人类Cyr61基因的组织表达谱分析
作者：陈政 傅风云 毕安定 蒋滢 张宏来 蒋菊香
单位：傅风云(杭州市疾病预防保健门诊部检验室)；毕安定(复旦大学遗传所)；陈政 蒋菊香 张宏来 蒋滢(苏州医学院生化教研室，苏州，215007)
关键词：HumCyr61基因；变异剪接；Northern杂交；组织表达谱
苏州医学院学报000607 摘要 目的 预测HumCyr61基因的变异剪接转录本，并通过分析其在不同组织中的表达谱进行验证，以便初步探讨HumCyr61基因的功能。方法 应用计算机辅助的电子杂交步移策略，通过对比查询数据库返回的ESTs序列和先前克隆的HumCyr61 cDNA序列，预测了HumCyr61基因的变异剪接转录本。将HumCyr61基因片段制备探针后与含有人体8个组织mRNA的MTNI膜杂交，进行表达谱分析。结果 计算机预测HumCyr61基因存在3个潜在的变异剪接位点，暗示该基因可能具有3种不同的转录本。 Northern杂交结果显示，此基因在所检测的8种组织中除脑组织不表达外，其他7种组织中均存在一种大小基本一致的转录本，约2.4kb，该转录本在肾脏和骨骼肌中高度表达，在胎盘、心脏、肺脏中中度表达，在胰腺、肝脏中低度表达。杂交结果还显示，此基因在胰腺和胎盘组织中存在一种约3.5kb的条带，在骨骼肌中存在另一种约5.0kb的条带。结论 电子杂交步移预测及Northern杂交结果证实了HumCyr61基因变异剪接位点的存在。
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中图法分类号 R392.2
Studies on the Tissue Expression Pattern of HumCyr61
Chen Zheng, Fu Fengyun, Bi Anding, et al
(Department of Biochemistry,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To study the function of HumCyr61, three alternative splicing transcripts were speculated and confirmed afterwards.Methods With the help of computer, electronic hybridization walking strategy was used to speculate alternative splicing of HumCyr61 by comparison of the BLAST result obtained from dbEST and HumCyr61 cDNA sequence. Northern blotting was performed to hybridize α-32P-dATP labeled HumCyr61 cDNA partial sequence with mRNA of 8 different human tissues that had been transferred to the MTNI membrane.Results Northern hybridization showed that HumCyr61 was expressed as a～2.4kb transcript in almost all tissues tested except brain, among which high expression in kidney and skeletal muscle, medium expression in placenta, heart, lung, and low expression in pancreas and liver. Northern hybridization also showed that there were another transcript of～3.5kb in pancreas, placenta and transcript of～5.0kb in skeletal muscle. The result is consistent with the previous speculation obtained with computer.Conclusion There exist two potential transcripts except the cloned HumCyr61 cDNA.
, 百拇医药
Key words HumCyr61；alternative splicing;Northern hybridization;tissue expression pattern
横纹肌肉瘤是软组织中较常见的恶性肿瘤，合并有脑的发育异常。它包括胚胎性横纹肌肉瘤、腺泡型横纹肌肉瘤和多形性横纹肌肉瘤3种类型。其中，胚胎性横纹肌肉瘤常见于小儿，恶性度高。近年来，已克隆出许多与横纹肌肉瘤的发生有密切关系的基因片段，如胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-5)、金属蛋白酶3组织抑制因子(TIMP-3)、成骨细胞特异因子(OSF-2)[1]等。本室最近克隆了一个人类新基因HumCyr61，该基因包含的一个EST片段Z50168在胚胎性横纹肌肉瘤中呈下调表达[2]。研究[3]表明，鼠Cyr61基因与c-fos基因在G0/G1过渡期能共同被PDGF和FGF等生长因子激活表达；也有研究[4]表明，鼠Cyr61蛋白能分泌到细胞外，与细胞增殖和迁移、黏附有密切关系。因此，分析人类Cyr61基因在不同组织中的表达特征对探讨该基因的生物学功能具有重要意义。
