激酶原基因的逆转录病毒载体(pN2-pro-uk)，通过基因缝线，进行大鼠颈总动脉端端吻合，证明能有效制止吻合口内膜增生。
3 心血管的间接基因转移途径
上述方法都是将外源基因直接导入心脏和血管(in vivo)；基因治疗的另一策略间接基因转移途径(in vitro)在心血管疾病的研究中也得了到应用。所谓基因的间接转移途径是指在体外将外源基因转染培养的中介细胞，然后移植至体内器官。血管内皮细胞，血管平滑肌细胞和胚胎细胞等均可以作为心血管间接基因转移途径的中介细胞。Flugelman等[21]同样用外源基因修饰培养的内皮细胞，证实基因转移成功后，种植至金属支架，再将金属支架置于狭窄的冠状动脉内，结果显示这种种植在支架上的内皮细胞有很好的粘附力和生命力。
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间接基因转移途径在心肌细胞移植(俗称“心脏内搭桥术”)中十分有用。Soonpaa等[22]的研究首先建立转基因鼠动物模型，该模型携带有α-心肌细胞肌浆球蛋白重链(MHC)启动子和β-半乳糖苷酶报告基因的融合基因，于胚胎第15天从转基因鼠中分离得到心肌细胞，直接种植至同源宿主的心肌坏死区域，通过检测β-半乳糖苷酶活性，最迟于移植2个月，可见稳定的心肌内“桥”形成，并未见对宿主心肌细胞的不良作用和慢性免疫排斥反应。
间接基因转移途径需要在体外筛选成功转染了外源基因的中介细胞并大量培养；中介细胞折个体特异性强，通常只适合于自体移植，因而在实际应用中受到一定限制。
4 结 语
心血管外科中基因治疗和基因预防的研究还比较少，有关基因转移技术的专题研究更是不多。可以根据基因转移的不同目的，选择不同的方法，但在外源基因的剂量和转移时间上需要进一步探讨。发展新的心血管基因转移技术，要求方便操作，并在尽可能小的剂量和较短的转移时间内获得较高的基因转染效率。
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* 上海第二医科大学附属仁济医院心胸外科(200001)
**上海第二医科大学人类基因治疗研究中心(200025)
参考文献
1 Baek S et al.Circ Res,1998;8292):295～305
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5 Rome JJ et al.Hum Gene The,1994;5(9);1249
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9 Dalesandro J et al.j Thorac Cardiovac Surg,1996;111(2):416～422
10 Lee J et al.J Thorac Cardiovase Surg,1996;111(1):246～252
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11 Brauner R et al.J Thorac Cardiovasc Surg,1997;113(6):1059～1067
12 Kypson et al.J thorac Cardiovasc Surg,1998;115(3):623～630
13 Gojo S et al.Ann Thorac Surg,1998;65:647～652
14 Chen SJ et al.Girculation,1994;89(5):1922～1928
15 Mann MJ et al.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92(10):4502～4506
16 Andersen HR et al.Circulation,1996;93(9)L1716～1724
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17 Barker SGE et al.Atherosclerssis,1993;105(1):131～144
18 Kullo IJ et al.Circulation,1997;96(7)2254～2261
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20 陈良万等，中华医学杂志，1996;76(3):187～190
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22 Soonpaa MH et al.Sience,1994;246:98～101, http://www.100md.com