氟尿嘧啶白蛋白微球的制备工艺研究
作者：徐希明 余江南 张钧寿
单位：余江南(镇江医学院药学系 镇江 212001)；徐希明 张钧寿(中国药科大学药剂教研室 南京 210009)
关键词：氟尿嘧啶；白蛋白微球；正交设计
中国现代应用药学000611 摘要 目的：制备具有肝靶向意义的氟尿嘧啶白蛋白微球。 方法：采用乳化热固化技术制备氟尿嘧啶白蛋白微球。以粒子(粒径<1μm)分布百 分数、载药量、包封率为指标,设立总的优化指数,选择固化温度、固化时间、搅拌速度、油 /水体积比为因素,每个因素各取4个水平,按L16(45)正交设计优化制备工艺。结果：四个因素中,固化温度对总优化指数影响最大(P<0.0 1),其次是固化时间、搅拌速度(P<0.05), 而油/水体积比则几乎没有影 响(P>0.05)。经过优选制得的Fu-BM, 扫描电镜观察呈规则球形。粒径 范围为0.15～0.98μm,跨距为0.65,平均粒径0.56μm。载药量、包封率分别为6.13%、90.38 %。结论：本法工艺简便、稳定，具有应用前景。
, 百拇医药
Preparation of fluorouracil albumin microspheres
Xu Ximing(Xu XM),Yu Jiangnan(Yu JN),Zhang Junshou(Zhang JS)
(Department of Pharmaceutics,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)
ABSTRACT OBJECTIVE：To preparare fluorouracil albumin microspheres for liver targeting.METHOD:Fluorouracil bovine s erum albumin microspheres(Fu-BM) were prepared by emulsion-heat stabilization technique.Four factors,including stabilization temperature,stabilization time,st irring rate,and W/O volume ratio,and four levels for each factor that may affect the formulation of microspheres were selected and arranged in an L16(54 ) orthogonal experimental table.The desirability funtion(DF),calculated accordin g to the size(<0.1μm) distribution,drug loading and drug trapping efficiency,w as introduced as a total index for the microspheres formulation.RESULTS:The four factors affect DF differently.Stabilization temperature behaves as the maximum(P<0.01),followed stirring rate and stabilization ti me(P<0.05).However,the W/O volume ratio dose not influence DF( P>0.05).Scanning electron micrographs show that Fu-BM are sphe rical.The diameter of Fu-BM ranges from 0.15～0.98μm.Span is 0.65.The average diameter is 0.56μm.The drug loading and drug trapping efficiency of Fu-BM are 6.13% and 90.38% respectively.CONCLUSION:The preparation procedure i s good,simple,and reproducible.
, 百拇医药
KEY WORDS fluorouracil,albumin mic rospheres,orthogonal experimental design
