虎杖提取物的生产工艺优化及其质量检测
作者：袁珂 杨中汉 殷鹏辉 呼海涛
单位：杨中汉(焦作大学 焦作 454001)；袁珂 殷鹏辉 呼海涛(河南中医学院中药系 郑州 450003)
关键词：正交试验法；虎杖；大黄素；质量检测
中国现代应用药学000606 摘要 目的：研究回流提取法中虎杖的最佳提取条件，并建立质量检测的方法。方法：采用正交试验法，以溶剂用量、提取时间和提取次数3个因素，每个因素选取3个水平进行正交试验，并采用薄层扫描法对虎杖药材及提取物中的有效成分大黄素进行含量测定。结果：因素A和因素B对大黄素的含量有显著性影响。结论：最佳工艺A2B2C3，即用6倍量95%乙醇回流提取3次，每次2h；虎杖药材中大黄素含量为0.658%，虎杖提取物中大黄素含量为3.544%。
The process choice of rhizoma poizoma cuspidatum extracted substance and quality analysis
, http://www.100md.com
Yuan Ke(Yuan K),Yang Zhonghan(Yang ZH),Yin Penghui(Yin PH),et al
(Henan College of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450003)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the best procedure for rhizoma poizoma cuspidatum by the circling extracting method and establish a method for quality control.METHOD:The solvent dosage,extracting time and extracting times are the three factors in the experiment,and we choose three levels for each factor to do the experimentby orthogonal test method.The content of emodin in rhizoma polygonum cuspidatum and extracted substance was determined by TLC scanning method.RESULTS:The factor A and B has conspicuous effect on the extraction of emodin.CONCLUSION:The best extracting process is A2B2C3,i.e. extracting with EtOH(95%) that was six times the weight of thizoma polygonum cuspidatum for three times,three hours once.The content of emodin in rhizoma polygonum cuspidatum is 0.658%,the content of emodin in extracted substance is 3.544%.
, http://www.100md.com
KEY WORDS method of orthogonal test,Rhizoma Polygonum Cuspidatum,Emodin,Quality analysis
虎杖为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)的根茎和根。虎杖含游离蒽醌及蒽醌苷，主要为大黄素、大黄素甲醚和大黄酚以及蒽苷A、蒽苷B。虎杖中的大黄素含量较高。根据报道[1，2]，虎杖中主要有效成分大黄素具有抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用，同时还具有解痉、降压、利尿作用。近年来虽有较多关于有效成分含量研究的报道，但有关虎杖提取物的最佳生产工艺方法尚未见报道。本文采用正交试验法，以有效成分大黄素的含量为考察指标，优选了虎杖提取物的最佳生产工艺，并采用薄层扫描法对其进行了质量检测，现将结果报道如下。
1 材料与仪器