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1 材料和方法
1.1 材料 含人体8种组织mRNA的MTNI膜购自CLONTECH公司，α-32P-dATP、dNTP和Megaprime RPN1605随机引物标记盒均购自Amersham公司, Sephadex G-50购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 电子杂交 利用美国国家生物信息中心(NCBI)的局部同源比较服务器(BLASTN)，将HumCyr61核酸序列筛选GenBank表达序列数据库dbEST，由此获得了一些同源度较高的EST序列，将两端的EST片段作为阳性克隆，分别向5’和3’端延伸，并以获得的新序列为探针重复筛选dbEST数据库，直至不能再延伸为止。拼接所有阳性克隆，获得统计一致序列。
1.2.2 杂交探针的标记及纯化 以本室分离的BA-1 cDNA片段[2]为模板，采用随机引物标记法标记探针，反应体系如下：DNA 30～50ng 和 随机引物5μl中加ddH2O至26μl，煮沸5min后稍离心，加入以下成份：10×反应液5μl，dCTP, dTTP, dGTP各4μl，α-32P-dATP 5μl，Klenow酶2μl(1unit/μl)，总体积共50μl，37℃ 温育30min。将新华滤纸剪成一长条形，在距一端约1cm 的中间位置点少量标记物后向下垂直浸入层析液(pH3.6，0.5mol/L磷酸缓冲液)1mm左右，进行自下而上的纸层析。待层析液前缘走出7～8cm后，用手提式盖革计数器检测探针标记率，达80%，其中，探针标记率 =(近原点处同位素最大放射量即cpm原点值/前沿cpm最大值+近原点处cpm最大值)×100%。再以TE作为洗脱液，Sephadex G-50柱层析纯化探针。
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1.2.3 用上述标记并纯化好的探针，杂交含人体8种组织mRNA的MTNI膜，杂交体系和杂交时间参照产品说明书进行。杂交完毕，洗膜，晾干，-80℃放射自显影5d。以β-actin cDNA为探针，按同样方法杂交上述MTNI膜作为对照。放射自显影杂交带的灰度扫描用Bio-Rad公司产GDS-8000 型凝胶成像系统和Annutating Grabber-1T2.51扫描软件，UVP Gelworks ID Advanced Version 2.51分析软件。
2 结果
2.1 电子杂交推测HumCyr61的变异剪接转录本 从HumCyr61序列出发，应用BLASTN程序筛选NCBI的dbEST数据库，获得高度同源的人源EST片段，应用GCG软件包ASSEMBLE程序拼接出统计一致序列，重复上述操作直至没有新的EST序列返回。将返回的ESTs序列和已克隆的HumCyr61 cDNA序列进行对比，发现存在3个变异剪接位点，编码两个潜在的转录本(见图1)。
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图1 变异剪接位点的理论预测
cDNA在GenBank中登录，接受号为AF031385。EST片段AW385799与AF031385比较，在714和923位点存在插入片段，其中714号剪接位点得到AW385811片段的支持，923号剪接位点得到AA044451片段的支持。在3’末端，我们还发现另一种可变剪接形式，使3’UTR加长，由EST片段W49502和AI184573一致支持。
2.2 HumCyr61的组织表达谱分析 以标记好的BA-1 cDNA片段为探针，与含人体8种组织mRNA的MTNI膜杂交后发现，8种组织中除脑组织不表达外， 其他7种组织均表达一种约2.4kb的转录本，该转录本在肾脏和骨骼肌中高度表达，在胎盘、心脏、肺脏中中度表达，在胰腺、肝脏中低度表达；另外，胰腺和胎盘组织中还可以看到有一种约3.5 kb的转录本，骨骼肌组织中有一种约5.0 kb的转录本(见图2)。各组织杂交带面积灰度扫描后所得放射自显影的强度值比较结果显示，HumCyr61基因在7种组织中的表达量从高到低依次为：肾脏、骨骼肌、胎盘、心脏、肺脏、胰腺、肝脏。扫描量值见附表。
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3 讨论
1985年Lau等[5]发现，用血小板衍生生长因子刺激鼠BALB/c 3T3细胞约5min，就可激活鼠Cyr61基因的转录，并发现这种激活转录与细胞G0/G1期的转换相关。1991年Brunner等[6]用TGF-β1诱导鼠AKR-2B细胞，诱导表达的mRNA显示，Cyr61基因被转录激活。这些研究表明，Cyr61蛋白是细胞生长调控信号通路中的一个重要因子。Genini等和我们的研究结果表明，人类Cyr61 基因的下调表达可能是肿瘤发生的一个原因[1，2]。
附表 HumCyr61在人8种组织中的表达量 序号
组织
杂交带面积扫描量
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HumCyr61
β-actin
1
心脏
63932.00
59530.00
2
脑
54612.00
20958.00
3
胎盘(～2.4kb)
胎盘(～3.5kb)
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64376.00
62842.00
