SV40病毒对体外培养的人角朊细胞的转化
苏映军 陈璧 汤朝武 胡大海 姜笃银 贾赤宇
摘 要 目的：研究SV40(simian virus 40)病毒对人角朊细胞的体外转化作用以及转化后细胞生物学特性的改变. 方法：采用体外共培养法以SV40野生型病毒感染人包皮角朊细胞，观察病毒基因在细胞内的表达以及细胞表型的改变情况. 结果：分离获得了可长期体外培养的SV40转化细胞克隆，已传23代以上，体外存活超过250 d；DNA印迹实验显示SV40大T基因已整合至细胞染色体内，间接免疫荧光检测示多数细胞胞核内有大T基因产物的表达；转化细胞对裸鼠无致瘤性，并可正常表达角蛋白. 结论： SV40病毒转化人角朊细胞后可使其在体外长期培养，该细胞的获得为进一步研究外源性基因对角朊细胞生长的调控奠定了基础.
关键词:SV40病毒 角蛋白细胞 细胞转化
0 引言
生理条件下，正常人皮肤基底层角朊细胞不断增殖、分化，最终形成表皮角质层，完成细胞的生命周期. 然而，角朊细胞在体外的生长与分化受培养液成分的影响较大，体外培养较为困难. 1975年，Rheinwald等[1]改善了培养条件并采用了3T3滋养细胞使角朊细胞能够在体外传代培养至4代～6代. 随着对细胞分化研究的深入，Yuspa等[2]采用低Ca2+培养基降低了角朊细胞体外培养时的分化程度，可使其传代培养至第8代～10代. 即便如此，仍无法获得永生化人角朊细胞系，因而无法满足相关疾病研究的需要. 为克服以上不足，我们利用SV40(simian virus 40)病毒可转化某些细胞使其具有永生化生长的特性，采用病毒基因转化细胞技术，进行体外细胞转化，以获得能够长期培养的人角朊细胞.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 野生型SV40病毒，由北京医科大学肿瘤病研究所提供. 皮肤组织来源于包皮环切术所获标本. 细胞无血清培养基K-SFM为Gibco公司产品. 实验用裸鼠购自本校实验动物研究中心.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 参照汤朝武等[3]报道的方法将角朊细胞分离成单细胞悬液，离心后以K-SFM重悬细胞，按1×104/cm2细胞密度将角朊细胞接种于培养皿内. 24 h后换液，以后隔日换液并于倒置显微镜下观察细胞生长状况. 细胞生长至70%融合度时行消化传代培养.
1.2.2 病毒感染及细胞克隆的分离 将培养至30%融合程度的原代角朊细胞以1.25 g/L胰酶溶液室温消化2 min，当镜下见细胞呈圆形但尚未脱离培养皿壁时，加入含SV40病毒的培养基培养8 h，之后将培养基更换为K-SFM，培养48 h后按同样步骤再次以病毒液作用于培养细胞并定期观察. 待有明显转化细胞克隆形成后，分离生长良好的克隆，行传代培养，定期收集细胞进行下文所述指标的检测.
, 百拇医药
1.2.3 大T基因的检测及T抗原间接免疫荧光检测 参照Blin等[4]方法提取细胞基因组DNA，将DNA样品转移至硝酸纤维素膜上，以地高辛标记的1.17 kb大T基因DNA探针按照鄂征报道的方法进行斑点印迹实验[5]. 同时将生长在盖玻片上的细胞以丙酮固定后，加入1∶40稀释度小鼠抗大T抗原单抗sc-147(Santa Cruz)，室温下孵育30 min，PBS洗3次，再加入1∶50稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(Santa Cruz)，室温作用30 min，PBS洗3次，甘油封片，荧光显微镜下观察.
1.2.4 细胞角蛋白间接免疫荧光检测 方法同上，其中培养的细胞为第20代病毒转化细胞，一抗采用鼠抗人角蛋白多抗(Dako)，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG(Santa Cruz).
