SOD模拟物PTC对O2．-介导的氧化损伤的保护作用
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王多宁 莫简 孙淑芬 骆文博 郭正仁 巨宏博 范家骏 张建保
摘 要 目的：通过对超氧化物岐化酶(SOD)模拟物原儿茶醛缩氨基硫脲铜(Ⅱ)配合物(protocatechualdehyde-thiosemicarbazone-copper(Ⅱ)complexs, PTC)清除O2.-自由基及其生物学作用的实验观察，从自由基清除剂的角度寻求开发高效低毒的中药有效成份金属配合物新药. 方法：①以黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-Luminol化学发光体系测定PTC的SOD样活性. ②实验观察PTC对激活的人白细胞吞噬发光、血液流变性、脂质过氧化产物的影响和对烧伤后继发氧化损伤的保护作用. 结果：①PTC具有很高的SOD样活性. 其[ID]50为150 μg/L，是SOD([ID]50为300 μg/L)的2倍. ②PTC能显著地抑制酵母多糖激活的人白细胞的吞噬发光. ③PTC能降低由于白细胞的激活而引起的人血液粘度和脂质过氧化产物(MDA)的升高. ④PTC能使小鼠烧伤模型的炎症反应减轻， 并能使烧伤小鼠血清中增高的MDA和一氧化氮代谢产物(NO2.-)显著降低. 结论：PTC是一种很强的O2.-清除剂，对O2.-介导的氧化损伤有保护作用.
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关键词:SOD模拟物 自由基清除剂 原儿茶醛缩氨基硫脲铜(Ⅱ)配合物 化学发光 血液流变性 烧伤
0 引言
已有许多研究[1,2]表明，生物体内诸多生理病理过程都涉及自由基的作用，尤其是氧、氮衍生自由基. 体内自由基的代谢异常，可造成组织和器官的损伤,并导致许多疾病的发生. 所以,自由基清除剂的研究，已成为近年来人们关注的热点之一. 超氧阴离子自由基(O2.-)特异性清除剂超氧化物歧化酶(SOD)的研究，在国内外已做了大量的工作，目前已作为药品使用于临床，但由于SOD在体内半衰期短，又不易进入细胞内，且价格昂贵，给临床应用带来困难. 人们企图用化学合成等方法来寻找一些高效、低毒、价廉的自由基清除剂来弥补其不足. 为此，我们以中药有效成份原儿茶醛、氨基硫脲和CuSO4为原料合成了SOD模拟物—原儿茶醛缩氨基硫脲铜(Ⅱ)配合物( protocatechualdehyde-thiosemicarbazone-copper
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(Ⅱ)complexs, PTC)[3]，并进行了下列实验研究.
1 材料和方法
1.1 药物及试剂 PTC(本室合成)，SOD(甘肃夏河生化制剂厂产品)，酵母多糖、黄嘌呤氧化酶(Sigma产品)，黄嘌呤(德国E。Meack产品)，鲁米诺(Luminol，BR，上海试剂一厂产品).
1.2 仪器 DG3030化学发光光度计(华东电子管厂产品)，SHG-1生物化学发光测量仪(上海技术监督局实验工厂产品)，721分光光度计(上海第三分析仪器厂产品)，RF-5000型荧光分光光度计(日本岛津产品)、NXE-3型锥板粘度计(四川成都医疗仪器厂产品).
1.3 动物 BALB/c小鼠(本校实验动物中心提供)，雄性，体质量20 g～22g.
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1.4 PTC的SOD样活性测定 在化学发光管中加入黄嘌呤氧化酶(XO)10 μL(使用前将原液用0.05 mol/L PB 稀释20倍)和SOD标准液或样品液0～90 μL， 用PB补充使每测定管体积为100 μL， 混合测空白后， 立即加入1×10-4 mol/L 的黄嘌呤-luminol(X-L)混合液400 μL，进行发光测定，测定时间60 s，温度25℃. 以下式：
计算百分抑制率，用直线回归法分别求出其抑制发光强度50%的剂量[ID]50.
1.5 PTC对人白细胞吞噬发光的影响
1.5.1 酵母多糖的调理按董元林等[4]法制成10 g/L备用.
1.5.2 白细胞的分离 抽取健康人肘静脉血(肝素抗凝)，以全血(v)∶生理盐水(v)=2∶1稀释，将全血稀释液6.00 mL慢慢悬浮于分离液之上，600 g离心30 min，吸取中层白细胞，并取样用胎盼蓝染色法测定活性(活细胞大于99%)后备用.
