血管生成抑制素的功能结构域K1-3的融合表达与抗体制备
李福洋 刘新平 苏成芝 张英起 樊代明 杨静华 药立波
摘 要 目的： 重组表达angiostatin的功能结构域K1-3，并制备抗体，为其作用机理研究打下基础. 方法： 设计引物，通过PCR以人纤溶酶原cDNA为模板扩增出K1-3基因片段，克隆至pGEX-4T-1融合表达载体，IPTG诱导，挑出表达克隆，切下基因片段，克隆至pUC19进行序列测定，保留序列完全正确的克隆并进行诱导表达；从SDS-PAGE上切下表达的蛋白条带作为抗原免疫家兔，制备多克隆抗体, 并以Western blotting检测抗血清的结合特异性. 结果： DNA电泳结果显示PCR扩增出约780 bp的片段，序列测定表明为K1-3； K1-3可以与GST融合表达，产物存在于包含体中；抗血清与K1-3及煮沸变性的天然angiostatin特异地结合. 结论： 经PCR扩增并克隆到序列正确的K1-3片段，而且能够以融合形式表达，用其免疫家兔获得特异性抗体.
关键词：重组融合蛋白质类 血管生成 抑制素
, 百拇医药
0 引言
新生血管生成抑制因子的研究是抗肿瘤研究的一个热点. angiostatin是特异的新生血管形成抑制因子，由纤维蛋白酶原内部的4个同源性很高的环状赖氨酸结合结构域Kringle1-4 (K1-4)组成[1]， 目前认为angiostatin是由纤溶酶原经体内特定的蛋白酶系水解而来. angiostatin无论在体内还是体外都显示出强而特异的新生血管形成作用，在抗实体肿瘤转移的治疗中显示出良好的应用前景，但其作用机理目前尚不清楚. 我们融合表达了K1-3片段，并制备了多克隆抗体，为其应用研究和作用机理研究打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料 人纤溶酶原cDNA由本校生物技术中心提供， pGEX-4T-1， pUC19载体及菌种均由本教研室保存. PCR引物由西安美联生物技术有限公司合成；Taq， dNTP， HRP标记驴抗兔系Promega公司产品，各种限制酶klenow酶及化学发光试剂盒均系宝灵曼产品，IPTG， 谷胱甘肽Argrose，福氏佐剂为Gibicol产品. 新西兰雄性大白兔由本校实验动物中心提供.
, 百拇医药
1.2 引物设计 利用计算机软件OLIGON和PCGENE进行辅助分析，分别设计出扩增K1-3的引物：
5′ primer： 5′-CGAATTCATGTATCTCTCAGAG-
TGCAAG-3′
3′ primer： 5′-CGGGATCCTCATTGTTCCGTGG-
ATACTGGGGA-3′
1.3 扩增反应、 产物的克隆与测序 变性温度：95℃，退火温度60℃，延伸时间90 s, 循环次数为35. 将PCR扩增产物回收，将K1-3以klenow酶补平，然后用EcoR I酶切，从EcoR I-Sma I位点连入pGEX-4T-1载体(命名为pGST-K1-3)，转化DH5α感受态细胞，随机挑取多个克隆，37℃培养6 h， 0.4 mmol/L IPTG诱导3 h，收集细菌，进行十二磺基烷酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，挑出表达克隆，同时提取质粒，进行酶切鉴定，挑出含有能表达的K1-3片段的克隆，切下K1-3，克隆至pUC19，进行序列测定.
, 百拇医药
1.4 K1-3的融合表达 pGST-K1-3转入DH5α菌株，铺板培养，随机挑取2个～3个新鲜菌落，于细菌培养液(LB)中37℃摇床培养6 h， 0.4 mmol/L IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE分析.
1.5 抗原的制备与免疫 收集50 mL诱导表达5 h的细菌，超声破菌，初步纯化包涵体，再以 SDS-PAGE进一步分离纯化，从凝胶上切下相应的单一条带，磨碎，加完全福氏佐剂，混匀，免疫方法参照文献[2].