1.2.5 裸鼠致瘤实验 收集第7代, 18代转化细胞，离心洗涤，以PBS重悬并调整细胞密度至1×1010/L，于4周龄裸鼠背部皮下注射0.1 mL细胞悬液，定期观察. 皮肤鳞癌细胞株VX-2及第3代正常角朊细胞分别为阳性和阴性细胞对照.
, 百拇医药
1.2.6 细胞生长曲线 将第7代, 18代SV40转化细胞及第3代正常人角朊细胞以K-SFM重悬后，调整细胞密度为1×107/L，接种至24孔组织培养板，1 mL/孔，以后隔日以噻唑蓝(MTT)呈色法[6]测定细胞的生长状况，方法为测定孔内加入5 g/L的MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，弃培养基，PBS洗2次，加入二甲基亚砜(DMSO)1 mL，37 ℃放置15 min，振荡5 min，将DMSO转移至1 mL比色杯中测定570 nm波长下的A值. 以时间参数为横坐标，A值为纵坐标作点线图，分析细胞生长情况.
实验数据采用我校统计学教研室SPLM统计软件包进行方差分析，P<0.05为显著性差异界限.
2 结果
2.1 培养细胞镜下观察 正常的角朊细胞在体外以K-SFM培养时呈椭圆形细胞形态，细胞融合时多为“鹅卵石”状排列(Fig 1). 随着培养代数的增加，细胞逐渐变大，传代培养7代～10代后细胞老化，失去生长能力并从培养皿壁脱落. 加入SV40病毒共培养后,转化细胞逐渐形成克隆样细胞灶，与较大的未转化细胞共存于培养皿内. 经不断传代后，较大的老化细胞在换液时被去除，培养皿内存留者为多个圆形转化细胞灶，细胞体积较小且较为均一，倒置显微镜下见细胞呈典型的多角形和椭圆形，个别细胞有明显的伪足伸出(Fig 2). 分离并单独培养的细胞克隆在23代仍具有增殖能力，而且，细胞未丧失接触抑制的特性，在完全融合状态下未发生继续增殖复层的现象(Fig 3).
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2.2 斑点杂交实验 第7代, 22代SV40转化细胞基因组DNA样本中大T基因探针杂交结果阳性，正常人角朊细胞DNA印迹实验结果阴性(Fig 4). 间接免疫荧光染色显示转化的人角朊细胞核中有大T抗原的表达(Fig 5). 说明SV40大T基因已整合至转化的角朊细胞染色体内并表达其编码产物.
2.3 细胞角蛋白的表达 第20代转化细胞显示较强的角蛋白反应(Fig 6)，表明分离获得的转化细胞克隆来源于表皮角朊细胞而非混杂的其它皮肤组织细胞.
2.4 致瘤性 鳞癌细胞VX-2注射裸鼠3 wk后可见明显肿瘤形成，而第7代, 18代SV40转化细胞及第3代正常人角朊细胞接种裸鼠皮下3 mo未见肿瘤形成.
2.5 生长曲线分析 正常人角朊细胞在接种后第4日～8日进入增殖活跃的对数生长期，第10日左右细胞处于完全融合状态而停止生长. 转化后的细胞于接种后第4日起进入对数生长期，第7代的转化细胞培养至第8日～10日时进入融合状态而增殖减缓，第18代转化细胞培养至第10日时未达到融合状态，并继续增殖(Fig 7)，至14 d～16 d时进入完全融合状态而停止生长. 在对数生长期内，正常角朊细胞的倍增时间约为32 h，第7代转化细胞约为37 h，第18代转化细胞约为66 h. 经统计学分析，第7代转化细胞各时间点检测的A值与正常角朊细胞间无明显差异，而第18代转化细胞培养6 d之后所测A值与正常细胞相比差异显著. 说明转化后的细胞传代培养至第7代时，其增殖率与正常角朊细胞间无差别；随着培养时间的延长和培养代数的增加，其增殖率有所降低.
