特异性血管生成抑制素的制备及其抑制血管生成作用
李福洋 何鹏 刘新平 张英起 杨静华 樊代明 药立波
摘 要 目的： 从血浆中纯化制备有特异抑制血管生成活性的天然angiostatin蛋白，为基础研究和应用研究打下基础. 方法： 制备L-lysine偶联的Sepharose 4B亲和层析柱，从血浆中纯化纤溶酶原，用弹性蛋白酶在体外进行有限消化，再以L-lysine Sepharose 4B亲和层析纯化获得天然angiostatin片段，通过体外血管内皮细胞生长抑制分析和体内鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验测定纯化蛋白的活性. 结果： 以L-lysine Sepharose 4B从血浆中纯化得到单一成分的纤溶酶原蛋白，弹性蛋白酶有限消化后进一步的亲和层析纯化得到angiostatin蛋白；该蛋白体外可抑制牛主动脉内皮细胞的生长，体内可抑制鸡胚尿囊膜血管生成. 结论： 该实验方法可纯化得到有活性的天然angiostatin蛋白.
关键词：血管生成 抑制物 蛋白纯化
, 百拇医药
0 引言
新生血管生成抑制因子的研究是抗肿瘤研究的一个热点. angiostatin是特异的新生血管生成抑制因子，由纤溶酶原(plasminogen)内部的4个同源性很高的环状赖氨酸结合结构域Kringle1-4(K1-4)组成，目前认为angiostatin是由纤溶酶原经体内特定的蛋白酶系水解而来. angiostatin无论在体内还是体外都显示出强而特异的新生血管生成抑制作用，在抗实体肿瘤转移的治疗中显示出良好的应用前景，因而研究从血清中制备天然angiostatin不仅为其基础和应用研究打下基础，同时也有一定的开发价值.
1 材料和方法
1.1 材料 人血浆由本校西京医院妇产科提供. L-盐酸赖氨酸由上海第二军医大学生产，弹性蛋白酶、胶原酶为Sigma公司产品，明胶、蛋白相对分子质量标准为华美公司产品，盐酸赖氨酸、6-氨基己酸由上海试剂厂生产，溴化氰活化的Sepharose 4B为Pharmacia公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，DMEM， bFGF为Gibco公司产品.
, 百拇医药
1.2 纤溶酶原的制备 制备L-lysine Sepharose 4B柱， 方法参照文献[1]. 将5 g溴化氰活化的Sepharose 4B浸于25 mL 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3 pH 8.9缓冲液中， 加入5 g L-盐酸赖氨酸，将pH调至8.9， 4℃搅拌24 h，填柱(2 cm)，以0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)平衡. 纯化纤溶酶原， 方法参照文献[2]. 将血浆或血清以蒸馏水作2倍体积稀释，以0.42 μm孔径的滤膜过滤，然后过L-lysine Sepharose 4B亲和层析柱，流速为40 mL/h；以5倍柱床体积的0.3 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤至A280 nm<0.005；以0.2 mol/L 6-氨基己酸(pH 7.4)洗脱，收集洗脱峰. 取5 μL样品进行十二磺基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，检查纯化效果. 将剩余样品定量. 以1 mol/L NaCl溶液对亲和柱进行再生，并以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)平衡柱床.
, 百拇医药
1.3 angiostatin的制备 采用弹性蛋白酶有限水解法，参照文献[3]. 20 mg纤溶酶原加0.5 mg弹性蛋白酶室温反应24 h, 加异丙氟磷终止反应. 取少量进行SDS-PAGE，其余在50 mmol/L磷酸缓冲液中4℃透析2×24 h，再以L-lysine Sepharose 4B作亲和层析纯化.
