消瘀片对粥样硬化兔血管壁组织中ET、NO及细胞凋亡的影响
作者：谢梅林 顾振纶 陈可冀 周文轩 郭次仪
单位：谢梅林 顾振纶(苏州中药研究所 苏州 215007)；陈可冀(中国中医研究院 北京 100091)周文轩 郭次仪(中国香港 香港保健协会)
关键词：消瘀片；动脉粥样硬化；内皮素；一氧化氮；凋亡
中国现代应用药学000603 摘要 目的：探讨消瘀片减少粥样硬化血管壁中平滑肌细胞数的作用机理。方法：雄性新西兰兔高脂饮食加腹主动脉内膜剥脱术制成腹主动脉粥样硬化模型，通过放免法、比色法、原位末端标记及图像分析技术分别测定连续给予消瘀片0.16～0.32g/(kg.d)治疗16周后血管壁组织中ET、NO及细胞凋亡的变化。结果：服用消瘀片后的兔粥样硬化血管壁组织中ET含量降低，NO含量增加，凋亡细胞阳性反应颗粒所占的面积和积分光密度值减少。结论：消瘀片通过降低血管壁中的ET而抑制平滑肌细胞的增生，通过增加血管壁中的NO诱导细胞凋亡及加强对凋亡细胞的清除。
, 百拇医药
Effects of Xiaoyu tablets on ET,NO and apoptotic cells of atherosclerotic vessel wall in rabbits
Xie Meilin(Xie ML),Gu Zhenlun(Gu ZL),Chen Keji(Chen KJ),et al
(Suzhou Institute of Chinese Materia Medica,Suzhou 215007)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate the action mechanism of Xiaoyu tablets on reduction of smooth muscle cells(SMC) in atherosclerotic vessel wall.METHOD:The atherosclerotic model was generated with male New Zealand rabbits that were given high fat diet and abrasion of the abdominal aorta endothelial cells.The rabbits were then administered with xiaoyu tablets 0.16～0.32g/(kg.d) for 16 weeks.Changes in endothelin(ET),nitric oxide(NO) and apoptotic cells of atherosclerotic vessel wall were determined by the radioimmunoassay,colorimetric method and the techniques of DNA in situ end labeling and image pattern analysis,respectively.RESULTS:The ET in atherosclerotic vessel wall was decreased,NO was increased and the area and integral optical density of labeled apoptotic nuclei were markedly decreased.CONCLUSION:Xiaoyu tablets not only inhibited proliferation of SMC through reducing ET in atherosclerotic vessel wall,but also induced apoptosis of proliferated SMC and enhanced the recognition and phagocytosis of phagocyte or SMC on apoptotic cells by means of increasing NO in vessel wall.
, 百拇医药
KEY WORDS Xiaoyu tablet,atherosclerosis,endothelin,nitric oxide,apoptosis
消瘀片为丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)水提取物和山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)醇提取物按一定比例混合组成的纯中药制剂。我们的动物实验和临床研究已经证明，它具有抑制血小板聚集[1]、调节血脂[2～4]和消退颈动脉粥样斑块[5]的作用。本文采用放免法、比色法、原位末端标记及图像分析技术，观察消瘀片对动脉粥样硬化兔血管壁组织中内皮素(endothelin,ET)、一氧化氮(nitric oxide,NO)及其合酶(nitric oxide sythase,NOS)活性和细胞凋亡的影响，以进一步探讨其减少动脉粥样硬化血管壁中平滑肌细胞数的可能机理。