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3 讨论
通过基因转化技术可使正常组织细胞能够被长期培养甚至发生“永生化”改变，应用该技术已建立多种体外稳定生长的细胞系，其中采用SV40病毒基因体外转化细胞是较为常用且有效的方法之一[7～9]. 本实验采用SV40病毒感染细胞的方法，分离获得了可在体外长期培养、无致瘤性的人皮肤角朊细胞，为研究角朊细胞在烧伤创面修复中的作用提供了便利条件.
图 1 正常人包皮角朊细胞形态
Fig 1 Normal human foreskin kertinocytes ×200
图 2 第15代转化角朊细胞克隆
Fig 2 Transformed keratinocyte clone of passage 15 ×200
, 百拇医药
图 3 第23代转化细胞完全融合状态
Fig 3 Complete confluence of transformed keratinocytes of passage 23 ×200
图 4 DNA印迹实验结果
Fig 4 Results of southern blotting
A: Positive control. B: Negative control. C, D: Chromosomal DNA samples from transformed cells of passage 7 and 22.
图 5 转化的人角朊细胞核内大T抗原的表达
Fig 5 Expression of Large T antigen in transformed human keratinocyte nuclei
, 百拇医药
图 6 转化细胞角蛋白的表达
Fig 6 Keratin expression of transformed cells
图 7 正常及转化角朊细胞生长曲线
Fig 7 Cell growth curves of both normal and transformed keratinocytes
SV40病毒为无包膜DNA病毒，病毒基因由5243 bp的共价闭环双链DNA分子构成，按功能可将基因组分为早期区和晚期区，两者分别位于DNA分子的两条链上，并以相反的方向进行转录. 早期区通过不同的剪接方式分别转录编码大T和小t抗原的两种mRNA[10]. 晚期区主要编码病毒的外壳蛋白. SV40病毒感染细胞后，其早期基因编码的大T抗原大量聚集在细胞核内，与宿主细胞DNA复制起始序列相互作用，刺激静止细胞进入S期，导致细胞的增殖并降低了细胞的分化程度[11, 12]；有研究发现，SV40转化的人细胞系中，病毒T基因/产物与Rb, p53[13,14]基因等相互作用，共同调节细胞的体外生长；进一步的研究发现，将内含编码SV40大T抗原基因的质粒转染人甲状腺上皮细胞，可使该细胞在体外长期培养，揭示SV40病毒导致宿主细胞长期存活并永生化机理与大T基因密切相关. 本研究观察到转化的细胞在第23代时仍生长良好，经DNA印迹实验证实大T基因已整合至细胞染色体内，同时间接免疫荧光法显示该基因编码产物可于胞核内表达，提示经转化所获得的人角朊细胞能够在体外长期存活与大T基因的作用有关.
, 百拇医药
SV40可使某些真核细胞发生“永生化”改变，但因其在宿主细胞染色体上整合位点随机性较大[15, 16]，故该病毒又具有导致细胞表型多样性变化的特性. 本实验所获得的转化细胞具有与正常细胞相似的镜下形态，能够长期体外存活且无致瘤性，这些表型特征能否被转化细胞永久维持，尚需进一步观察.