虎杖于98年5月购自河南中医学院药材经营部，产地河南省南阳地区，由本院中药系鉴定教研室陈随清副教授鉴定。
, http://www.100md.com
大黄素对照品由中国药品生物制品检定所提供。
硅胶G(青岛海洋化工厂)，95%工业酒精，其它试剂均为分析纯。
CS-9301双波长薄层扫描仪(日本岛津)，微量分析天平(EETTLER AE 240瑞士)，点样定量毛细管(USA)，真空薄膜浓缩器(自制)，超级恒温水浴(上海实验电器厂)，旋转薄膜蒸发仪(天津玻璃仪器厂)，循环水式多用真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂)，BPQI型薄层自动铺板器(重庆南岸新力实验电器厂)。
2 提取工艺优化
通过查阅有关文献资料[3，4]可知，提取虎杖药材，多采用95%乙醇回流提取，其次是70%丙酮提取。我们经过实验对比表明，尽管采用70%丙酮比95%EtOH进行提取所得提取物的收率更高，但考虑到丙酮的价格比工业酒精高得多，工业酒精价廉、易得、安全，适合规模化生产使用，且采用该溶剂提取出膏率也较高，故提取虎杖药材选用的溶剂定为95%工业酒精。
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为了确定出回流提取法的最佳提取条件，我们采用正交试验法对提取工艺进行了研究，优选出了最佳工艺条件。
2.1 样品溶液的制备 分别精密称取打成粗粉(过20目筛)的虎杖药材9份，每份100g，按正交试验表中所选取的3因素3水平进行回流提取，将提取液分别减压浓缩至干，然后用甲醇溶解转移至100ml容量瓶中用甲醇定容至刻度。用移液管吸取1ml样品溶液转移至10ml容量瓶中用甲醇定容至刻度备用。
2.2 正交设计 选用L9(34)正交方案，以提取物中大黄素的含量为考察指标，系统考察了溶剂用量、提取时间、提取次数3因素，每个因素3个水平设计试验方案，见表1。
表1 试验因素水平表 因素水平
A
B
, 百拇医药
C
溶剂用量/倍
提取时间/h
提取次数/次
1
4
1
1
2
6
2
2
3
8
, http://www.100md.com
3
3
2.3 实验数据及方差分析结果见表2，3。表2 正交试验设计及实验数据 试验号
A
B
C
大黄素含量/%
1
2
3
4
1
1
, http://www.100md.com
1
1
1
0.556
2
1
2
2
2
0.602
3
1
3
3
, 百拇医药
3
0.623
4
2
1
2
3
0.607
5
2
2
1
1
0.655
, 百拇医药
6
2
3
3
2
0.598
7
3
1
3
2
0.612
8
3
, 百拇医药
2
1
3
0.592
9
3
3
2
1
0.606
K1
1.781
1.775
, http://www.100md.com
1.803
1.817
K2
1.860
1.849
1.815
1.812
K3
1.810
1.827
1.833
1.822
, http://www.100md.com
0.594
0.592
0.601
0.606
0.620
0.616
0.605
0.604
0.603
0.609
0.611
0.607
R
, 百拇医药
0.026
0.024
0.010
0.003
表3 方差分析表 方差来源
离差平方和
自由度
方差
F值
显著性
A
1.0667×10-3
, 百拇医药 2
5.3335×10-4
63.9892
*
B
9.4300×10-4
2
4.7150×10-4
56.5789
*
C
1.4067×10-4
, http://www.100md.com
2
2.0335×10-5
8.4400
误差SSe
1.6667×10-5
2
8.3335×10-6
在正交试验中选取虎杖提取物中大黄素的含量作为优化正交方案的指标，方差分析结果表明，因素A和因素B对大黄素的含量有显著性影响，因素C则没有显著性差异，各因素影响程度依次为A>B>C。
根据表2直观分析结果，最佳组合应为A2B2C3。因此，优选出最佳工艺为每次用6倍量95%乙醇回流提取3次，每次2h。
, 百拇医药
3 最佳生产工艺
取干燥后的虎杖药材若干公斤，粉碎成粗粉后每次用6倍量95%工业酒精回流提取3次，每次2h。抽滤，合并提取液后于70℃真空薄膜浓缩[5]至稠膏状，转移至烧杯中，分少量多次进行旋转薄膜浓缩，真空抽成干燥粉未，用钢铲刮出干粉，装瓶、封存，得成品，收率为18%。
4 产品质量检测方法