白蛋白依据来源的不同,可分为人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA),因其具有性质 稳定、无毒、可生物降解等优点而成为人们研究得最多的一种载体材料。白蛋白微球的制备 一般分两步,首先是乳化,形成W/O体系,然后固化,固化方法有两种:一是热固化,通过加热(≥ 100℃)使乳滴固化,二是化学交联,用适当的交联剂, 如甲醛、戊二醛,使蛋白变性[1] 。热固化法不适于热不稳定药物。水相中加有丙酮、乙醇可在较低的温度(70～75℃)实现 乳滴的固化[2～3]。国内对于白蛋白微球制备与临床应用,多为粒径较大的微球,以 往多用于栓塞,现多用于药物的肺部靶向。1993年,程宇慧等[4]率先在国内对白蛋 白微球作为肝靶向给药载体进行了研究,展示了诱人的应用前景。我们以氟尿嘧啶为模型药, 采用乳化热固化技术,制备了注射用氟尿嘧啶白蛋白微球(Fu-BM)。为克服以往单一指标优 化不全面性的缺点, 以粒子(粒径<1μm)分布百分数、载药量、包封率为指标,设立总优化 指数,正交设计优化制备工艺。
, 百拇医药
1 实验材料
1.1 药品与试剂
5-氟尿嘧啶(5-Fu)(南通制药厂,批号:970405);牛血清白蛋白 (上海生化试剂厂,进口分装,MW=68000,批号:970324);蓖麻油(化学纯,上海光海化学试剂厂, 批号:961221);其余试剂为分析纯。
1.2 仪器设备
JJ-2增力电动搅拌器(江苏金坛医疗仪器厂);H66025超声清洗机(无锡超声电子设备厂);DL -5大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);SHZ-82水浴恒温振荡器(江苏金坛医疗仪器厂);75 6MC型紫外可见分光光度计(上海分析仪器总厂);Olympus显微镜(日本);SX-40扫描电子显微 镜(日本)。
2 实验方法
, 百拇医药
2.1 氟尿嘧啶白蛋白微球的制备
根据文献资料总结及预试验,确定Fu-BM的基本 工艺为:称取一定量BSA置氟尿嘧啶溶液中,溶解、混匀后作为水相,搅拌下滴入蓖麻油中,制 得初乳。超声匀化后,用一定温度的蓖麻油固化,冷却,乙醚洗涤。
2.2 因素和水平的确定
在一定范围内对固化温度、固化时间、搅拌速度、油/水体积比各取4个水平进行筛选(见表1 ),按正交设计表L16(45)进行实验。
表1 正交设计因素、水平表 因素
水平
1
2
, http://www.100md.com
3
5
A.固化温度/℃
135
150
160
175
B.固化时间/min
20
15
10
5
C.搅拌速度/rpm
, 百拇医药
4000
3000
2000
1000
D.V/O体积比
0.5∶100
1∶100
1.5∶100
2∶100
2.3 优化指标的选取
参照文献[5]介绍的统计方法,以粒径<1 μm的粒子分布百分数、微球的载药量(Drug loading,DL)、药物包封率(Drug trapping eff iciency,DTE)为指标,对微球制备工艺进行综合考察。其处理公式为:
, 百拇医药
式中Yi为三项指标的实验测得值;Ymax、Ymin为可接受的Yi的最大值、最小 值,可根据预试验结果或经验设定;di为单个指标的优化指数,当Yimin,di计 作0,Yi>Ymax,di计作1;DF为三项指标的总优化指数。由每次实验测得的Yi及 设定的Ymax、Ymin可计算出di,进而求得DF。三项指标可接受的最大、最小 值见表2。
表2 三项指标可接受的最大、最小值 指标
Ymax
Ymin
, 百拇医药
粒子分布的百分数/%，d<1μm
95
30
微球载药量/%,W/W
10
2.0
药物包封率/%
100
30
2.4 优化指标的测定
2.4.1 粒子(d<1μm)分布百分数 Fu-BM分散于CHCl3,滴于载玻片上,盖上盖玻片后,进行光学显微观察,选择有代表性的区域,测定200个粒子,计算粒径<1μm的粒子分 布百分数。
, http://www.100md.com
2.4.2 载药量、包封率的测定 Fu-BM经碱水解后,于265n m处测定测定吸光度,标准曲线法定量,计算载药量(DL)和包封率(DTE)。
3 实验结果
按正交设计表L16(45)进行实验, 测定各优化指标,计算总优化指数DF,结果见表3,方差分析结果见表4。
表3 正交设计L16(45)实验安排 实验号
因素
DF
A
B
C
, http://www.100md.com
D
E
1
1
1
1
1
1
0.2117
2
1
2
2
2
, 百拇医药
2
0.1586
3
1
3
3
3
3
0.1434
4
1
4
4
4
, 百拇医药
4
0.0215
5
2
1
2
3
4
0.2820
6
2
2
1
4
, 百拇医药
3
0.2069
7
2
3
4
1
2
0.3358
8
2
4
3
2
, 百拇医药
1
0.2313
9
3
1
3
4
2
0.3500
10
3
2
4
3
, http://www.100md.com
1
0.2727
11
3
3
1
2
4
0.7432
12
3
4
2
1
, http://www.100md.com
3
0.6341
13
4
1
4