基金项目:国家自然科学基金资助项目 No.39570718
作者简介:苏映军，男，1965-02-01生，广西南宁人，汉族. 1989年第四军医大学毕业,1996年博士生,发表论文12篇. 导师:陈 璧教授. Tel:(029)3375570 Fax：(029)3251734 E-mail burns@fmmu.edu.cn
作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科, 陕西 西安 710033
参考文献
, 百拇医药
1 Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975;6(3):331-344
2 Yuspa SH, Koehler B, Kulesz-Martin M et al. Clonal growth of mouse epidermal cells in medium with reduced calcium concentration. J Invest Dermatol, 1981;76(2):144-146
3 汤朝武, 陈 璧. 人表皮细胞悬液点状接种原代培养法. 中华实验外科杂志, 1990;7(3):136-137
, 百拇医药 4 Blin N, Stafford DW. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes. Nucleic Acids Res, 1976;3(9):2303-2308
5 鄂 征主编. 组织培养和分子细胞学技术. 第2版. 北京: 北京出版社, 1997:416-419
6 Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methds, 1989;119(2):203-210
7 Miyazaki M, Mihara K, Bai L et al. Immortalization of epithelial-like cells from human liver tissue with SV40 T-antigen gene. Exp Cell Res, 1993;206(1):27-35
, http://www.100md.com
8 吴根生, 陈秋燕, 孙宗棠 et al. SV40 T抗原介导的人胚肝细胞的体外永生化及其机制探讨. 中华肿瘤杂志, 1993;15(6):415-418
9 柯 杨, 宁 涛, 王 冰 et al. 人胃粘膜上皮细胞系GES-1的建立及其生物学特性. 中华肿瘤杂志, 1994;16(1):7-10
10 Barbanti Brodano G, Martini F, DeMattei M et al. BK and JC human polyomaviruses and simian virus 40: natural history of infection in humans, experimental oncogenicity, and association with human tumors. Adv Virus Res, 1998; 50: 69-99
11 Fanning E, Knippers R. Structure and function of simian virus 40 large tumor antigen. Annu Rev Biochem, 1992;61:55-85
, http://www.100md.com
12 Fanning E. Simian virus 40 large T antigen: the puzzle, the pieces, and the emerging picture. J Virol, 1992;66(3):1289-1293
13 Stubdal H, Zalvide J, DeCaprio JA. Simian virus 40 large T antigen alters the phosphorylation state of the RB-related proteins p130 and p107. J Virol, 1996; 70(5): 2781-2788
14 Chen Y, Chen PL, Lee WH. Hot-spot p53 mutants interact specifically with two cellular proteins during progression of the cell cycle. Mol Cell Biol, 1994;14(10): 6764-6772
15 Hickey RJ, Malkas LH. Mammalian cell DNA replication. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 1997;7(1, 2):125-157
16 Bullock PA. The initiation of simian virus 40 DNA replication in vitro. Crit Rev Biochem Mol Biol, 1997;32(6):503-568, 百拇医药
摘 要 目的：研究SV40(simian virus 40)病毒对人角朊细胞的体外转化作用以及转化后细胞生物学特性的改变. 方法：采用体外共培养法以SV40野生型病毒感染人包皮角朊细胞，观察病毒基因在细胞内的表达以及细胞表型的改变情况. 结果：分离获得了可长期体外培养的SV40转化细胞克隆，已传23代以上，体外存活超过250 d；DNA印迹实验显示SV40大T基因已整合至细胞染色体内，间接免疫荧光检测示多数细胞胞核内有大T基因产物的表达；转化细胞对裸鼠无致瘤性，并可正常表达角蛋白. 结论： SV40病毒转化人角朊细胞后可使其在体外长期培养，该细胞的获得为进一步研究外源性基因对角朊细胞生长的调控奠定了基础.
关键词:SV40病毒 角蛋白细胞 细胞转化
0 引言
生理条件下，正常人皮肤基底层角朊细胞不断增殖、分化，最终形成表皮角质层，完成细胞的生命周期. 然而，角朊细胞在体外的生长与分化受培养液成分的影响较大，体外培养较为困难. 1975年，Rheinwald等[1]改善了培养条件并采用了3T3滋养细胞使角朊细胞能够在体外传代培养至4代～6代. 随着对细胞分化研究的深入，Yuspa等[2]采用低Ca2+培养基降低了角朊细胞体外培养时的分化程度，可使其传代培养至第8代～10代. 即便如此，仍无法获得永生化人角朊细胞系，因而无法满足相关疾病研究的需要. 为克服以上不足，我们利用SV40(simian virus 40)病毒可转化某些细胞使其具有永生化生长的特性，采用病毒基因转化细胞技术，进行体外细胞转化，以获得能够长期培养的人角朊细胞.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 野生型SV40病毒，由北京医科大学肿瘤病研究所提供. 皮肤组织来源于包皮环切术所获标本. 细胞无血清培养基K-SFM为Gibco公司产品. 实验用裸鼠购自本校实验动物研究中心.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 参照汤朝武等[3]报道的方法将角朊细胞分离成单细胞悬液，离心后以K-SFM重悬细胞，按1×104/cm2细胞密度将角朊细胞接种于培养皿内. 24 h后换液，以后隔日换液并于倒置显微镜下观察细胞生长状况. 细胞生长至70%融合度时行消化传代培养.