4.1 对照品溶液的配制 精密称取大黄素对照品1.98mg，用甲醇溶解定容至10m1容量瓶中，为0.198mg/m1。
4.2 样品溶液的制备 精密称取研细并过60目筛后干燥恒重的虎杖药材10g，置索氏提取器中以甲醇为溶剂提取至近无色(6h)，将提取液减压浓缩至适量后转移至100m1容量瓶中用甲醇定容至刻度，得到虎杖药材提取样品。另精密称取虎杖提取物干粉2g，用甲醇溶解转移至100ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，得到虎杖提取物样品。
, 百拇医药
4.3 薄层层析条件及薄层扫描条件 吸附剂：硅胶G-0.3%CMC-Na搅拌均匀后涂布于(10×20cm)玻璃板上，厚度为0.5mm，室温置干后于105℃活化1h后置干燥器中备用。展开剂：石油醚-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)，温度:25-28℃，展开方式：上行展开，显色：大黄素在自然光下呈黄色斑点，展距：18cm，Rf=0.6左右。
采用反射法单波长锯齿扫描法，狭缝0.4×0.4mm，线性参数SX=3，扫描速度:15mm/min，测度波长λs=450nm。
4.4 线性化范围试验 用定量毛细管吸取上述对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0μl点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开、取出、晾干，放置30min后进行扫描测定。以大黄素量为横坐标，以斑点峰面积值为纵坐标作图，得一不通过原点的直线，求得回归方程Y=5963X-13.587，r=0.999(n=5)，结果表明大黄素在0.198-0.990μg范围内，与其峰面积值呈良好的线性关系。见表4。
, 百拇医药
表4 对照品点样量与峰面积值之间的关系 编号
对照品点样量/μg
测得峰面积值
1
0.198
1248.336
2
0.396
2340.748
3
0.594
3380.781
, http://www.100md.com
4
0.792
4632.450
5
0.990
6026.212
4.5 稳定性与精密度试验 在同一块硅胶G薄层板上，点大黄素对照品溶液2μl，展开、晾干后，分别于30，60，90和120min进行扫描，结果2h内斑点峰面积值不变，=2274.325，RSD=1.34%。
用定量毛细管吸取对照品溶液4μl点于同一块硅胶G薄层板上，进行展开、扫描，结果斑点峰面积值平均值=4871.641，RSD=1.67%，说明精密度尚好。
4.6 样品测定 吸取上述虎杖药材提取样品1μl和2μl，虎杖提取物样品1μl和2μl，点于同一硅胶G薄层板上，随行点对照品溶液2μl和5μl，进行展开、扫描，用外标两点法计算出各样品中大黄素的含量，结果见表5。表5 样品中大黄素含量/n=3 样品
, http://www.100md.com
含量/%
平均含量/%
RSD/%
虎杖药材
0.656
0.668
0.658
1.33
0.651
虎杖提取物干粉
3.505
3.526
3.544
, 百拇医药
1.42
3.601
由表5看出，虎杖药材中大黄素平均含量为0.658%，虎杖醇提物干粉中大黄素的平均含量为3.544%。
4.7 加样回收率试验 取干燥恒重的虎杖药材5g，加入适量大黄素对照品溶液，进行提取、浓缩、定容、点样、展开、测定，结果大黄素的平均回收率为98.12%，RSD为1.47%。
5 讨 论
5.1 该工艺采用真空薄膜浓缩方法进行浓缩，具有浓缩速度快、效率高，浓缩液受热时间极短，可最大限度地保护浓缩液中的有效成分不受破坏等优点，该方法可反复浓缩，不受被浓缩液体积大小的限制，用于虎杖提取液的浓缩，效果尤为明显，因此该法可在实验室推广使用。
5.2 由于本研究是在实验室批量加工，故抽干是采用旋转薄膜蒸发的方法。若要进行工业化规模生产，建议可改用喷雾干燥或冷冻干燥等工艺操作。
, 百拇医药
5.3 由该工艺所得虎杖提取物干粉外观为棕黄色无定形粉末，能溶于水，易溶于甲醇、乙醇当中，具有吸潮性。虎杖提取物收率高达18%，提取物干粉中大黄素含量为3.544%。该工艺具有流程简单、生产周期短、提取效率高、生产成本低等优点，因此可通过扩试，供工业化生产参考。
参考文献
1，陈家堃，吴中亮，杨晖，等.大黄素对人肺癌-549细胞杀伤作用的研究.中草药,1991,22(12)∶543.