1.4 血管内皮细胞生长抑制实验 牛主动脉内皮细胞的分离与培养方法参照文献[4]. 细胞生长抑制分析参照文献[3]. 采用四唑氮蓝(MTT)还原法,细胞在含100 mL/L胎牛血清和3 μg/L bFGF的DMEM中，以 1×103个/孔将细胞接种于96孔板，37℃，50 mL/L CO2培养4 h，向培养液中加入经过过滤除菌的蛋白溶液，继续孵育72 h后每孔加100 μg MTT，温育4 h，甩去培养上清，加150 μL二甲基亚砜，混合仪振荡溶解10 min，酶联免疫检测仪检测吸光度A450 nm. 将处理组与对照组(只加同样体积0.2 mol/L 6-氨基己酸) A450 nm比较求得抑制率.
, 百拇医药
1.5 血管生成抑制活性分析 方法参照文献[5]. 将新鲜鸡胚于60%～70%湿度、37℃孵育5 d后，用什锦锉在锐、钝两端各锉个小洞，用细针扎破鸡胚外膜, 通过对钝端施加负压制作人造气室，在靠近鸡蛋钝端开个小窗，通过此人造气室将20 μg蛋白溶液经外膜注入膜下，继续孵育48 h后观察内膜(尿囊膜)上血管生成情况.
2 结果
2.1 人纤溶酶原的提取与纯化 利用L-lysine Sepharose 4B亲和层析获得纯化的纤溶酶原，亲和层析表现为单一锐利的洗脱峰，SDS-PAGE表现为单一的条带,相对分子质量为86 ku. 紫外分光定量结果表明产量可达到100 mg/L血浆(Fig 1).
图1 SDS-PAGE分析纯化的纤溶酶原
Fig 1 SDS-PAGE analysis of the purified plasminogen
, http://www.100md.com
1: Protein marker； 2～6: Purified plasminogen.
2.2 angiostatin的制备 电泳结果显示弹性蛋白酶有限消化后经亲和层析纯化可获得相对分子质量约为43 ku和35 ku 2个片段，与Cao等[3]报道结果一致，经定量推算血浆中产量可达到15 mg/L～20 mg/L(Fig 2).
图2 SDS-聚丙烯凝胶电泳分析纯化的angiostatin
Fig 2 SDS-PAGE analysis of the purified angiostatin
1: Protein marker; 2～3: Purified angiostatin fragments; 4: Fragments of proteolytic plasminogen by Elastase; 5: Purified plasminogen.
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2.3 血管内皮细胞生长抑制实验 用弹性蛋白酶制备的angiostatin抑制牛主动脉内皮细胞生长，且呈剂量依赖性，半数有效剂量(ED50)约为15 mg/L (Fig 3).
图3 angiostatin对牛主动脉内皮细胞的生长抑制作用
Fig 3 Inhibitory effect on angiostatin on BAE cell growth
Angiostatin inhibits the growth of BAE cell in a dose-dependent manner, every value in graph represent mean percentage of change in cell number ± standard error. n=6
2.4 鸡胚尿囊血管生成抑制分析 肉眼下观察即可见处理组血管密度较对照组明显稀少，而且血管的连续性差(Fig 4).
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图4 鸡胚尿囊膜血管生成抑制分析
Fig 4 Chicken allantois membrane (CAM) angiogenesis assay
A: Control; B: Treated with angiostatin.
3 讨论
在已经发现的新生血管生成抑制因子中，angiostatin作用强而特异，因此作为抗肿瘤药物有着广阔的临床应用前景. 基因工程是作为大量生产angiostatin的首选，但目前基因工程生产的angiostatin产量很低，成本也较高[6,7]，仍停留在仅供实验研究用的水平，远远不能满足实际应用需要，甚至对普通实验室的研究应用都十分受限制.
天然的angiostatin来源于血浆中的纤溶酶原，但具体的产生机理尚未研究清楚. Cao等[3]发现弹性蛋白酶水解纤溶酶原得到的K1-3和K1-4片段有较强的抑制血管内皮细胞增殖活性. 我们的实验根据纤溶酶原对L-型赖氨酸的特异性高亲和特性制备了L-型赖氨酸偶联Separose-4B亲和层析柱，利用亲和层析从人血浆中提取和纯化纤溶酶原，然后用弹性蛋白酶进行有限水解产生并纯化获得angiostatin; 体外和体内实验都表明所制备的片段有较强的血管生成抑制活性. 我们的实验方法比较简单、可行，可作为用于实验研究的小量制备的常规方法，同时也为实际应用性大量制备提供有价值的参考.