1 实验材料
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1.1 药物与试剂
消瘀片为棕褐色粉末，系太平保健药业(蛇口)有限公司提供，批号：960712，临用时用蒸馏水配至所需浓度。力平脂(法国科尼大药厂，批号：950520)。胆固醇(南京生物化学制药厂，批号：950328)。猪油系市售产品。125I-ET-1放免测定试剂盒和NO代谢产物硝酸盐测定试剂盒(北京东亚免疫技术研究所，批号分别为970810和970724)。L-精氨酸和还原型辅酶Ⅱ四钠盐(NADPH)(上海伯奥生物科技公司，批号分别为960311和960912)。钙调蛋白和盐酸萘乙胺(Sigma，批号分别为16H8015和96H0581)。二硫代苏糖醇(DTT)(华美生物工程公司，批号：27117C)。蛋白酶K，NBT/BCIP和细胞凋亡原位检测试剂盒(德国宝灵曼公司，批号分别为84010733，84019020-07和1715003(2))。地塞米松磷酸钠注射液(江苏省江阴制药厂，批号：950528)。其它试剂均为分析纯。
, http://www.100md.com 1.2 实验仪器
ZS83-1型内切式组织匀浆机(浙西机械厂)。TGL.16G型高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)。721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)。SN-682B型放射免疫γ-计数器(上海核福光电仪器有限公司)。电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进机械厂)。荧光显微镜(日本制造)。KS-400型图像分析系统(德国远东蔡司公司)。
1.3 实验动物
雄性新西兰兔(体重为2～2.5kg)和雄性小鼠(体重为20～22克)，由苏州医学院实验动物中心提供，动物合格证号为苏动(环)96001和苏动(质)96001。
2 方 法
2.1 兔腹主动脉粥样硬化模型复制及实验分组
, http://www.100md.com 按我室先前的报道[6]制备兔腹主动脉粥样硬化模型，将已形成腹主动脉粥样硬化兔24只随机分为4组，即粥样硬化组，消瘀片小剂量组[0.16g/(kg.d)]和大剂量组[0.32g/(kg.d)]，力平脂组[15mg/(kg.d)]，另加一组伪手术对照组，每组6只，连续给药16周后颈动脉放血处死，迅速取出腹主动脉5mm置10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后置4℃保存，用于检测细胞凋亡，另取二段腹主动脉，按2.2方法处理后，用于测定ET-1、NO含量和NOS活性。
2.2 血管组织样品制备及有关指标测定
取给药至16周时兔腹主动脉，用PBS洗去血迹，滤纸吸干后称重，按5%加入1mol/L醋酸溶液，略作碾磨，然后在100℃水浴中煮沸10min，室温冷却后匀浆，再经3000r/min离心15min后，取上清液并用PBS稀释10倍后，按试剂盒说明书在γ-计数测定仪上测定ET-1的含量。若用事先准备好的冰浴pH7.4 50mmol/L Tris缓冲液冲洗兔腹主动脉三次，再用虹膜剪刀剪碎后加适量同上Tris缓冲液，在冰浴中匀浆，然后10000r/min离心30min，取上清液后则分别按试剂盒说明书方法测定NO和王氏方法[7]测定NOS的活性。1mg蛋白质在酶反应中1min产生的量表示血管组织中的NOS活性。血管组织中的蛋白含量按Folin-酚试剂法测定。
, 百拇医药
2.3 小鼠胸腺阳性和阴性凋亡细胞制备
取雄性小鼠4只，体重为20～22g，其中二只小鼠一次性腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液2.5mg/kg作为阳性对照，另二只小鼠腹腔注射等量生理盐水作为阴性对照，10h后颈椎脱臼处死，取出胸腺后用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片后置4℃备用。
2.4 凋亡细胞原位检测
按试剂盒说明书进行操作，显色后在显微镜下观察结果，用图像分析仪定量测量阳性反应颗粒在整个视野中所占的面积和积分光密度(IOD)，并以此表示细胞凋亡数的多少。
2.5 统计学处理
实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。
3 结 果
, 百拇医药
3.1 消瘀片对兔粥样硬化血管壁组织中ET-1含量的影响