2
3
0.2549
14
4
2
3
1
, 百拇医药
4
0.1076
15
4
3
2
4
1
0.4745
16
4
4
1
3
, 百拇医药
2
0.5083
X1
0.5352
1.0986
1.6701
1.2892
X2
1.0560
0.7458
1.5492
1.3880
, http://www.100md.com
X3
2.0000
1.6969
0.8383
1.2064
X4
1.3453
1.3952
0.8849
1.0529
极差
1.4648
, 百拇医药
0.9511
0.8378
0.3351
表4 方差分析结果 差异来源
差方和
自由度
均方
F值
P*
A
0.2798
3
0.0933
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49.10
<0.01
B
0.1242
3
0.0414
21.79
<0.05
C
0.1432
3
0.0477
25.10
, 百拇医药
<0.05
D
0.0150
3
0.0050
2.63
>0.05
e
0.0056
3
0.0019
注：*F0.05(3,3)=9.28，F0.01(3,3)=29.46
, 百拇医药
由表3、表4可见, 在考察的四个因素中,固化温度影响最大(P<0.01),其次是搅拌速度和固化时间(P <0.05),油/水体积比则几乎没有影响(P>0.05)。Fu-BM制备工艺的最佳水平组合 为:A3B3C1D2。具体方法是:取1ml配成一定浓度的5-Fu溶液溶解牛血清白蛋白250m g后,搅拌下(4000rpm)滴入100ml的蓖麻油中,加完后,继续搅拌5min,超声均化10min,得初乳 。另取蓖麻油100ml,加热至165℃,搅拌下(2000rpm)将初乳加入,恒温固化10min。冰水浴搅 拌冷却,加入乙醚,搅拌,离心,倾去上层油醚液, 挥尽乙醚,得Fu-BM。
依此工艺制得的Fu-BM扫描电镜观测呈规则球形,粒径范围为0.15～0.98μm,跨距为0.65,平均粒径0.56μm。载药量、包封率分别为6.13%、90.38%。(详细研究另文发表)
4 讨 论
, http://www.100md.com
影响微球制备的因素多,筛选工作费时费力, 而且工艺的重现性较差。通过巧妙的实验设计优化制备工艺,可以达到经济、高效的目的 [6，7]。已报道的实验设计方法有序贯设计、正交设计、因子设计、均匀设计等,但 多数仅以单一指标进行优化,这使得到的各因素水平的组合有可能不是最佳制备条件。粒径 分布、载药量、包封率为评价微球质量的三个重要指标[8], 我们以此为依据,设立 了总的优化指数, 通过正交设计,优选出氟尿嘧啶白蛋白微球的制备工艺。在优化的条件下 制备了3批微球样品,结果表明:微球制备工艺稳定,重现性良好。
江苏省科委社会发展基金资助项目(BS98391)、镇江医学院博士基金资助项目(9939)
参考文献
1，Muller BG,Leuenberger H,Kissel T.Albumin nanosphe res as carriers for passive drug targeting:an optimized manufacturing technigue. Pharm Res,1996,13(1)∶32.
, 百拇医药
2，He Lin,Chen Guo-qiang,Lu Ying-jie,et al.Preparation of bovine serum albumin microspheres by an acetone-ethanol hea t denaturation method.J Clin Pharm Sci,1997,6(2)∶82.
3，Chen GQ,Lin W,Coombes AGA,et al.Prepa ration of human serum albumin microspheres by a noval acetone-heat denaturation method.J Microencapsulation,1994,11(4)∶395.
4，程宇慧.廖工铁.侯世祥,等.白蛋白微球作为肝靶向给药 载体的研究.药学学报,1993,28(1)∶68.
5，Wang YM,Sato H,Adachi I,et al.Optimiz ation of the formulation design of chitosan microspheres containing cisplatin.J Pharm Sci,1996,85(11)∶1204.
6，相秉仁编著,安登魁审阅.计算药学.中国医药科技出版社 ,1990.
7，徐希明,张钧寿.微球给药系统的工艺优化研究.中国现代 应用药学杂志,1999,16(3)∶1.
8，中国药典2000年版二部.凡例与附录(草案).1998.