1.2.2 病毒感染及细胞克隆的分离 将培养至30%融合程度的原代角朊细胞以1.25 g/L胰酶溶液室温消化2 min，当镜下见细胞呈圆形但尚未脱离培养皿壁时，加入含SV40病毒的培养基培养8 h，之后将培养基更换为K-SFM，培养48 h后按同样步骤再次以病毒液作用于培养细胞并定期观察. 待有明显转化细胞克隆形成后，分离生长良好的克隆，行传代培养，定期收集细胞进行下文所述指标的检测.
, 百拇医药
1.2.3 大T基因的检测及T抗原间接免疫荧光检测 参照Blin等[4]方法提取细胞基因组DNA，将DNA样品转移至硝酸纤维素膜上，以地高辛标记的1.17 kb大T基因DNA探针按照鄂征报道的方法进行斑点印迹实验[5]. 同时将生长在盖玻片上的细胞以丙酮固定后，加入1∶40稀释度小鼠抗大T抗原单抗sc-147(Santa Cruz)，室温下孵育30 min，PBS洗3次，再加入1∶50稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(Santa Cruz)，室温作用30 min，PBS洗3次，甘油封片，荧光显微镜下观察.
1.2.4 细胞角蛋白间接免疫荧光检测 方法同上，其中培养的细胞为第20代病毒转化细胞，一抗采用鼠抗人角蛋白多抗(Dako)，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG(Santa Cruz).
1.2.5 裸鼠致瘤实验 收集第7代, 18代转化细胞，离心洗涤，以PBS重悬并调整细胞密度至1×1010/L，于4周龄裸鼠背部皮下注射0.1 mL细胞悬液，定期观察. 皮肤鳞癌细胞株VX-2及第3代正常角朊细胞分别为阳性和阴性细胞对照.
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1.2.6 细胞生长曲线 将第7代, 18代SV40转化细胞及第3代正常人角朊细胞以K-SFM重悬后，调整细胞密度为1×107/L，接种至24孔组织培养板，1 mL/孔，以后隔日以噻唑蓝(MTT)呈色法[6]测定细胞的生长状况，方法为测定孔内加入5 g/L的MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，弃培养基，PBS洗2次，加入二甲基亚砜(DMSO)1 mL，37 ℃放置15 min，振荡5 min，将DMSO转移至1 mL比色杯中测定570 nm波长下的A值. 以时间参数为横坐标，A值为纵坐标作点线图，分析细胞生长情况.
实验数据采用我校统计学教研室SPLM统计软件包进行方差分析，P<0.05为显著性差异界限.
2 结果
2.1 培养细胞镜下观察 正常的角朊细胞在体外以K-SFM培养时呈椭圆形细胞形态，细胞融合时多为“鹅卵石”状排列(Fig 1). 随着培养代数的增加，细胞逐渐变大，传代培养7代～10代后细胞老化，失去生长能力并从培养皿壁脱落. 加入SV40病毒共培养后,转化细胞逐渐形成克隆样细胞灶，与较大的未转化细胞共存于培养皿内. 经不断传代后，较大的老化细胞在换液时被去除，培养皿内存留者为多个圆形转化细胞灶，细胞体积较小且较为均一，倒置显微镜下见细胞呈典型的多角形和椭圆形，个别细胞有明显的伪足伸出(Fig 2). 分离并单独培养的细胞克隆在23代仍具有增殖能力，而且，细胞未丧失接触抑制的特性，在完全融合状态下未发生继续增殖复层的现象(Fig 3).