粥样硬化组兔血管壁组织中的ET-1含量显著高于正常对照组(P<0.01)，服用消瘀片16周后，血管壁组织中的ET-1含量呈剂量依赖性降低，消瘀片大剂量组与粥样硬化组相比较差异明显(P<0.05)(表1)。
表1 口服消瘀片16周对兔粥样硬化血管壁中ET-1含量的影响/x±s，n=6
ET-1/μg.mg-1蛋白
正常对照组
2.9±0.8
粥样硬化组
6.1±1.6*1
, http://www.100md.com
消瘀片0.16g/kg组
5.6±2.3
消瘀片0.32g/kg组
3.5±1.9*2
力平脂15mg/kg组
5.5±1.6
注：与正常对照组相比较，*1P<0.01；与粥样硬化组相比较，*2P<0.05
3.2 消瘀片对兔粥样硬化血管壁组织中NO和NOS活性的影响
粥样硬化组兔血管壁组织中NO含量明显较正常对照组为低(P<0.05)，但NOS活性高于正常对照组(P<0.05)，小剂量消瘀片对动脉壁组织中NO和NOS未见明显影响，大剂量消瘀片才可使兔腹主动脉壁组织中NO含量明显增加(P<0.05)，但NOS活性增加不明显(表2)。
, 百拇医药
表2 口服消瘀片16周对兔粥样硬化血管壁中NO和NOS活性的影响/x±s，n=6
NO(μmol/g蛋白)
NOS(nmol/min.g蛋白)
正常对照组
14.2±3.4
14.8±4.6
粥样硬化组
9.4±2.2*1
25.7±10.2*1
消瘀片0.16g/kg组
, 百拇医药
9.1±1.9
22.2±7.4
消瘀片0.32g/kg组
14.5±4.2*2
33.6±11.6
力平脂15mg/kg组
10.3±3.4
32.2±17.4
注：与正常对照组相比较，*1P<0.05；与粥样硬化组相比较，*2P<0.05
3.3 消瘀片对兔粥样硬化血管壁组织中细胞凋亡的影响
, 百拇医药
在荧光显微镜下，腹腔注射地塞米松小鼠胸腺组织可见有较多点状蓝色荧光颗粒，而正常小鼠胸腺组织不产生荧光颗粒，提示所用的实验方法可靠。
对兔血管壁组织凋亡细胞检测结果表明，正常血管壁组织未见凋亡细胞产生的蓝色荧光颗粒，而粥样硬化血管壁组织整个视野满布大小不等的荧光颗粒，给兔口服消瘀片16周后，荧光颗粒明显减少。图像分析结果表明，与正常对照组相比较，粥样硬化组阳性颗粒所占的面积和IOD均显著增加(P<0.01)，给消瘀片后，面积和IOD均较粥样硬化组明显减少，并呈现良好的剂量依赖性(表3)。
表3 凋亡细胞阳性颗粒检测图像分析结果/x±s，n=6
IOD
面积/μm2
正常对照组
, http://www.100md.com
51±8
235±23
粥样硬化组
846±308*1
3424±1373*1
消瘀片0.16g/kg组
324±141*2
1799±590*3
消瘀片0.32g/kg组
225±60*2
, http://www.100md.com 1445±605*3
力平脂15mg/kg组
430±98*3
2350±773
注：与正常对照组相比较，*1P<0.01；与粥样硬化组相比较，*2P<0.01，*3P<0.05
4 讨论
动脉粥样硬化的一个重要病理特征是血管平滑肌细胞的异常增生。ET是体内强有力的长效促生长因子，可以促进血管平滑肌细胞的增殖，增殖的平滑肌细胞又可通过自分泌和旁分泌的方式产生ET，形成自我增殖。本实验结果显示，腹主动脉粥样硬化兔血管壁组织中ET-1水平显著升高，给消瘀片治疗后，在粥样斑块消退的同时，血管壁组织中的ET-1含量也明显降低，提示消瘀片可通过减少粥样硬化血管壁组织中ET-1的产生而抑制血管平滑肌细胞的增生。
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细胞凋亡是调节细胞增殖的另一种机制。大量研究证明，在动脉粥样斑块中可见有凋亡细胞存在[8，9]，并认为如果凋亡小体不能及时地被消除，将加重动脉粥样硬化[10]。这是因为过量的细胞发生凋亡而无相应的吞噬清除机制可导致巨噬细胞聚集，细胞因子分泌增加，使血管平滑肌细胞移行、增殖而加剧动脉粥样硬化的发展。本研究结果表明，粥样硬化组的凋亡细胞阳性颗粒和IOD显著增加。给消瘀片后，阳性反应颗粒明显减少，动脉粥样硬化病变程度明显减轻，这可能是由于消瘀片一方面通过增加血管壁组织中NO含量诱导细胞凋亡，另一方面通过加强吞噬细胞或平滑肌细胞对凋亡细胞表面磷脂酰丝氨酸受体的识别及随后对凋亡细胞的清除作用之故，但确切机制有待于进一步研究。
致谢：苏州中药研究所陆群和朱路佳同志参加部分实验操作。
香港保健协会资助项目第960086号
谢梅林，男，42岁，医学博士，副教授，现为上海中医药大学博士后研究人员
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参考文献
1，谢梅林，陆群，朱路佳，等.丹心Ⅲ号、丹心Ⅴ号对血小板聚集功能的影响.中国野生植物资源，1995,(2)∶15.