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基金项目：国家自然科学杰出人才基金资助项目 No. 39625023
作者简介：李福洋, 男, 1969-01-04生， 江苏省徐州市人， 汉族. 1997年生物化学与分子生物学硕士，现攻读该专业博士学位. 发表文章4篇. 导师药立波. 电话：(029)3374516-11
作者单位：李福洋 何鹏 刘新平 药立波 第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室 陕西 西安 710033
张英起 第四军医大学：科研处生物技术中心, 陕西 西安 710033
杨静华 樊代明 第四军医大学：西京医院消化内科研究所 陕西 西安 710033
参考文献
1 Jan-Chister J, Lars R. Protein purification-principles, high resolution methods and applications. New York: VCH Publisher Inc, 1989:275-330
, 百拇医药
2 Deutsch DG, Mertz ET. Plasminogen: Purification from human plasma. Science, 1979; 170(10):1095-1096
3 Cao YH, Ji RW, David D et al. Kringle of human angiostatin: characterization of the anti-proliferative activity on endothelial cells. J Biol Chem, 1996; 271(46):29461-29467
4 Folkman J. Long term culture of bovine capilary endothelial cell. Proc Natl Acad Sci USA, 1979; 76(10):5217-5221
5 Brook PC, Montgomery AM, Rosenfeld M et al. Antagonist of integrin ανβ3 disrupt angiogenesis. Cell, 1994; 79(4):1157-1164
6 Sim BKL, O'Reilly MS, Liang H et al. A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastic cancer. Cancer Res, 1997; 57(4):1329-1334
7 Wu ZG, O'Reilly MS, Folkman J et al. Suppression of tumor growth with recombinant murine angiostatin. Biochem Biophysi Commun，1997；236(2):651-654, http://www.100md.com
摘 要 目的： 从血浆中纯化制备有特异抑制血管生成活性的天然angiostatin蛋白，为基础研究和应用研究打下基础. 方法： 制备L-lysine偶联的Sepharose 4B亲和层析柱，从血浆中纯化纤溶酶原，用弹性蛋白酶在体外进行有限消化，再以L-lysine Sepharose 4B亲和层析纯化获得天然angiostatin片段，通过体外血管内皮细胞生长抑制分析和体内鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验测定纯化蛋白的活性. 结果： 以L-lysine Sepharose 4B从血浆中纯化得到单一成分的纤溶酶原蛋白，弹性蛋白酶有限消化后进一步的亲和层析纯化得到angiostatin蛋白；该蛋白体外可抑制牛主动脉内皮细胞的生长，体内可抑制鸡胚尿囊膜血管生成. 结论： 该实验方法可纯化得到有活性的天然angiostatin蛋白.
关键词：血管生成 抑制物 蛋白纯化
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0 引言
新生血管生成抑制因子的研究是抗肿瘤研究的一个热点. angiostatin是特异的新生血管生成抑制因子，由纤溶酶原(plasminogen)内部的4个同源性很高的环状赖氨酸结合结构域Kringle1-4(K1-4)组成，目前认为angiostatin是由纤溶酶原经体内特定的蛋白酶系水解而来. angiostatin无论在体内还是体外都显示出强而特异的新生血管生成抑制作用，在抗实体肿瘤转移的治疗中显示出良好的应用前景，因而研究从血清中制备天然angiostatin不仅为其基础和应用研究打下基础，同时也有一定的开发价值.
1 材料和方法
1.1 材料 人血浆由本校西京医院妇产科提供. L-盐酸赖氨酸由上海第二军医大学生产，弹性蛋白酶、胶原酶为Sigma公司产品，明胶、蛋白相对分子质量标准为华美公司产品，盐酸赖氨酸、6-氨基己酸由上海试剂厂生产，溴化氰活化的Sepharose 4B为Pharmacia公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品，DMEM， bFGF为Gibco公司产品.