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1.5.3 浓缩血液的制备 在一试管中加肝素抗凝血6.00 mL，2 000 r。min-1离心3 min，吸去血浆2.00 mL后慢慢摇匀备用.
1.5.4 白细胞的激活及分组 B组(单纯激活组)取上述白细胞悬液5.00 mL，加调理的酵母多糖(OZ ) 0.70 mL，生理盐水0.40 mL，37℃保温10 min后各取0.05 mL立即加入发光管中作发光测定，A组(对照组)不加OZ，只加1.10 mL生理盐水，C组加SOD 0.40 mL(1 320 IU),OZ 0.70 mL；D组加PTC 0.40 mL(0.08 mg)，OZ 0.70 mL，其它操作同B组.
1.5.5 吞噬发光测定 在发光管中加入Hanks液(pH=7.4)0.50 mL，浓缩血液0.05 mL, 鲁米诺(1×10-5 mol/L)0.20 mL，37℃保温20 min，测本底后，立即分别加入A,B,C,D组细胞悬液0.05 mL， 进行发光测定， 每次6 s， 共10次， 以每分钟化学发光脉冲数(cpm)/1×103白细胞的峰值(peak value)计算吞噬发光强度.
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1.6 PTC对血液流变性和脂质过氧化产物的影响
1.6.1 血液流变学检测 取上述(1.5.4)A,B,C,D组白细胞悬液各3.00 mL，加浓缩血液(1.5.3所述)4.00 mL慢慢悬浮血球，再保温30 min，取6.00 mL做粘度测定，其余1.00 mL离心取血浆作脂质过氧化产物测定.
1.6.2 脂质过氧化产物测定 以四乙氧基丙烷为标准，用硫代巴比妥酸比色法[5]测定血浆脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量.
1.7 PTC对烧伤后继发自由损伤的保护作用 烧伤动物模型采用高压蒸汽(0.12 kPa,6 s)造成小鼠10% 体表面积Ⅱ°烫伤. 随机分为A′,B′,C′,D′组(n=10)，并立即给A组敷以SOD(6×105IU/L)药膜，B组敷以PTC(100 mg/L)药膜，C组敷以未加药物的空白膜，每日换药3次，第3日取创面组织在光镜下观察组织形态学变化，同时在8 h,20 h取血清测定MDA和亚硝酸盐(NO2-)含量. MDA测定采用TBA荧光法，NO2-测定用Thomas改进法[6].
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2 结果
①PTC有很强的清除O2.-自由基的作用，其[ID]50为150μg/L,是SOD([ID]50为300 μg/L)的2倍，显示出很高的SOD样活性.
②人白细胞被酵母多糖激活后，能使鲁米诺依赖性化学发光显著增强，而PTC，SOD能使这种增强的化学发光受到抑制(Tab 1).
表 1 PTC对激活白细胞化学发光的抑制作用
Tab 1 Inhibitory action of PTC on chemiluminescence of
zymosan-activited leucocytes (n=14,x±s)
Group
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cpmmax/(min-1。cell-1)
A (Control)
1.38±0.44
B (OZ)
4.32±2.14b
C (OZ+SOD)
3.48±2.40
D (OZ+PTC)
2.22±0.71
aP<0.01 vs A,C,D group. cpm：per minite chemiluminescence value; PTC:protocatechualdehyde-thiosemicarbazone-copper(Ⅱ)complexs; OZ:opsonin zymosan;SOD:superoxide dismutase. ③酵母多糖使人白细胞激活，引起全血低切(5.75 s-1 )粘度升高，而PTC,SOD均能使这种升高的粘度降低(Tab 2).
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表 2 PTC对血液粘度的影响
Tab 2 Effects of PTC on viscosity in human blood (x±s)
Group
n
η/(mPa。s)
A (Control)
14
11.4±1.9
B (OZ)
14
13.4±1.4b
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C (OZ+SOD)
14
11.6±3.0
D (OZ+PTC)
12
12.0±0.7
bP<0.01 vs A,C,D group. PTC,OZ,SOD:The same as in Tab1. ④OZ激活的人白细胞，能使血浆的脂质过氧化产物MDA值升高，而PTC能使其值显著降低(Tab 3).