1.6 Western blotting 方法参照文献[2]. 抗血清使用前加适量注射用结核菌素做中和反应，应用液作1∶100稀释. 显影采用化学发光法(ECL发光试剂盒).
2 结果
2.1 PCR扩增结果 PCR反应扩增出约780 bp片段(Fig 1)；将产物直接连入载体后诱导，SDS-PAGE蛋白电泳和质粒酶切分析显示部分带有PCR产物的重组体可表达出分子质量约为60 ku的蛋白(Fig 2)， 从中挑取一个克隆，将插段重新克隆到pUC-19载体进行测序. 表达重组体pGEX-4T-K1-3都可以EcoR I-BamH I切下约780 bp的片段(Fig 3)； pUC-19-K1-3以EcoR I-BamH I切下780 bp的片段(Fig 1).
, 百拇医药
图1 PCR产物和pUC-K1-3重组体酶切分析电泳图谱
Fig 1 Products of PCR restriction enzyme analysis of pUC-K1-3
Lane 1: Amplified K1-3 fragment by PCR； Lane 2: λDNA/HindⅢ-EcoR I；Lane 3: pUC19-K1-3/EcoR I-BamH I.
图2 SDS-PAGE分析含有PCR扩增产物重组体的蛋白表达
Fig 2 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinants containing PCR products
Lane 1: Protein marker； Lane 2～7: Expression protein of different clone induced by IPTG.
, 百拇医药
图3 表达重组体PGEX-K1-3的酶切分析
Fig 3 Restriction enzyme analysis of clones expressing protein with molecular mass 60 ku
Lane 1: λDNA/HindⅢ-EcoR I； Lane 2～6: Recombinant plasmid/EcoR I-BamH I.
2.2 K1-3的序列测定结果 如Fig 4， 所扩增并克隆的784 bp片段系K1-3，序列完全正确.
图4 K1-3基因的序列及其对应的氨基酸序列
Fig 4 The sequence of amplified K1-3
, 百拇医药
The underlined sequence are primers, the boxed are artificail initial code and terminal code, the shaded are kringle1, 2 and 3 domain respectively.
2.3 GST-K1-3的表达 IPTG诱导后含有重组表达载体的菌体表达出分子质量约为60 ku的蛋白GST-K1-3，该蛋白以不溶性包涵体形式存在，在裂解上清中未见其表达成分(Fig 5). 表达产率约占菌体总蛋白250 g/kg.
图5 GST-K1-3表达的SDS-PAGE分析
Fig 5 SDS-PAGE analysis of the expression of GST-K1-3
Lane 1: Protein marker； Lane 2, 3, 4: Control； Lane 5: Expressed GST-K1-3; Lane 6: Suspension of lysis extract; Lane 7: GST-K1-3 in insoluble pellet.
, 百拇医药
2.4 Western blotting 结果显示免疫家兔制备的抗血清能与GST-K1-3重组蛋白特异性结合(Fig 6).
图6 Western blotting分析抗血清对GST-K1-3的特异识别
Fig 6 Western blotting assay of the recognition of anti-serum to GST-K1-3
A: SDS-PAGE of total protein. B: Western signal accordiing to GST-K1-3.
3 讨论
Angiostatin是新生血管内皮细胞特异性的新生血管形成抑制因子，由纤溶酶原内部的4个Kringle结构(K1-4)组成， Cao等[3]研究发现体外弹性蛋白酶有限水解纤溶酶原产生的K1-3活性比K1-4强. 我们采用PCR以人纤溶酶原cDNA为模板扩增得到K1-3，并将PCR产物直接克隆至pGEX-4T-1融合表达载体，IPTG诱导表达，挑出表达重组体，再做酶切鉴定，并将切下片段重新克隆至pUC19，进行序列测定，验证该扩增并克隆的片段系K1-3，而且序列完全正确. 本方法可避免常规先克隆测序后表达这一路线可能出现的额外工作量，例如PCR引起的无义突变或者是造成蛋白不表达的突变等，因而可缩短实验周期. 另外此策略可以通过高突变PCR用来筛选高表达或其它所需要的突变株.