35844.00
35844.00
4
肺脏
63833.00
24361.00
5
肝脏
63246.00
20147.00
, http://www.100md.com 6
骨骼肌(～2.4kb)
骨骼肌(～5.0kb)
65121.00
59048.00
154837.00
154837.00
7
肾脏
65138.00
14122.00
8
, http://www.100md.com 胰腺(～2.4kb)
胰腺(～3.5kb)
63374.00
63132.00
35364.00
35364.00
图2 17 HumCyr61基本原则因的8种组织表达谱
1心脏2 脑3胎盘4肺，5肝6骨骼肌7肾8胰腺
为探讨HumCyr61 基因的功能，分析其在不同组织中的表达谱很有必要。首先，我们通过计算机辅助的电子杂交步移策略[7，8]，从理论上预测出HumCyr61基因还具有3个潜在的变异剪接位点。由于目前情况下变异剪接位点支持的EST片段并不太多，应密切注意dbEST库的扩展。但是，这种充分利用国际上的公用数据库进行实验前设计的手段，不仅减少了实验的盲目性，也说明电子杂交步移策略是切实可行的。为了证明计算机预测的结果，又进行了人8种组织的Northern杂交，杂交结果与理论上的推测互相吻合。胰腺组织中显示了两种不同长度的杂交带，表明HumCyr61基因确实存在其他的剪接转录本，并且这种转录可能与胰腺的分泌功能有一定的关系。由于鼠Cyr61蛋白也能分泌到细胞外，并与细胞增殖和迁移、黏附有关[4]，可以认为，HumCyr61基因与细胞间的通讯密切相关。从杂交结果上还可以看出，HumCyr61在脑组织中未见条带，表明它是一种外周系统特异表达的基因，因此在进行此基因的细胞及分子水平研究时，不应选用脑组织。HumCyr61除了在肾脏和骨骼肌中高表达外，在人其他组织中也有不同程度的表达，提示它不仅与肾脏、骨骼肌的生理活动密切相关，还可能参与体内许多不同的代谢过程。
, 百拇医药
陈政 硕士研究生
蒋滢 导师
参考文献
[1] Genini M, Schwalbe P, Scholl F A, et al. Isolation of genes differentially expressed in human primary myoblasts and embryonal rhabdomyosarcoma. Int J Cancer, 1996，66∶571
[2] Bi Anding, Yu Long, Zhang Ming, et al. Cloning of HumCyr61 gene expressing down-regulatedly in Rhabdomyosarcoma. Chinese Science Bulletin，1998，43(10)∶878
, 百拇医药
[3] Lau L F，Nathans. Expression of growth-related immediate early genes in BALB/c 3T3 cell: Coodinate regulation with c-fos or c-myc. Proc Natl Acad Sci USA，1987，84∶1182
[4] Maria L K,Fan-E MO,George P Y，et al. Cyr61, a product of a growth factor-inducible immediate-early gene, promotes cell proliferation, migration and adhesion. Molecular and Cellular Biology，1996，16(4)∶1326
[5] Lau L F，Nathans. Identification of a set of genes expressed during the G0/G1 transition of cultured mouse cells.1985，EMBO J, 4∶3145
, http://www.100md.com
[6] Brunner A, Chinn J, Neubauer M，et al.Identification of a gene family regulated by transforming growth factor-β. DNA and Cell Biology，1991， 10(4)∶293
[7] Marra MA, Hillier L，Waterston R.Expressed sequence tags -ESTablishing bridges between genomes. Trends in Genetics，1998，14∶4
[8] Benson DA, Boguski MS, Lipman DJ,et al.GenBank. Nucleic Acids Research,1998,26(1)∶1
(2000年3月13日收稿), 百拇医药
单位：傅风云(杭州市疾病预防保健门诊部检验室)；毕安定(复旦大学遗传所)；陈政 蒋菊香 张宏来 蒋滢(苏州医学院生化教研室，苏州，215007)
关键词：HumCyr61基因；变异剪接；Northern杂交；组织表达谱