2，谢梅林，顾振纶，陈可冀，等.消瘀片对实验性高血脂症兔的治疗作用研究.中国现代应用药学，1998,15(6)∶15.
3，谢梅林，顾振纶，陈可冀，等.消瘀片降血脂作用研究.中草药，1998,29(3)∶178.
4，谢梅林，顾振纶，陈可冀，等.消瘀片对高脂小鼠降血脂的时效关系研究.中国中药杂志，1999,24(4)∶229.
5，谢梅林，顾振纶，钟蓓，等.消瘀片治疗颈动脉粥样硬化的疗效观察.中成药，1999,21(10)∶515.
6，谢梅林，顾振纶，陈可冀，等.消瘀片对粥样硬化兔血管壁组织ET-1mRNA和NOSmRNA表达的影响.中草药,1999,30(11)∶834.
, http://www.100md.com
7，王成彬，田亚平，沈文梅，等.大鼠脑组织中一氧化氮合酶测定.生物化学与生物物理进展，1996,23(6)∶548.
8，Bjorkerud S and Bjorkerud B.Apoptosis is abundant in human atherosclerotic lesions,especially in inflammatory cells(macrophages and T cells),and may contribute to the accumulation of gruel and plaque instability.Am J Pathol,1996,149∶367.
9，Geng TJ and Libby P.Evidence for apoptosis in advanced human atheroma.Am J Pathol,1995,147∶251.
10，朱云松，王玲，李进.血管平滑肌细胞凋亡与动脉粥样硬化.国外医学.老年医学分册，1997,18(2)∶53.
收稿日期：1999-03-09, http://www.100md.com
单位：谢梅林 顾振纶(苏州中药研究所 苏州 215007)；陈可冀(中国中医研究院 北京 100091)周文轩 郭次仪(中国香港 香港保健协会)
关键词：消瘀片；动脉粥样硬化；内皮素；一氧化氮；凋亡
中国现代应用药学000603 摘要 目的：探讨消瘀片减少粥样硬化血管壁中平滑肌细胞数的作用机理。方法：雄性新西兰兔高脂饮食加腹主动脉内膜剥脱术制成腹主动脉粥样硬化模型，通过放免法、比色法、原位末端标记及图像分析技术分别测定连续给予消瘀片0.16～0.32g/(kg.d)治疗16周后血管壁组织中ET、NO及细胞凋亡的变化。结果：服用消瘀片后的兔粥样硬化血管壁组织中ET含量降低，NO含量增加，凋亡细胞阳性反应颗粒所占的面积和积分光密度值减少。结论：消瘀片通过降低血管壁中的ET而抑制平滑肌细胞的增生，通过增加血管壁中的NO诱导细胞凋亡及加强对凋亡细胞的清除。
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Effects of Xiaoyu tablets on ET,NO and apoptotic cells of atherosclerotic vessel wall in rabbits
Xie Meilin(Xie ML),Gu Zhenlun(Gu ZL),Chen Keji(Chen KJ),et al
(Suzhou Institute of Chinese Materia Medica,Suzhou 215007)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate the action mechanism of Xiaoyu tablets on reduction of smooth muscle cells(SMC) in atherosclerotic vessel wall.METHOD:The atherosclerotic model was generated with male New Zealand rabbits that were given high fat diet and abrasion of the abdominal aorta endothelial cells.The rabbits were then administered with xiaoyu tablets 0.16～0.32g/(kg.d) for 16 weeks.Changes in endothelin(ET),nitric oxide(NO) and apoptotic cells of atherosclerotic vessel wall were determined by the radioimmunoassay,colorimetric method and the techniques of DNA in situ end labeling and image pattern analysis,respectively.RESULTS:The ET in atherosclerotic vessel wall was decreased,NO was increased and the area and integral optical density of labeled apoptotic nuclei were markedly decreased.CONCLUSION:Xiaoyu tablets not only inhibited proliferation of SMC through reducing ET in atherosclerotic vessel wall,but also induced apoptosis of proliferated SMC and enhanced the recognition and phagocytosis of phagocyte or SMC on apoptotic cells by means of increasing NO in vessel wall.