, http://www.100md.com
K1-3可与GST融合表达，表达产物为包涵体. 我们同时也做了K1-3的非融合表达,其单独表达效率很低,但为可溶性表达. 目前我们尚在多方尝试以提高其表达水平. 以变性的GST-K1-3为抗原免疫家兔获得的抗血清特异性识别GST-K1-3和经煮沸变性的天然来源的K1-3，但不能识别天然未变性的K1-3.
关于angiostatin的作用机理，目前认为其主要通过特异地抑制新生血管内皮细胞的增殖和迁移阻断新生血管的形成，但是有关angiostatin如何对内皮细胞产生作用的机理尚十分不清楚. 最近的研究[4]又发现angistatin对缺乏生长因子刺激的内皮细胞有促凋亡作用，然而却找不到它与生长因子间直接相互作用的任何线索，推测它可能有其独特的信号传导途径. 寻找angiostatin在内皮细胞上的靶位点(受体)或相互作用分子，对阐明其作用机理以及对筛选新的特异性抗新生血管形成药物有着十分重要的意义. K1-3的克隆、表达以及抗体的制备为进一步的研究打下基础.
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学杰出人才基金资助课题 No. 39625023
作者简介：李福洋， 男， 1969-01-04生，江苏省徐州市人. 1997年获得生物化学与分子生物学专业硕士学位，现攻读该专业博士学位. 发表文章4篇. 导师药立波. 电话：(029)3374516-11
作者单位：李福洋 刘新平 苏成芝 药立波 第四军医大学：1基础部生物化学与分子生物学教研室
张英起 科研处生物技术中心
樊代明 杨静华 西京医院消化内科研究所，陕西 西安 710033
参考文献
1 O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell， 1994;79(2):315-328
, http://www.100md.com
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press USA, 1989:855,888
3 Cao Yihai, Ji RW, David D et al. Kringle of human angiostatin: characterization of the anti-proliferative activity on endothelial cells. J Biol Chem, 1996;271(46):29461-29467
4 Lena CW, Welsh II, Ito M. Angiostatin induces endothelial cell apoptosis and activation of focal adhesion kinase independently of the integrin-binding motif RGD. Pro Nat Acad Sci USA, 1998；95(10):5579-5583, 百拇医药
摘 要 目的： 重组表达angiostatin的功能结构域K1-3，并制备抗体，为其作用机理研究打下基础. 方法： 设计引物，通过PCR以人纤溶酶原cDNA为模板扩增出K1-3基因片段，克隆至pGEX-4T-1融合表达载体，IPTG诱导，挑出表达克隆，切下基因片段，克隆至pUC19进行序列测定，保留序列完全正确的克隆并进行诱导表达；从SDS-PAGE上切下表达的蛋白条带作为抗原免疫家兔，制备多克隆抗体, 并以Western blotting检测抗血清的结合特异性. 结果： DNA电泳结果显示PCR扩增出约780 bp的片段，序列测定表明为K1-3； K1-3可以与GST融合表达，产物存在于包含体中；抗血清与K1-3及煮沸变性的天然angiostatin特异地结合. 结论： 经PCR扩增并克隆到序列正确的K1-3片段，而且能够以融合形式表达，用其免疫家兔获得特异性抗体.
关键词：重组融合蛋白质类 血管生成 抑制素
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0 引言
新生血管生成抑制因子的研究是抗肿瘤研究的一个热点. angiostatin是特异的新生血管形成抑制因子，由纤维蛋白酶原内部的4个同源性很高的环状赖氨酸结合结构域Kringle1-4 (K1-4)组成[1]， 目前认为angiostatin是由纤溶酶原经体内特定的蛋白酶系水解而来. angiostatin无论在体内还是体外都显示出强而特异的新生血管形成作用，在抗实体肿瘤转移的治疗中显示出良好的应用前景，但其作用机理目前尚不清楚. 我们融合表达了K1-3片段，并制备了多克隆抗体，为其应用研究和作用机理研究打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料 人纤溶酶原cDNA由本校生物技术中心提供， pGEX-4T-1， pUC19载体及菌种均由本教研室保存. PCR引物由西安美联生物技术有限公司合成；Taq， dNTP， HRP标记驴抗兔系Promega公司产品，各种限制酶klenow酶及化学发光试剂盒均系宝灵曼产品，IPTG， 谷胱甘肽Argrose，福氏佐剂为Gibicol产品. 新西兰雄性大白兔由本校实验动物中心提供.