2，孙文基,绳金房主编.天然活性成分简明手册.北京:中国医药科技出版社,1998∶209.
3，苏子仁,曾惠芳,史俏蓉.虎杖提取工艺初探.中国实验方剂学,1998,4(1)∶8.
4，杨秀贤,王昕,吴寿金.从虎杖中提取大黄素的生产工艺.中草药,1996,27(2)∶87.
5，袁珂,胡润淮.介绍一种真空薄膜浓缩方法.大学化学,1997,12(3)∶39.
收稿日期：1999-12-23, 百拇医药
单位：杨中汉(焦作大学 焦作 454001)；袁珂 殷鹏辉 呼海涛(河南中医学院中药系 郑州 450003)
关键词：正交试验法；虎杖；大黄素；质量检测
中国现代应用药学000606 摘要 目的：研究回流提取法中虎杖的最佳提取条件，并建立质量检测的方法。方法：采用正交试验法，以溶剂用量、提取时间和提取次数3个因素，每个因素选取3个水平进行正交试验，并采用薄层扫描法对虎杖药材及提取物中的有效成分大黄素进行含量测定。结果：因素A和因素B对大黄素的含量有显著性影响。结论：最佳工艺A2B2C3，即用6倍量95%乙醇回流提取3次，每次2h；虎杖药材中大黄素含量为0.658%，虎杖提取物中大黄素含量为3.544%。
The process choice of rhizoma poizoma cuspidatum extracted substance and quality analysis
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Yuan Ke(Yuan K),Yang Zhonghan(Yang ZH),Yin Penghui(Yin PH),et al
(Henan College of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450003)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the best procedure for rhizoma poizoma cuspidatum by the circling extracting method and establish a method for quality control.METHOD:The solvent dosage,extracting time and extracting times are the three factors in the experiment,and we choose three levels for each factor to do the experimentby orthogonal test method.The content of emodin in rhizoma polygonum cuspidatum and extracted substance was determined by TLC scanning method.RESULTS:The factor A and B has conspicuous effect on the extraction of emodin.CONCLUSION:The best extracting process is A2B2C3,i.e. extracting with EtOH(95%) that was six times the weight of thizoma polygonum cuspidatum for three times,three hours once.The content of emodin in rhizoma polygonum cuspidatum is 0.658%,the content of emodin in extracted substance is 3.544%.
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KEY WORDS method of orthogonal test,Rhizoma Polygonum Cuspidatum,Emodin,Quality analysis
虎杖为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)的根茎和根。虎杖含游离蒽醌及蒽醌苷，主要为大黄素、大黄素甲醚和大黄酚以及蒽苷A、蒽苷B。虎杖中的大黄素含量较高。根据报道[1，2]，虎杖中主要有效成分大黄素具有抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用，同时还具有解痉、降压、利尿作用。近年来虽有较多关于有效成分含量研究的报道，但有关虎杖提取物的最佳生产工艺方法尚未见报道。本文采用正交试验法，以有效成分大黄素的含量为考察指标，优选了虎杖提取物的最佳生产工艺，并采用薄层扫描法对其进行了质量检测，现将结果报道如下。
1 材料与仪器
虎杖于98年5月购自河南中医学院药材经营部，产地河南省南阳地区，由本院中药系鉴定教研室陈随清副教授鉴定。