苏州医学院学报000607 摘要 目的 预测HumCyr61基因的变异剪接转录本，并通过分析其在不同组织中的表达谱进行验证，以便初步探讨HumCyr61基因的功能。方法 应用计算机辅助的电子杂交步移策略，通过对比查询数据库返回的ESTs序列和先前克隆的HumCyr61 cDNA序列，预测了HumCyr61基因的变异剪接转录本。将HumCyr61基因片段制备探针后与含有人体8个组织mRNA的MTNI膜杂交，进行表达谱分析。结果 计算机预测HumCyr61基因存在3个潜在的变异剪接位点，暗示该基因可能具有3种不同的转录本。 Northern杂交结果显示，此基因在所检测的8种组织中除脑组织不表达外，其他7种组织中均存在一种大小基本一致的转录本，约2.4kb，该转录本在肾脏和骨骼肌中高度表达，在胎盘、心脏、肺脏中中度表达，在胰腺、肝脏中低度表达。杂交结果还显示，此基因在胰腺和胎盘组织中存在一种约3.5kb的条带，在骨骼肌中存在另一种约5.0kb的条带。结论 电子杂交步移预测及Northern杂交结果证实了HumCyr61基因变异剪接位点的存在。
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中图法分类号 R392.2
Studies on the Tissue Expression Pattern of HumCyr61
Chen Zheng, Fu Fengyun, Bi Anding, et al
(Department of Biochemistry,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To study the function of HumCyr61, three alternative splicing transcripts were speculated and confirmed afterwards.Methods With the help of computer, electronic hybridization walking strategy was used to speculate alternative splicing of HumCyr61 by comparison of the BLAST result obtained from dbEST and HumCyr61 cDNA sequence. Northern blotting was performed to hybridize α-32P-dATP labeled HumCyr61 cDNA partial sequence with mRNA of 8 different human tissues that had been transferred to the MTNI membrane.Results Northern hybridization showed that HumCyr61 was expressed as a～2.4kb transcript in almost all tissues tested except brain, among which high expression in kidney and skeletal muscle, medium expression in placenta, heart, lung, and low expression in pancreas and liver. Northern hybridization also showed that there were another transcript of～3.5kb in pancreas, placenta and transcript of～5.0kb in skeletal muscle. The result is consistent with the previous speculation obtained with computer.Conclusion There exist two potential transcripts except the cloned HumCyr61 cDNA.
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Key words HumCyr61；alternative splicing;Northern hybridization;tissue expression pattern
横纹肌肉瘤是软组织中较常见的恶性肿瘤，合并有脑的发育异常。它包括胚胎性横纹肌肉瘤、腺泡型横纹肌肉瘤和多形性横纹肌肉瘤3种类型。其中，胚胎性横纹肌肉瘤常见于小儿，恶性度高。近年来，已克隆出许多与横纹肌肉瘤的发生有密切关系的基因片段，如胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-5)、金属蛋白酶3组织抑制因子(TIMP-3)、成骨细胞特异因子(OSF-2)[1]等。本室最近克隆了一个人类新基因HumCyr61，该基因包含的一个EST片段Z50168在胚胎性横纹肌肉瘤中呈下调表达[2]。研究[3]表明，鼠Cyr61基因与c-fos基因在G0/G1过渡期能共同被PDGF和FGF等生长因子激活表达；也有研究[4]表明，鼠Cyr61蛋白能分泌到细胞外，与细胞增殖和迁移、黏附有密切关系。因此，分析人类Cyr61基因在不同组织中的表达特征对探讨该基因的生物学功能具有重要意义。
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1 材料和方法