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KEY WORDS Xiaoyu tablet,atherosclerosis,endothelin,nitric oxide,apoptosis
消瘀片为丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)水提取物和山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)醇提取物按一定比例混合组成的纯中药制剂。我们的动物实验和临床研究已经证明，它具有抑制血小板聚集[1]、调节血脂[2～4]和消退颈动脉粥样斑块[5]的作用。本文采用放免法、比色法、原位末端标记及图像分析技术，观察消瘀片对动脉粥样硬化兔血管壁组织中内皮素(endothelin,ET)、一氧化氮(nitric oxide,NO)及其合酶(nitric oxide sythase,NOS)活性和细胞凋亡的影响，以进一步探讨其减少动脉粥样硬化血管壁中平滑肌细胞数的可能机理。
1 实验材料
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1.1 药物与试剂
消瘀片为棕褐色粉末，系太平保健药业(蛇口)有限公司提供，批号：960712，临用时用蒸馏水配至所需浓度。力平脂(法国科尼大药厂，批号：950520)。胆固醇(南京生物化学制药厂，批号：950328)。猪油系市售产品。125I-ET-1放免测定试剂盒和NO代谢产物硝酸盐测定试剂盒(北京东亚免疫技术研究所，批号分别为970810和970724)。L-精氨酸和还原型辅酶Ⅱ四钠盐(NADPH)(上海伯奥生物科技公司，批号分别为960311和960912)。钙调蛋白和盐酸萘乙胺(Sigma，批号分别为16H8015和96H0581)。二硫代苏糖醇(DTT)(华美生物工程公司，批号：27117C)。蛋白酶K，NBT/BCIP和细胞凋亡原位检测试剂盒(德国宝灵曼公司，批号分别为84010733，84019020-07和1715003(2))。地塞米松磷酸钠注射液(江苏省江阴制药厂，批号：950528)。其它试剂均为分析纯。
, http://www.100md.com 1.2 实验仪器
ZS83-1型内切式组织匀浆机(浙西机械厂)。TGL.16G型高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)。721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)。SN-682B型放射免疫γ-计数器(上海核福光电仪器有限公司)。电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进机械厂)。荧光显微镜(日本制造)。KS-400型图像分析系统(德国远东蔡司公司)。
1.3 实验动物
雄性新西兰兔(体重为2～2.5kg)和雄性小鼠(体重为20～22克)，由苏州医学院实验动物中心提供，动物合格证号为苏动(环)96001和苏动(质)96001。
2 方 法
2.1 兔腹主动脉粥样硬化模型复制及实验分组
, http://www.100md.com 按我室先前的报道[6]制备兔腹主动脉粥样硬化模型，将已形成腹主动脉粥样硬化兔24只随机分为4组，即粥样硬化组，消瘀片小剂量组[0.16g/(kg.d)]和大剂量组[0.32g/(kg.d)]，力平脂组[15mg/(kg.d)]，另加一组伪手术对照组，每组6只，连续给药16周后颈动脉放血处死，迅速取出腹主动脉5mm置10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后置4℃保存，用于检测细胞凋亡，另取二段腹主动脉，按2.2方法处理后，用于测定ET-1、NO含量和NOS活性。
2.2 血管组织样品制备及有关指标测定
取给药至16周时兔腹主动脉，用PBS洗去血迹，滤纸吸干后称重，按5%加入1mol/L醋酸溶液，略作碾磨，然后在100℃水浴中煮沸10min，室温冷却后匀浆，再经3000r/min离心15min后，取上清液并用PBS稀释10倍后，按试剂盒说明书在γ-计数测定仪上测定ET-1的含量。若用事先准备好的冰浴pH7.4 50mmol/L Tris缓冲液冲洗兔腹主动脉三次，再用虹膜剪刀剪碎后加适量同上Tris缓冲液，在冰浴中匀浆，然后10000r/min离心30min，取上清液后则分别按试剂盒说明书方法测定NO和王氏方法[7]测定NOS的活性。1mg蛋白质在酶反应中1min产生的量表示血管组织中的NOS活性。血管组织中的蛋白含量按Folin-酚试剂法测定。