, 百拇医药
1.2 引物设计 利用计算机软件OLIGON和PCGENE进行辅助分析，分别设计出扩增K1-3的引物：
5′ primer： 5′-CGAATTCATGTATCTCTCAGAG-
TGCAAG-3′
3′ primer： 5′-CGGGATCCTCATTGTTCCGTGG-
ATACTGGGGA-3′
1.3 扩增反应、 产物的克隆与测序 变性温度：95℃，退火温度60℃，延伸时间90 s, 循环次数为35. 将PCR扩增产物回收，将K1-3以klenow酶补平，然后用EcoR I酶切，从EcoR I-Sma I位点连入pGEX-4T-1载体(命名为pGST-K1-3)，转化DH5α感受态细胞，随机挑取多个克隆，37℃培养6 h， 0.4 mmol/L IPTG诱导3 h，收集细菌，进行十二磺基烷酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，挑出表达克隆，同时提取质粒，进行酶切鉴定，挑出含有能表达的K1-3片段的克隆，切下K1-3，克隆至pUC19，进行序列测定.
, 百拇医药
1.4 K1-3的融合表达 pGST-K1-3转入DH5α菌株，铺板培养，随机挑取2个～3个新鲜菌落，于细菌培养液(LB)中37℃摇床培养6 h， 0.4 mmol/L IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE分析.
1.5 抗原的制备与免疫 收集50 mL诱导表达5 h的细菌，超声破菌，初步纯化包涵体，再以 SDS-PAGE进一步分离纯化，从凝胶上切下相应的单一条带，磨碎，加完全福氏佐剂，混匀，免疫方法参照文献[2].
1.6 Western blotting 方法参照文献[2]. 抗血清使用前加适量注射用结核菌素做中和反应，应用液作1∶100稀释. 显影采用化学发光法(ECL发光试剂盒).
2 结果
2.1 PCR扩增结果 PCR反应扩增出约780 bp片段(Fig 1)；将产物直接连入载体后诱导，SDS-PAGE蛋白电泳和质粒酶切分析显示部分带有PCR产物的重组体可表达出分子质量约为60 ku的蛋白(Fig 2)， 从中挑取一个克隆，将插段重新克隆到pUC-19载体进行测序. 表达重组体pGEX-4T-K1-3都可以EcoR I-BamH I切下约780 bp的片段(Fig 3)； pUC-19-K1-3以EcoR I-BamH I切下780 bp的片段(Fig 1).
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图1 PCR产物和pUC-K1-3重组体酶切分析电泳图谱
Fig 1 Products of PCR restriction enzyme analysis of pUC-K1-3
Lane 1: Amplified K1-3 fragment by PCR； Lane 2: λDNA/HindⅢ-EcoR I；Lane 3: pUC19-K1-3/EcoR I-BamH I.
图2 SDS-PAGE分析含有PCR扩增产物重组体的蛋白表达
Fig 2 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinants containing PCR products
Lane 1: Protein marker； Lane 2～7: Expression protein of different clone induced by IPTG.
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图3 表达重组体PGEX-K1-3的酶切分析
Fig 3 Restriction enzyme analysis of clones expressing protein with molecular mass 60 ku
Lane 1: λDNA/HindⅢ-EcoR I； Lane 2～6: Recombinant plasmid/EcoR I-BamH I.
2.2 K1-3的序列测定结果 如Fig 4， 所扩增并克隆的784 bp片段系K1-3，序列完全正确.
图4 K1-3基因的序列及其对应的氨基酸序列
Fig 4 The sequence of amplified K1-3
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The underlined sequence are primers, the boxed are artificail initial code and terminal code, the shaded are kringle1, 2 and 3 domain respectively.