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2.2 斑点杂交实验 第7代, 22代SV40转化细胞基因组DNA样本中大T基因探针杂交结果阳性，正常人角朊细胞DNA印迹实验结果阴性(Fig 4). 间接免疫荧光染色显示转化的人角朊细胞核中有大T抗原的表达(Fig 5). 说明SV40大T基因已整合至转化的角朊细胞染色体内并表达其编码产物.
2.3 细胞角蛋白的表达 第20代转化细胞显示较强的角蛋白反应(Fig 6)，表明分离获得的转化细胞克隆来源于表皮角朊细胞而非混杂的其它皮肤组织细胞.
2.4 致瘤性 鳞癌细胞VX-2注射裸鼠3 wk后可见明显肿瘤形成，而第7代, 18代SV40转化细胞及第3代正常人角朊细胞接种裸鼠皮下3 mo未见肿瘤形成.
2.5 生长曲线分析 正常人角朊细胞在接种后第4日～8日进入增殖活跃的对数生长期，第10日左右细胞处于完全融合状态而停止生长. 转化后的细胞于接种后第4日起进入对数生长期，第7代的转化细胞培养至第8日～10日时进入融合状态而增殖减缓，第18代转化细胞培养至第10日时未达到融合状态，并继续增殖(Fig 7)，至14 d～16 d时进入完全融合状态而停止生长. 在对数生长期内，正常角朊细胞的倍增时间约为32 h，第7代转化细胞约为37 h，第18代转化细胞约为66 h. 经统计学分析，第7代转化细胞各时间点检测的A值与正常角朊细胞间无明显差异，而第18代转化细胞培养6 d之后所测A值与正常细胞相比差异显著. 说明转化后的细胞传代培养至第7代时，其增殖率与正常角朊细胞间无差别；随着培养时间的延长和培养代数的增加，其增殖率有所降低.
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3 讨论
通过基因转化技术可使正常组织细胞能够被长期培养甚至发生“永生化”改变，应用该技术已建立多种体外稳定生长的细胞系，其中采用SV40病毒基因体外转化细胞是较为常用且有效的方法之一[7～9]. 本实验采用SV40病毒感染细胞的方法，分离获得了可在体外长期培养、无致瘤性的人皮肤角朊细胞，为研究角朊细胞在烧伤创面修复中的作用提供了便利条件.
图 1 正常人包皮角朊细胞形态
Fig 1 Normal human foreskin kertinocytes ×200
图 2 第15代转化角朊细胞克隆
Fig 2 Transformed keratinocyte clone of passage 15 ×200
, 百拇医药
图 3 第23代转化细胞完全融合状态
Fig 3 Complete confluence of transformed keratinocytes of passage 23 ×200
图 4 DNA印迹实验结果
Fig 4 Results of southern blotting
A: Positive control. B: Negative control. C, D: Chromosomal DNA samples from transformed cells of passage 7 and 22.
图 5 转化的人角朊细胞核内大T抗原的表达
Fig 5 Expression of Large T antigen in transformed human keratinocyte nuclei
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图 6 转化细胞角蛋白的表达
Fig 6 Keratin expression of transformed cells
图 7 正常及转化角朊细胞生长曲线
Fig 7 Cell growth curves of both normal and transformed keratinocytes
SV40病毒为无包膜DNA病毒，病毒基因由5243 bp的共价闭环双链DNA分子构成，按功能可将基因组分为早期区和晚期区，两者分别位于DNA分子的两条链上，并以相反的方向进行转录. 早期区通过不同的剪接方式分别转录编码大T和小t抗原的两种mRNA[10]. 晚期区主要编码病毒的外壳蛋白. SV40病毒感染细胞后，其早期基因编码的大T抗原大量聚集在细胞核内，与宿主细胞DNA复制起始序列相互作用，刺激静止细胞进入S期，导致细胞的增殖并降低了细胞的分化程度[11, 12]；有研究发现，SV40转化的人细胞系中，病毒T基因/产物与Rb, p53[13,14]基因等相互作用，共同调节细胞的体外生长；进一步的研究发现，将内含编码SV40大T抗原基因的质粒转染人甲状腺上皮细胞，可使该细胞在体外长期培养，揭示SV40病毒导致宿主细胞长期存活并永生化机理与大T基因密切相关. 本研究观察到转化的细胞在第23代时仍生长良好，经DNA印迹实验证实大T基因已整合至细胞染色体内，同时间接免疫荧光法显示该基因编码产物可于胞核内表达，提示经转化所获得的人角朊细胞能够在体外长期存活与大T基因的作用有关.