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1.2 纤溶酶原的制备 制备L-lysine Sepharose 4B柱， 方法参照文献[1]. 将5 g溴化氰活化的Sepharose 4B浸于25 mL 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3 pH 8.9缓冲液中， 加入5 g L-盐酸赖氨酸，将pH调至8.9， 4℃搅拌24 h，填柱(2 cm)，以0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)平衡. 纯化纤溶酶原， 方法参照文献[2]. 将血浆或血清以蒸馏水作2倍体积稀释，以0.42 μm孔径的滤膜过滤，然后过L-lysine Sepharose 4B亲和层析柱，流速为40 mL/h；以5倍柱床体积的0.3 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤至A280 nm<0.005；以0.2 mol/L 6-氨基己酸(pH 7.4)洗脱，收集洗脱峰. 取5 μL样品进行十二磺基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，检查纯化效果. 将剩余样品定量. 以1 mol/L NaCl溶液对亲和柱进行再生，并以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)平衡柱床.
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1.3 angiostatin的制备 采用弹性蛋白酶有限水解法，参照文献[3]. 20 mg纤溶酶原加0.5 mg弹性蛋白酶室温反应24 h, 加异丙氟磷终止反应. 取少量进行SDS-PAGE，其余在50 mmol/L磷酸缓冲液中4℃透析2×24 h，再以L-lysine Sepharose 4B作亲和层析纯化.
1.4 血管内皮细胞生长抑制实验 牛主动脉内皮细胞的分离与培养方法参照文献[4]. 细胞生长抑制分析参照文献[3]. 采用四唑氮蓝(MTT)还原法,细胞在含100 mL/L胎牛血清和3 μg/L bFGF的DMEM中，以 1×103个/孔将细胞接种于96孔板，37℃，50 mL/L CO2培养4 h，向培养液中加入经过过滤除菌的蛋白溶液，继续孵育72 h后每孔加100 μg MTT，温育4 h，甩去培养上清，加150 μL二甲基亚砜，混合仪振荡溶解10 min，酶联免疫检测仪检测吸光度A450 nm. 将处理组与对照组(只加同样体积0.2 mol/L 6-氨基己酸) A450 nm比较求得抑制率.
, 百拇医药
1.5 血管生成抑制活性分析 方法参照文献[5]. 将新鲜鸡胚于60%～70%湿度、37℃孵育5 d后，用什锦锉在锐、钝两端各锉个小洞，用细针扎破鸡胚外膜, 通过对钝端施加负压制作人造气室，在靠近鸡蛋钝端开个小窗，通过此人造气室将20 μg蛋白溶液经外膜注入膜下，继续孵育48 h后观察内膜(尿囊膜)上血管生成情况.
2 结果
2.1 人纤溶酶原的提取与纯化 利用L-lysine Sepharose 4B亲和层析获得纯化的纤溶酶原，亲和层析表现为单一锐利的洗脱峰，SDS-PAGE表现为单一的条带,相对分子质量为86 ku. 紫外分光定量结果表明产量可达到100 mg/L血浆(Fig 1).
图1 SDS-PAGE分析纯化的纤溶酶原
Fig 1 SDS-PAGE analysis of the purified plasminogen
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1: Protein marker； 2～6: Purified plasminogen.
2.2 angiostatin的制备 电泳结果显示弹性蛋白酶有限消化后经亲和层析纯化可获得相对分子质量约为43 ku和35 ku 2个片段，与Cao等[3]报道结果一致，经定量推算血浆中产量可达到15 mg/L～20 mg/L(Fig 2).
图2 SDS-聚丙烯凝胶电泳分析纯化的angiostatin
Fig 2 SDS-PAGE analysis of the purified angiostatin
1: Protein marker; 2～3: Purified angiostatin fragments; 4: Fragments of proteolytic plasminogen by Elastase; 5: Purified plasminogen.