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2.3 小鼠胸腺阳性和阴性凋亡细胞制备
取雄性小鼠4只，体重为20～22g，其中二只小鼠一次性腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液2.5mg/kg作为阳性对照，另二只小鼠腹腔注射等量生理盐水作为阴性对照，10h后颈椎脱臼处死，取出胸腺后用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片后置4℃备用。
2.4 凋亡细胞原位检测
按试剂盒说明书进行操作，显色后在显微镜下观察结果，用图像分析仪定量测量阳性反应颗粒在整个视野中所占的面积和积分光密度(IOD)，并以此表示细胞凋亡数的多少。
2.5 统计学处理
实验数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。
3 结 果
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3.1 消瘀片对兔粥样硬化血管壁组织中ET-1含量的影响
粥样硬化组兔血管壁组织中的ET-1含量显著高于正常对照组(P<0.01)，服用消瘀片16周后，血管壁组织中的ET-1含量呈剂量依赖性降低，消瘀片大剂量组与粥样硬化组相比较差异明显(P<0.05)(表1)。
表1 口服消瘀片16周对兔粥样硬化血管壁中ET-1含量的影响/x±s，n=6
ET-1/μg.mg-1蛋白
正常对照组
2.9±0.8
粥样硬化组
6.1±1.6*1
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消瘀片0.16g/kg组
5.6±2.3
消瘀片0.32g/kg组
3.5±1.9*2
力平脂15mg/kg组
5.5±1.6
注：与正常对照组相比较，*1P<0.01；与粥样硬化组相比较，*2P<0.05
3.2 消瘀片对兔粥样硬化血管壁组织中NO和NOS活性的影响
粥样硬化组兔血管壁组织中NO含量明显较正常对照组为低(P<0.05)，但NOS活性高于正常对照组(P<0.05)，小剂量消瘀片对动脉壁组织中NO和NOS未见明显影响，大剂量消瘀片才可使兔腹主动脉壁组织中NO含量明显增加(P<0.05)，但NOS活性增加不明显(表2)。
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表2 口服消瘀片16周对兔粥样硬化血管壁中NO和NOS活性的影响/x±s，n=6
NO(μmol/g蛋白)
NOS(nmol/min.g蛋白)
正常对照组
14.2±3.4
14.8±4.6
粥样硬化组
9.4±2.2*1
25.7±10.2*1
消瘀片0.16g/kg组
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9.1±1.9
22.2±7.4
消瘀片0.32g/kg组
14.5±4.2*2
33.6±11.6
力平脂15mg/kg组
10.3±3.4
32.2±17.4
注：与正常对照组相比较，*1P<0.05；与粥样硬化组相比较，*2P<0.05
3.3 消瘀片对兔粥样硬化血管壁组织中细胞凋亡的影响
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在荧光显微镜下，腹腔注射地塞米松小鼠胸腺组织可见有较多点状蓝色荧光颗粒，而正常小鼠胸腺组织不产生荧光颗粒，提示所用的实验方法可靠。
对兔血管壁组织凋亡细胞检测结果表明，正常血管壁组织未见凋亡细胞产生的蓝色荧光颗粒，而粥样硬化血管壁组织整个视野满布大小不等的荧光颗粒，给兔口服消瘀片16周后，荧光颗粒明显减少。图像分析结果表明，与正常对照组相比较，粥样硬化组阳性颗粒所占的面积和IOD均显著增加(P<0.01)，给消瘀片后，面积和IOD均较粥样硬化组明显减少，并呈现良好的剂量依赖性(表3)。
表3 凋亡细胞阳性颗粒检测图像分析结果/x±s，n=6
IOD
面积/μm2
正常对照组