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大黄素对照品由中国药品生物制品检定所提供。
硅胶G(青岛海洋化工厂)，95%工业酒精，其它试剂均为分析纯。
CS-9301双波长薄层扫描仪(日本岛津)，微量分析天平(EETTLER AE 240瑞士)，点样定量毛细管(USA)，真空薄膜浓缩器(自制)，超级恒温水浴(上海实验电器厂)，旋转薄膜蒸发仪(天津玻璃仪器厂)，循环水式多用真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂)，BPQI型薄层自动铺板器(重庆南岸新力实验电器厂)。
2 提取工艺优化
通过查阅有关文献资料[3，4]可知，提取虎杖药材，多采用95%乙醇回流提取，其次是70%丙酮提取。我们经过实验对比表明，尽管采用70%丙酮比95%EtOH进行提取所得提取物的收率更高，但考虑到丙酮的价格比工业酒精高得多，工业酒精价廉、易得、安全，适合规模化生产使用，且采用该溶剂提取出膏率也较高，故提取虎杖药材选用的溶剂定为95%工业酒精。
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为了确定出回流提取法的最佳提取条件，我们采用正交试验法对提取工艺进行了研究，优选出了最佳工艺条件。
2.1 样品溶液的制备 分别精密称取打成粗粉(过20目筛)的虎杖药材9份，每份100g，按正交试验表中所选取的3因素3水平进行回流提取，将提取液分别减压浓缩至干，然后用甲醇溶解转移至100ml容量瓶中用甲醇定容至刻度。用移液管吸取1ml样品溶液转移至10ml容量瓶中用甲醇定容至刻度备用。
2.2 正交设计 选用L9(34)正交方案，以提取物中大黄素的含量为考察指标，系统考察了溶剂用量、提取时间、提取次数3因素，每个因素3个水平设计试验方案，见表1。
表1 试验因素水平表 因素水平
A
B
, 百拇医药
C
溶剂用量/倍
提取时间/h
提取次数/次
1
4
1
1
2
6
2
2
3
8
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3
3
2.3 实验数据及方差分析结果见表2，3。表2 正交试验设计及实验数据 试验号
A
B
C
大黄素含量/%
1
2
3
4
1
1
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1
1
1
0.556
2
1
2
2
2
0.602
3
1
3
3
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3
0.623
4
2
1
2
3
0.607
5
2
2
1
1
0.655
, 百拇医药
6
2
3
3
2
0.598
7
3
1
3
2
0.612
8
3
, 百拇医药
2
1
3
0.592
9
3
3
2
1
0.606
K1
1.781
1.775
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1.803
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1.860
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1.815
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K3
1.810
1.827
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0.601
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0.603
0.609
0.611
0.607
R
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0.026
0.024
0.010
0.003
表3 方差分析表 方差来源
离差平方和
自由度
方差
F值
显著性
A
1.0667×10-3
, 百拇医药 2
5.3335×10-4
63.9892
*
B
9.4300×10-4
2
4.7150×10-4
56.5789
*
C
1.4067×10-4
, http://www.100md.com
2
2.0335×10-5
8.4400
误差SSe
1.6667×10-5
2
8.3335×10-6
在正交试验中选取虎杖提取物中大黄素的含量作为优化正交方案的指标，方差分析结果表明，因素A和因素B对大黄素的含量有显著性影响，因素C则没有显著性差异，各因素影响程度依次为A>B>C。
根据表2直观分析结果，最佳组合应为A2B2C3。因此，优选出最佳工艺为每次用6倍量95%乙醇回流提取3次，每次2h。
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3 最佳生产工艺
取干燥后的虎杖药材若干公斤，粉碎成粗粉后每次用6倍量95%工业酒精回流提取3次，每次2h。抽滤，合并提取液后于70℃真空薄膜浓缩[5]至稠膏状，转移至烧杯中，分少量多次进行旋转薄膜浓缩，真空抽成干燥粉未，用钢铲刮出干粉，装瓶、封存，得成品，收率为18%。