2.3 GST-K1-3的表达 IPTG诱导后含有重组表达载体的菌体表达出分子质量约为60 ku的蛋白GST-K1-3，该蛋白以不溶性包涵体形式存在，在裂解上清中未见其表达成分(Fig 5). 表达产率约占菌体总蛋白250 g/kg.
图5 GST-K1-3表达的SDS-PAGE分析
Fig 5 SDS-PAGE analysis of the expression of GST-K1-3
Lane 1: Protein marker； Lane 2, 3, 4: Control； Lane 5: Expressed GST-K1-3; Lane 6: Suspension of lysis extract; Lane 7: GST-K1-3 in insoluble pellet.
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2.4 Western blotting 结果显示免疫家兔制备的抗血清能与GST-K1-3重组蛋白特异性结合(Fig 6).
图6 Western blotting分析抗血清对GST-K1-3的特异识别
Fig 6 Western blotting assay of the recognition of anti-serum to GST-K1-3
A: SDS-PAGE of total protein. B: Western signal accordiing to GST-K1-3.
3 讨论
Angiostatin是新生血管内皮细胞特异性的新生血管形成抑制因子，由纤溶酶原内部的4个Kringle结构(K1-4)组成， Cao等[3]研究发现体外弹性蛋白酶有限水解纤溶酶原产生的K1-3活性比K1-4强. 我们采用PCR以人纤溶酶原cDNA为模板扩增得到K1-3，并将PCR产物直接克隆至pGEX-4T-1融合表达载体，IPTG诱导表达，挑出表达重组体，再做酶切鉴定，并将切下片段重新克隆至pUC19，进行序列测定，验证该扩增并克隆的片段系K1-3，而且序列完全正确. 本方法可避免常规先克隆测序后表达这一路线可能出现的额外工作量，例如PCR引起的无义突变或者是造成蛋白不表达的突变等，因而可缩短实验周期. 另外此策略可以通过高突变PCR用来筛选高表达或其它所需要的突变株.
, http://www.100md.com
K1-3可与GST融合表达，表达产物为包涵体. 我们同时也做了K1-3的非融合表达,其单独表达效率很低,但为可溶性表达. 目前我们尚在多方尝试以提高其表达水平. 以变性的GST-K1-3为抗原免疫家兔获得的抗血清特异性识别GST-K1-3和经煮沸变性的天然来源的K1-3，但不能识别天然未变性的K1-3.
关于angiostatin的作用机理，目前认为其主要通过特异地抑制新生血管内皮细胞的增殖和迁移阻断新生血管的形成，但是有关angiostatin如何对内皮细胞产生作用的机理尚十分不清楚. 最近的研究[4]又发现angistatin对缺乏生长因子刺激的内皮细胞有促凋亡作用，然而却找不到它与生长因子间直接相互作用的任何线索，推测它可能有其独特的信号传导途径. 寻找angiostatin在内皮细胞上的靶位点(受体)或相互作用分子，对阐明其作用机理以及对筛选新的特异性抗新生血管形成药物有着十分重要的意义. K1-3的克隆、表达以及抗体的制备为进一步的研究打下基础.
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基金项目：国家自然科学杰出人才基金资助课题 No. 39625023
作者简介：李福洋， 男， 1969-01-04生，江苏省徐州市人. 1997年获得生物化学与分子生物学专业硕士学位，现攻读该专业博士学位. 发表文章4篇. 导师药立波. 电话：(029)3374516-11
作者单位：李福洋 刘新平 苏成芝 药立波 第四军医大学：1基础部生物化学与分子生物学教研室
张英起 科研处生物技术中心
樊代明 杨静华 西京医院消化内科研究所，陕西 西安 710033
参考文献
1 O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell， 1994;79(2):315-328
, http://www.100md.com
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press USA, 1989:855,888
3 Cao Yihai, Ji RW, David D et al. Kringle of human angiostatin: characterization of the anti-proliferative activity on endothelial cells. J Biol Chem, 1996;271(46):29461-29467
4 Lena CW, Welsh II, Ito M. Angiostatin induces endothelial cell apoptosis and activation of focal adhesion kinase independently of the integrin-binding motif RGD. Pro Nat Acad Sci USA, 1998；95(10):5579-5583, 百拇医药