收稿日期：1999-08-19, http://www.100md.com
单位：余江南(镇江医学院药学系 镇江 212001)；徐希明 张钧寿(中国药科大学药剂教研室 南京 210009)
关键词：氟尿嘧啶；白蛋白微球；正交设计
中国现代应用药学000611 摘要 目的：制备具有肝靶向意义的氟尿嘧啶白蛋白微球。 方法：采用乳化热固化技术制备氟尿嘧啶白蛋白微球。以粒子(粒径<1μm)分布百 分数、载药量、包封率为指标,设立总的优化指数,选择固化温度、固化时间、搅拌速度、油 /水体积比为因素,每个因素各取4个水平,按L16(45)正交设计优化制备工艺。结果：四个因素中,固化温度对总优化指数影响最大(P<0.0 1),其次是固化时间、搅拌速度(P<0.05), 而油/水体积比则几乎没有影 响(P>0.05)。经过优选制得的Fu-BM, 扫描电镜观察呈规则球形。粒径 范围为0.15～0.98μm,跨距为0.65,平均粒径0.56μm。载药量、包封率分别为6.13%、90.38 %。结论：本法工艺简便、稳定，具有应用前景。
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Preparation of fluorouracil albumin microspheres
Xu Ximing(Xu XM),Yu Jiangnan(Yu JN),Zhang Junshou(Zhang JS)
(Department of Pharmaceutics,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)
ABSTRACT OBJECTIVE：To preparare fluorouracil albumin microspheres for liver targeting.METHOD:Fluorouracil bovine s erum albumin microspheres(Fu-BM) were prepared by emulsion-heat stabilization technique.Four factors,including stabilization temperature,stabilization time,st irring rate,and W/O volume ratio,and four levels for each factor that may affect the formulation of microspheres were selected and arranged in an L16(54 ) orthogonal experimental table.The desirability funtion(DF),calculated accordin g to the size(<0.1μm) distribution,drug loading and drug trapping efficiency,w as introduced as a total index for the microspheres formulation.RESULTS:The four factors affect DF differently.Stabilization temperature behaves as the maximum(P<0.01),followed stirring rate and stabilization ti me(P<0.05).However,the W/O volume ratio dose not influence DF( P>0.05).Scanning electron micrographs show that Fu-BM are sphe rical.The diameter of Fu-BM ranges from 0.15～0.98μm.Span is 0.65.The average diameter is 0.56μm.The drug loading and drug trapping efficiency of Fu-BM are 6.13% and 90.38% respectively.CONCLUSION:The preparation procedure i s good,simple,and reproducible.
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KEY WORDS fluorouracil,albumin mic rospheres,orthogonal experimental design
白蛋白依据来源的不同,可分为人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA),因其具有性质 稳定、无毒、可生物降解等优点而成为人们研究得最多的一种载体材料。白蛋白微球的制备 一般分两步,首先是乳化,形成W/O体系,然后固化,固化方法有两种:一是热固化,通过加热(≥ 100℃)使乳滴固化,二是化学交联,用适当的交联剂, 如甲醛、戊二醛,使蛋白变性[1] 。热固化法不适于热不稳定药物。水相中加有丙酮、乙醇可在较低的温度(70～75℃)实现 乳滴的固化[2～3]。国内对于白蛋白微球制备与临床应用,多为粒径较大的微球,以 往多用于栓塞,现多用于药物的肺部靶向。1993年,程宇慧等[4]率先在国内对白蛋 白微球作为肝靶向给药载体进行了研究,展示了诱人的应用前景。我们以氟尿嘧啶为模型药, 采用乳化热固化技术,制备了注射用氟尿嘧啶白蛋白微球(Fu-BM)。为克服以往单一指标优 化不全面性的缺点, 以粒子(粒径<1μm)分布百分数、载药量、包封率为指标,设立总优化 指数,正交设计优化制备工艺。
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1 实验材料
1.1 药品与试剂
5-氟尿嘧啶(5-Fu)(南通制药厂,批号:970405);牛血清白蛋白 (上海生化试剂厂,进口分装,MW=68000,批号:970324);蓖麻油(化学纯,上海光海化学试剂厂, 批号:961221);其余试剂为分析纯。
1.2 仪器设备
JJ-2增力电动搅拌器(江苏金坛医疗仪器厂);H66025超声清洗机(无锡超声电子设备厂);DL -5大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);SHZ-82水浴恒温振荡器(江苏金坛医疗仪器厂);75 6MC型紫外可见分光光度计(上海分析仪器总厂);Olympus显微镜(日本);SX-40扫描电子显微 镜(日本)。
2 实验方法
, 百拇医药
2.1 氟尿嘧啶白蛋白微球的制备
根据文献资料总结及预试验,确定Fu-BM的基本 工艺为:称取一定量BSA置氟尿嘧啶溶液中,溶解、混匀后作为水相,搅拌下滴入蓖麻油中,制 得初乳。超声匀化后,用一定温度的蓖麻油固化,冷却,乙醚洗涤。
2.2 因素和水平的确定
在一定范围内对固化温度、固化时间、搅拌速度、油/水体积比各取4个水平进行筛选(见表1 ),按正交设计表L16(45)进行实验。
表1 正交设计因素、水平表 因素
