低分子肝素对aFGF促平滑肌细胞增殖作用的双相调节
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国外医学心血管疾病分册 2000年第27卷第1期
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低分子肝素对aFGF促平滑肌细胞增殖作用的双相调节
上海第二医科大学附属新华医院(200092) 陈书艳 张爱兵* 张建军** 荣烨之 徐惠芬 赵美华 吕宝经
摘 要 目的：探讨酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)与低分子肝素(LMWH)合用对主动脉平滑肌细胞(ASMC)增殖的影响。方法：在培养的兔ASMC中加入aFGF及LMWH后，观察其对ASMC3H-TdR(3H-胞腺嘧啶脱氧核苷)掺入率的影响。结果：在培养的兔ASMC中加入aFGF(10ng/ml)后，ASMC的CPM值明显增大，表明aFGF具有促进ASMC增殖的作用。当在aFGF为10ng/ml的培养液中，加入LWMH后，随着LMWH浓度的增加，ASMC的CPM值逐渐增大。当LMWH浓度增加到1.56ICU/ml时，ASMC的CPM增加6185.2±340.13，较单纯aFGF组3260.4±268.67增加88.90%，差异极显著(P<0.01))。以后随着LMWH剂量的增加，ASMC的CPM值逐渐减小。当LMWH浓度增加到25.0ICU/ml时，ASMC的CPM减小到1970.2±203.90，较单纯aFGF组下降了39.59%，差异极显著(P<0.01)。结论：低分子肝素对aFGF促平滑肌细胞增殖作用具有双相调节作用。
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关键词：酸性成纤维细胞生长因子 低分子肝素 主动脉平滑肌细胞 增殖作用
酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)现已成为人们尝试“自身血管搭桥”的主要促血管生成因子之一。它对血管的三种主要细胞(内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞)均有明显的促增殖作用。低分子肝素(low molecular eight heparin，LMWH)是由肝素经化学解聚和纯化所获得的氨基葡聚糖片段，其与aFGF联合应用时对血管平滑肌细胞增殖的影响尚未见报道。本研究在体外通过3H-TdR掺入率的测定，观察aFGF与LMWH联合应用对主动脉平滑肌细胞(ASMC)增殖的影响。
1 材料和方法
选用雄性纯种新西兰家兔，组织贴块法培养兔主动脉平滑肌细胞(ASMC)，传至3代后通过抗肌动蛋白染色对ASMC进行鉴定，阳性呈棕黄色，证明为平滑肌细胞。阳性率在98%以上。
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取3～6代的兔ASMC，用0.25%胰岛白酶消化后，用含10%小牛血清的DMEM培养液制成2.5×104/ml的细胞悬液，按每孔200μl接种于96孔培养板上，37℃，5%CO2饱和湿度下孵育48小时后，倾去培养液，加入无血清的DMEM培养液继续培养48小时后，倾去培养液，加入无血清的DMEM培养液继续培养48小时后分为对照组(无血清的DMEM培养液)、aFGF组(含10ng/ml aFGF的DMEM培养液)、aFGF+LMWH组(在含10ng/ml aFGF的DMEM培养液中加入倍比稀释的LMWH)按Zhan等[2]的方法进行3H-TdR掺入率的测定，测定结果用每分钟计数率cpm表示。aFGF自牛脑中纯化(自备)，LMWH：速避凝，由杭州赛诺菲民生制药有限公司提供。
2 结 果
3H-TdR掺入率测定结果显示：(1)当在无血清的培养液中加入10ng/ml的aFGF后(见图1)，ASMC的CPM值从1699.4±203.96增加到3260.4±268.67，增加的百分比为：91.90%，差异极显著(P<0.01)。(2)在aFGF为10ng/ml培养液中，加入LMWH后(见图2)，随着LMWH浓度的增加，ASMC的CPM值逐渐增大。当LMWH浓度增加到1.56ICU/ml时，ASMC的CPM值增加到6158.2±340.13，较单纯aFGF组3260.4±268.67增加88.90%，差异极显著(P<0.01)。以后随着LMWH浓度的增加，ASMC的CPM值逐渐减小。当LMWH浓度增加到25.01ICU/ml时，ASMC的CPM值减小到1970.2±203.90，较单纯aFGF组下降了39.59%，差异极显著(P<0.01)。
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图1 aFGF对ASMC3H-TdR掺入率的影响
图2 aFGF与LMWH合用对ASMC3H-TdR掺入率的影响
3 讨 论
本研究根据细胞增殖期内DNA合成需要大量胸腺嘧啶核苷的特点，在体外通过3H-TdR掺入率的测定观察了aFGF与LMWH联合应用对ASMC增殖的影响。结果显示aFGF对ASMC有明显的促增殖作用，该结果与国外报道相一致[3]。aFGF对细胞的作用是通过与细胞膜上的受体结合而发挥作用的。当aFGF与不同浓度的LMWH合用时对平滑肌细胞的增殖反应影响有所不同：低浓度的LMWH(1.56ICU/ml)具有协同aFGF促进血管平滑肌细胞增殖的作用，以后随着LMWH剂量的增加，对ASMC的促增殖作用逐渐减小。当LMWH浓度增加到一定程度时(25.0ICU/mL)，具有抗血管平滑肌细胞增殖的作用。推测LMWH与aFGF合用时对ASMC的这种双相调节作用可能是aFGF与LMWH综合作用的结果。当LMWH浓度较低时，LMWH与aFGF结合，协同aFGF促细胞增殖；随着LMWH浓度的增高，LMWH与aFGF结合达到饱和后，其协同作用达到高峰，以后随着LMWH浓度的增高，游离的LMWH逐渐增加，其本身对细胞的抑制作用强于其与aFGF协同促细胞增殖作用时，两者综合作用的结果即表现为对细胞增殖的抑制作用。
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该体外实验的结果提示：(1)低分子肝素与aFGF以一定比例合用时可防止平滑肌细胞的过度增殖。(2)可以根据不同的应用目的选择适当的aFGF与低分子肝素合用的比例。
* 海军医学研究所(200433)
** 上海市第一人民医院心内科(200080)
参考文献
1 Gambarini AG,Miranda MT,Viviani W et al.Structure and function of fibroblast growth factor,Braz J Med Biol Res,1996;29(7):835～839
2 Zhan X.Hu x ,Friesel R et al.Long term growth factor exposure and differential tyrosine phosphorylation are required for DNA synthesis in BALB/c 3T3 cells,J Biol Chem.1993;268(13):9611～9620
3 Winkles JA,Friesel R,Burgess WH et al.Human vascular smooth muscle cells both express and respond to heparin-binding gurwth factor I (endothelial cell growth facto),Proc Natl Acad Sci USA,1987;84(20):7124～7128, 百拇医药