4 产品质量检测方法
4.1 对照品溶液的配制 精密称取大黄素对照品1.98mg，用甲醇溶解定容至10m1容量瓶中，为0.198mg/m1。
4.2 样品溶液的制备 精密称取研细并过60目筛后干燥恒重的虎杖药材10g，置索氏提取器中以甲醇为溶剂提取至近无色(6h)，将提取液减压浓缩至适量后转移至100m1容量瓶中用甲醇定容至刻度，得到虎杖药材提取样品。另精密称取虎杖提取物干粉2g，用甲醇溶解转移至100ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，得到虎杖提取物样品。
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4.3 薄层层析条件及薄层扫描条件 吸附剂：硅胶G-0.3%CMC-Na搅拌均匀后涂布于(10×20cm)玻璃板上，厚度为0.5mm，室温置干后于105℃活化1h后置干燥器中备用。展开剂：石油醚-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)，温度:25-28℃，展开方式：上行展开，显色：大黄素在自然光下呈黄色斑点，展距：18cm，Rf=0.6左右。
采用反射法单波长锯齿扫描法，狭缝0.4×0.4mm，线性参数SX=3，扫描速度:15mm/min，测度波长λs=450nm。
4.4 线性化范围试验 用定量毛细管吸取上述对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0μl点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂展开、取出、晾干，放置30min后进行扫描测定。以大黄素量为横坐标，以斑点峰面积值为纵坐标作图，得一不通过原点的直线，求得回归方程Y=5963X-13.587，r=0.999(n=5)，结果表明大黄素在0.198-0.990μg范围内，与其峰面积值呈良好的线性关系。见表4。
, 百拇医药
表4 对照品点样量与峰面积值之间的关系 编号
对照品点样量/μg
测得峰面积值
1
0.198
1248.336
2
0.396
2340.748
3
0.594
3380.781
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4
0.792
4632.450
5
0.990
6026.212
4.5 稳定性与精密度试验 在同一块硅胶G薄层板上，点大黄素对照品溶液2μl，展开、晾干后，分别于30，60，90和120min进行扫描，结果2h内斑点峰面积值不变，=2274.325，RSD=1.34%。
用定量毛细管吸取对照品溶液4μl点于同一块硅胶G薄层板上，进行展开、扫描，结果斑点峰面积值平均值=4871.641，RSD=1.67%，说明精密度尚好。
4.6 样品测定 吸取上述虎杖药材提取样品1μl和2μl，虎杖提取物样品1μl和2μl，点于同一硅胶G薄层板上，随行点对照品溶液2μl和5μl，进行展开、扫描，用外标两点法计算出各样品中大黄素的含量，结果见表5。表5 样品中大黄素含量/n=3 样品
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含量/%
平均含量/%
RSD/%
虎杖药材
0.656
0.668
0.658
1.33
0.651
虎杖提取物干粉
3.505
3.526
3.544
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1.42
3.601
由表5看出，虎杖药材中大黄素平均含量为0.658%，虎杖醇提物干粉中大黄素的平均含量为3.544%。
4.7 加样回收率试验 取干燥恒重的虎杖药材5g，加入适量大黄素对照品溶液，进行提取、浓缩、定容、点样、展开、测定，结果大黄素的平均回收率为98.12%，RSD为1.47%。
5 讨 论
5.1 该工艺采用真空薄膜浓缩方法进行浓缩，具有浓缩速度快、效率高，浓缩液受热时间极短，可最大限度地保护浓缩液中的有效成分不受破坏等优点，该方法可反复浓缩，不受被浓缩液体积大小的限制，用于虎杖提取液的浓缩，效果尤为明显，因此该法可在实验室推广使用。
5.2 由于本研究是在实验室批量加工，故抽干是采用旋转薄膜蒸发的方法。若要进行工业化规模生产，建议可改用喷雾干燥或冷冻干燥等工艺操作。
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5.3 由该工艺所得虎杖提取物干粉外观为棕黄色无定形粉末，能溶于水，易溶于甲醇、乙醇当中，具有吸潮性。虎杖提取物收率高达18%，提取物干粉中大黄素含量为3.544%。该工艺具有流程简单、生产周期短、提取效率高、生产成本低等优点，因此可通过扩试，供工业化生产参考。
参考文献
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收稿日期：1999-12-23, 百拇医药