水平
1
2
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3
5
A.固化温度/℃
135
150
160
175
B.固化时间/min
20
15
10
5
C.搅拌速度/rpm
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4000
3000
2000
1000
D.V/O体积比
0.5∶100
1∶100
1.5∶100
2∶100
2.3 优化指标的选取
参照文献[5]介绍的统计方法,以粒径<1 μm的粒子分布百分数、微球的载药量(Drug loading,DL)、药物包封率(Drug trapping eff iciency,DTE)为指标,对微球制备工艺进行综合考察。其处理公式为:
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式中Yi为三项指标的实验测得值;Ymax、Ymin为可接受的Yi的最大值、最小 值,可根据预试验结果或经验设定;di为单个指标的优化指数,当Yi
表2 三项指标可接受的最大、最小值 指标
Ymax
Ymin
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粒子分布的百分数/%，d<1μm
95
30
微球载药量/%,W/W
10
2.0
药物包封率/%
100
30
2.4 优化指标的测定
2.4.1 粒子(d<1μm)分布百分数 Fu-BM分散于CHCl3,滴于载玻片上,盖上盖玻片后,进行光学显微观察,选择有代表性的区域,测定200个粒子,计算粒径<1μm的粒子分 布百分数。
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2.4.2 载药量、包封率的测定 Fu-BM经碱水解后,于265n m处测定测定吸光度,标准曲线法定量,计算载药量(DL)和包封率(DTE)。
3 实验结果
按正交设计表L16(45)进行实验, 测定各优化指标,计算总优化指数DF,结果见表3,方差分析结果见表4。
表3 正交设计L16(45)实验安排 实验号
因素
DF
A
B
C
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E
1
1
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0.2117
2
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0.1586
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4
1
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15
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0.4745
16
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4
1
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, 百拇医药
2
0.5083
X1
0.5352
1.0986
1.6701
1.2892
X2
1.0560
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X3
2.0000
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X4
1.3453
1.3952
0.8849
1.0529
极差
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0.9511
0.8378
0.3351
表4 方差分析结果 差异来源
差方和
自由度
均方
F值
P*
A
0.2798
3
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49.10
<0.01
B
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C
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3
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<0.05
D
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3
0.0050
2.63
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e
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3
0.0019
注：*F0.05(3,3)=9.28，F0.01(3,3)=29.46
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由表3、表4可见, 在考察的四个因素中,固化温度影响最大(P<0.01),其次是搅拌速度和固化时间(P <0.05),油/水体积比则几乎没有影响(P>0.05)。Fu-BM制备工艺的最佳水平组合 为:A3B3C1D2。具体方法是:取1ml配成一定浓度的5-Fu溶液溶解牛血清白蛋白250m g后,搅拌下(4000rpm)滴入100ml的蓖麻油中,加完后,继续搅拌5min,超声均化10min,得初乳 。另取蓖麻油100ml,加热至165℃,搅拌下(2000rpm)将初乳加入,恒温固化10min。冰水浴搅 拌冷却,加入乙醚,搅拌,离心,倾去上层油醚液, 挥尽乙醚,得Fu-BM。
依此工艺制得的Fu-BM扫描电镜观测呈规则球形,粒径范围为0.15～0.98μm,跨距为0.65,平均粒径0.56μm。载药量、包封率分别为6.13%、90.38%。(详细研究另文发表)
4 讨 论
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影响微球制备的因素多,筛选工作费时费力, 而且工艺的重现性较差。通过巧妙的实验设计优化制备工艺,可以达到经济、高效的目的 [6，7]。已报道的实验设计方法有序贯设计、正交设计、因子设计、均匀设计等,但 多数仅以单一指标进行优化,这使得到的各因素水平的组合有可能不是最佳制备条件。粒径 分布、载药量、包封率为评价微球质量的三个重要指标[8], 我们以此为依据,设立 了总的优化指数, 通过正交设计,优选出氟尿嘧啶白蛋白微球的制备工艺。在优化的条件下 制备了3批微球样品,结果表明:微球制备工艺稳定,重现性良好。
江苏省科委社会发展基金资助项目(BS98391)、镇江医学院博士基金资助项目(9939)
参考文献
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收稿日期：1999-08-19, http://www.100md.com