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SV40可使某些真核细胞发生“永生化”改变，但因其在宿主细胞染色体上整合位点随机性较大[15, 16]，故该病毒又具有导致细胞表型多样性变化的特性. 本实验所获得的转化细胞具有与正常细胞相似的镜下形态，能够长期体外存活且无致瘤性，这些表型特征能否被转化细胞永久维持，尚需进一步观察.
基金项目:国家自然科学基金资助项目 No.39570718
作者简介:苏映军，男，1965-02-01生，广西南宁人，汉族. 1989年第四军医大学毕业,1996年博士生,发表论文12篇. 导师:陈 璧教授. Tel:(029)3375570 Fax：(029)3251734 E-mail burns@fmmu.edu.cn
作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科, 陕西 西安 710033
参考文献
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1 Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975;6(3):331-344
2 Yuspa SH, Koehler B, Kulesz-Martin M et al. Clonal growth of mouse epidermal cells in medium with reduced calcium concentration. J Invest Dermatol, 1981;76(2):144-146
3 汤朝武, 陈 璧. 人表皮细胞悬液点状接种原代培养法. 中华实验外科杂志, 1990;7(3):136-137
, 百拇医药 4 Blin N, Stafford DW. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes. Nucleic Acids Res, 1976;3(9):2303-2308
5 鄂 征主编. 组织培养和分子细胞学技术. 第2版. 北京: 北京出版社, 1997:416-419
6 Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methds, 1989;119(2):203-210
7 Miyazaki M, Mihara K, Bai L et al. Immortalization of epithelial-like cells from human liver tissue with SV40 T-antigen gene. Exp Cell Res, 1993;206(1):27-35
, http://www.100md.com
8 吴根生, 陈秋燕, 孙宗棠 et al. SV40 T抗原介导的人胚肝细胞的体外永生化及其机制探讨. 中华肿瘤杂志, 1993;15(6):415-418
9 柯 杨, 宁 涛, 王 冰 et al. 人胃粘膜上皮细胞系GES-1的建立及其生物学特性. 中华肿瘤杂志, 1994;16(1):7-10
10 Barbanti Brodano G, Martini F, DeMattei M et al. BK and JC human polyomaviruses and simian virus 40: natural history of infection in humans, experimental oncogenicity, and association with human tumors. Adv Virus Res, 1998; 50: 69-99
11 Fanning E, Knippers R. Structure and function of simian virus 40 large tumor antigen. Annu Rev Biochem, 1992;61:55-85
, http://www.100md.com
12 Fanning E. Simian virus 40 large T antigen: the puzzle, the pieces, and the emerging picture. J Virol, 1992;66(3):1289-1293
13 Stubdal H, Zalvide J, DeCaprio JA. Simian virus 40 large T antigen alters the phosphorylation state of the RB-related proteins p130 and p107. J Virol, 1996; 70(5): 2781-2788
14 Chen Y, Chen PL, Lee WH. Hot-spot p53 mutants interact specifically with two cellular proteins during progression of the cell cycle. Mol Cell Biol, 1994;14(10): 6764-6772
15 Hickey RJ, Malkas LH. Mammalian cell DNA replication. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 1997;7(1, 2):125-157
16 Bullock PA. The initiation of simian virus 40 DNA replication in vitro. Crit Rev Biochem Mol Biol, 1997;32(6):503-568, 百拇医药