表 3 PTC对血浆MDA含量的影响
Tab 3 Effect of PTC on MDA concentration in the plasma (n=10, x±s)
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Group
c(MDA)/(μmol。L-1)
A (Contnol)
4.4±2.2
B (OZ)
4.8±2.3b
C (OZ+SOD)
4.5±2.1
D (OZ+PTC)
4.0±2.2
bP<0.01 vs A,D group. MDA:malondialdehyde; PTC, OZ,SOD:The same as in Tab 1. ⑤烧伤使小鼠血清中MDA和NO2-含量增高(8 h最高)，而当给于PTC,SOD药膜治疗后，血清中MDA和NO2-值显著下降(Tab 4)；同时创面的愈合情况和组织形态学观察显示，PTC和SOD组均优于空白对照组，PTC及SOD组在光镜下均见表皮及真皮小部分变性坏死，皮下组织及肌肉深部筋膜只有少量嗜中性白细胞浸润. 而空白对照组镜下可见皮下脓胞，表皮大部分脱落，胶原纤维变性，血管充血，汗腺上皮细胞坏死，真皮及皮下脂肪和肌肉深部有大量嗜中性白细胞浸润，部分肌纤维坏死.
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表 4 烫伤后不同时间血清中MDA和NO2-含量变化
Tab 4 MDA and NO2- concentration change in serum of mice at different time point after burn (n=10,x±s)
Group
c(MDA)/(μmol。L-1)
c(NO2-)/(μmol。L-1)
8 h
20 h
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8 h
20 h
A(Control)
0.19±0.02
0.10±0.02
1.00±0.19
0.93±0.04
B(NS)
0.38±0.03b
0.28±0.03b
2.68±0.03b
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1.14±0.79b
C(SOD)
0.21±0.02
0.19±0.01
1.63±0.25
1.16±0.08
D(PTC)
0.29±0.02
0.18±0.01
1.48±0.25
0.63±0.14
, 百拇医药 bP<0.01 vs A,C,D group；there is no obvious difference among C,D groups. NO2- content change is positively related to that of MDA ( r=0.8609, P<0.01). NS：normal saline. MDA:The same as in Tab 3;SOD,PTC:The same as in Tab 1. 3 讨论
我们的实验证明，SOD模拟物PTC是一种很强的O2.-自由基清除剂，对O2.-介导的组织细胞的氧化损伤有保护作用. PTC是以中药丹参有效成份原儿茶醛、氨基硫脲、硫酸铜为原料合成的，原儿茶醛本身就具有清除O2.-的作用，而氨基硫脲是羟自由基清除剂，变价元素Cu亦有歧化O2.-的作用. 我们设想，PTC进入生物体内，各种成份能协同作用. PTC可望作为一种中药有效成份的金属配合物新药，用于临床治疗由于自由基代谢异常引起的疾病.
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基金项目：军队“八五”攻关课题基金资助 No. 91A001-0035
作者简介：王多宁，男，1956-09-08生，甘肃省静宁县人，汉族. 1997年第四军医大学医学实验技术专业本科毕业，实验师，发表论文50篇. 电话：(029)2530009
作者单位：王多宁 莫 简 孙淑芬 骆文博 郭正仁 第四军医大学:基础部自由基生物学研究室，巨宏博 范家骏 张建保 生物医学工程系物理学教研室, 陕西 西安 710033
参考文献
1 莫 简. 关于自由基在生物体系中作用的几点看法. 第四军医大学学报，1997；18(2)： 199-200
2 Mo J, Fan JJ, Guo ZR et al. A new hypothesis about the relationship between free radical reactions and hemorheological properties in vivo. Med Hypotheses,1993;41(4):516-520
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3 骆文博，莫 简，王多宁 et al.3，4-二羟基苯甲醛缩氨基硫脲及其铜(Ⅱ)络合物的合成. 第四军医大学学报，1995；16(3)：172
4 董元林，盛志勇，张遵一. 白细胞化学发光的微量全血恒温测定法研究. 中华微生物学和免疫学杂志，1986；6(3)：144-147
5 OH Kawa H,Ohishi N,Yagi K et al. Assay for lipid peroxide in animal tissues by thiobarbitruic acid reaction. Anal Biochem, 1997;95(2):351-358
6 王吉村，莫 简，孙长凯et al .组织及组织液中一氧化氮的荧光分光光度法检测. 第四军医大学学报，1995；16(6)：463, 百拇医药