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2.3 血管内皮细胞生长抑制实验 用弹性蛋白酶制备的angiostatin抑制牛主动脉内皮细胞生长，且呈剂量依赖性，半数有效剂量(ED50)约为15 mg/L (Fig 3).
图3 angiostatin对牛主动脉内皮细胞的生长抑制作用
Fig 3 Inhibitory effect on angiostatin on BAE cell growth
Angiostatin inhibits the growth of BAE cell in a dose-dependent manner, every value in graph represent mean percentage of change in cell number ± standard error. n=6
2.4 鸡胚尿囊血管生成抑制分析 肉眼下观察即可见处理组血管密度较对照组明显稀少，而且血管的连续性差(Fig 4).
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图4 鸡胚尿囊膜血管生成抑制分析
Fig 4 Chicken allantois membrane (CAM) angiogenesis assay
A: Control; B: Treated with angiostatin.
3 讨论
在已经发现的新生血管生成抑制因子中，angiostatin作用强而特异，因此作为抗肿瘤药物有着广阔的临床应用前景. 基因工程是作为大量生产angiostatin的首选，但目前基因工程生产的angiostatin产量很低，成本也较高[6,7]，仍停留在仅供实验研究用的水平，远远不能满足实际应用需要，甚至对普通实验室的研究应用都十分受限制.
天然的angiostatin来源于血浆中的纤溶酶原，但具体的产生机理尚未研究清楚. Cao等[3]发现弹性蛋白酶水解纤溶酶原得到的K1-3和K1-4片段有较强的抑制血管内皮细胞增殖活性. 我们的实验根据纤溶酶原对L-型赖氨酸的特异性高亲和特性制备了L-型赖氨酸偶联Separose-4B亲和层析柱，利用亲和层析从人血浆中提取和纯化纤溶酶原，然后用弹性蛋白酶进行有限水解产生并纯化获得angiostatin; 体外和体内实验都表明所制备的片段有较强的血管生成抑制活性. 我们的实验方法比较简单、可行，可作为用于实验研究的小量制备的常规方法，同时也为实际应用性大量制备提供有价值的参考.
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基金项目：国家自然科学杰出人才基金资助项目 No. 39625023
作者简介：李福洋, 男, 1969-01-04生， 江苏省徐州市人， 汉族. 1997年生物化学与分子生物学硕士，现攻读该专业博士学位. 发表文章4篇. 导师药立波. 电话：(029)3374516-11
作者单位：李福洋 何鹏 刘新平 药立波 第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室 陕西 西安 710033
张英起 第四军医大学：科研处生物技术中心, 陕西 西安 710033
杨静华 樊代明 第四军医大学：西京医院消化内科研究所 陕西 西安 710033
参考文献
1 Jan-Chister J, Lars R. Protein purification-principles, high resolution methods and applications. New York: VCH Publisher Inc, 1989:275-330
, 百拇医药
2 Deutsch DG, Mertz ET. Plasminogen: Purification from human plasma. Science, 1979; 170(10):1095-1096
3 Cao YH, Ji RW, David D et al. Kringle of human angiostatin: characterization of the anti-proliferative activity on endothelial cells. J Biol Chem, 1996; 271(46):29461-29467
4 Folkman J. Long term culture of bovine capilary endothelial cell. Proc Natl Acad Sci USA, 1979; 76(10):5217-5221
5 Brook PC, Montgomery AM, Rosenfeld M et al. Antagonist of integrin ανβ3 disrupt angiogenesis. Cell, 1994; 79(4):1157-1164
6 Sim BKL, O'Reilly MS, Liang H et al. A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastic cancer. Cancer Res, 1997; 57(4):1329-1334
7 Wu ZG, O'Reilly MS, Folkman J et al. Suppression of tumor growth with recombinant murine angiostatin. Biochem Biophysi Commun，1997；236(2):651-654, http://www.100md.com