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51±8
235±23
粥样硬化组
846±308*1
3424±1373*1
消瘀片0.16g/kg组
324±141*2
1799±590*3
消瘀片0.32g/kg组
225±60*2
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力平脂15mg/kg组
430±98*3
2350±773
注：与正常对照组相比较，*1P<0.01；与粥样硬化组相比较，*2P<0.01，*3P<0.05
4 讨论
动脉粥样硬化的一个重要病理特征是血管平滑肌细胞的异常增生。ET是体内强有力的长效促生长因子，可以促进血管平滑肌细胞的增殖，增殖的平滑肌细胞又可通过自分泌和旁分泌的方式产生ET，形成自我增殖。本实验结果显示，腹主动脉粥样硬化兔血管壁组织中ET-1水平显著升高，给消瘀片治疗后，在粥样斑块消退的同时，血管壁组织中的ET-1含量也明显降低，提示消瘀片可通过减少粥样硬化血管壁组织中ET-1的产生而抑制血管平滑肌细胞的增生。
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细胞凋亡是调节细胞增殖的另一种机制。大量研究证明，在动脉粥样斑块中可见有凋亡细胞存在[8，9]，并认为如果凋亡小体不能及时地被消除，将加重动脉粥样硬化[10]。这是因为过量的细胞发生凋亡而无相应的吞噬清除机制可导致巨噬细胞聚集，细胞因子分泌增加，使血管平滑肌细胞移行、增殖而加剧动脉粥样硬化的发展。本研究结果表明，粥样硬化组的凋亡细胞阳性颗粒和IOD显著增加。给消瘀片后，阳性反应颗粒明显减少，动脉粥样硬化病变程度明显减轻，这可能是由于消瘀片一方面通过增加血管壁组织中NO含量诱导细胞凋亡，另一方面通过加强吞噬细胞或平滑肌细胞对凋亡细胞表面磷脂酰丝氨酸受体的识别及随后对凋亡细胞的清除作用之故，但确切机制有待于进一步研究。
致谢：苏州中药研究所陆群和朱路佳同志参加部分实验操作。
香港保健协会资助项目第960086号
谢梅林，男，42岁，医学博士，副教授，现为上海中医药大学博士后研究人员
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参考文献
1，谢梅林，陆群，朱路佳，等.丹心Ⅲ号、丹心Ⅴ号对血小板聚集功能的影响.中国野生植物资源，1995,(2)∶15.
2，谢梅林，顾振纶，陈可冀，等.消瘀片对实验性高血脂症兔的治疗作用研究.中国现代应用药学，1998,15(6)∶15.
3，谢梅林，顾振纶，陈可冀，等.消瘀片降血脂作用研究.中草药，1998,29(3)∶178.
4，谢梅林，顾振纶，陈可冀，等.消瘀片对高脂小鼠降血脂的时效关系研究.中国中药杂志，1999,24(4)∶229.
5，谢梅林，顾振纶，钟蓓，等.消瘀片治疗颈动脉粥样硬化的疗效观察.中成药，1999,21(10)∶515.
6，谢梅林，顾振纶，陈可冀，等.消瘀片对粥样硬化兔血管壁组织ET-1mRNA和NOSmRNA表达的影响.中草药,1999,30(11)∶834.
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7，王成彬，田亚平，沈文梅，等.大鼠脑组织中一氧化氮合酶测定.生物化学与生物物理进展，1996,23(6)∶548.
8，Bjorkerud S and Bjorkerud B.Apoptosis is abundant in human atherosclerotic lesions,especially in inflammatory cells(macrophages and T cells),and may contribute to the accumulation of gruel and plaque instability.Am J Pathol,1996,149∶367.
9，Geng TJ and Libby P.Evidence for apoptosis in advanced human atheroma.Am J Pathol,1995,147∶251.
10，朱云松，王玲，李进.血管平滑肌细胞凋亡与动脉粥样硬化.国外医学.老年医学分册，1997,18(2)∶53.
收稿日期：1999-03-09, http://www.100md.com