1.1 材料 含人体8种组织mRNA的MTNI膜购自CLONTECH公司，α-32P-dATP、dNTP和Megaprime RPN1605随机引物标记盒均购自Amersham公司, Sephadex G-50购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 电子杂交 利用美国国家生物信息中心(NCBI)的局部同源比较服务器(BLASTN)，将HumCyr61核酸序列筛选GenBank表达序列数据库dbEST，由此获得了一些同源度较高的EST序列，将两端的EST片段作为阳性克隆，分别向5’和3’端延伸，并以获得的新序列为探针重复筛选dbEST数据库，直至不能再延伸为止。拼接所有阳性克隆，获得统计一致序列。
1.2.2 杂交探针的标记及纯化 以本室分离的BA-1 cDNA片段[2]为模板，采用随机引物标记法标记探针，反应体系如下：DNA 30～50ng 和 随机引物5μl中加ddH2O至26μl，煮沸5min后稍离心，加入以下成份：10×反应液5μl，dCTP, dTTP, dGTP各4μl，α-32P-dATP 5μl，Klenow酶2μl(1unit/μl)，总体积共50μl，37℃ 温育30min。将新华滤纸剪成一长条形，在距一端约1cm 的中间位置点少量标记物后向下垂直浸入层析液(pH3.6，0.5mol/L磷酸缓冲液)1mm左右，进行自下而上的纸层析。待层析液前缘走出7～8cm后，用手提式盖革计数器检测探针标记率，达80%，其中，探针标记率 =(近原点处同位素最大放射量即cpm原点值/前沿cpm最大值+近原点处cpm最大值)×100%。再以TE作为洗脱液，Sephadex G-50柱层析纯化探针。
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1.2.3 用上述标记并纯化好的探针，杂交含人体8种组织mRNA的MTNI膜，杂交体系和杂交时间参照产品说明书进行。杂交完毕，洗膜，晾干，-80℃放射自显影5d。以β-actin cDNA为探针，按同样方法杂交上述MTNI膜作为对照。放射自显影杂交带的灰度扫描用Bio-Rad公司产GDS-8000 型凝胶成像系统和Annutating Grabber-1T2.51扫描软件，UVP Gelworks ID Advanced Version 2.51分析软件。
2 结果
2.1 电子杂交推测HumCyr61的变异剪接转录本 从HumCyr61序列出发，应用BLASTN程序筛选NCBI的dbEST数据库，获得高度同源的人源EST片段，应用GCG软件包ASSEMBLE程序拼接出统计一致序列，重复上述操作直至没有新的EST序列返回。将返回的ESTs序列和已克隆的HumCyr61 cDNA序列进行对比，发现存在3个变异剪接位点，编码两个潜在的转录本(见图1)。
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图1 变异剪接位点的理论预测
cDNA在GenBank中登录，接受号为AF031385。EST片段AW385799与AF031385比较，在714和923位点存在插入片段，其中714号剪接位点得到AW385811片段的支持，923号剪接位点得到AA044451片段的支持。在3’末端，我们还发现另一种可变剪接形式，使3’UTR加长，由EST片段W49502和AI184573一致支持。
2.2 HumCyr61的组织表达谱分析 以标记好的BA-1 cDNA片段为探针，与含人体8种组织mRNA的MTNI膜杂交后发现，8种组织中除脑组织不表达外， 其他7种组织均表达一种约2.4kb的转录本，该转录本在肾脏和骨骼肌中高度表达，在胎盘、心脏、肺脏中中度表达，在胰腺、肝脏中低度表达；另外，胰腺和胎盘组织中还可以看到有一种约3.5 kb的转录本，骨骼肌组织中有一种约5.0 kb的转录本(见图2)。各组织杂交带面积灰度扫描后所得放射自显影的强度值比较结果显示，HumCyr61基因在7种组织中的表达量从高到低依次为：肾脏、骨骼肌、胎盘、心脏、肺脏、胰腺、肝脏。扫描量值见附表。
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3 讨论
1985年Lau等[5]发现，用血小板衍生生长因子刺激鼠BALB/c 3T3细胞约5min，就可激活鼠Cyr61基因的转录，并发现这种激活转录与细胞G0/G1期的转换相关。1991年Brunner等[6]用TGF-β1诱导鼠AKR-2B细胞，诱导表达的mRNA显示，Cyr61基因被转录激活。这些研究表明，Cyr61蛋白是细胞生长调控信号通路中的一个重要因子。Genini等和我们的研究结果表明，人类Cyr61 基因的下调表达可能是肿瘤发生的一个原因[1，2]。
附表 HumCyr61在人8种组织中的表达量 序号
组织
杂交带面积扫描量
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HumCyr61
β-actin
1
心脏
63932.00
59530.00
2
脑
54612.00
20958.00
3
胎盘(～2.4kb)
胎盘(～3.5kb)
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62842.00
35844.00
35844.00
4
肺脏
63833.00
24361.00
5
肝脏
63246.00
20147.00
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骨骼肌(～2.4kb)
骨骼肌(～5.0kb)
65121.00
59048.00
154837.00
154837.00
7
肾脏
65138.00
14122.00
8
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胰腺(～3.5kb)
63374.00
63132.00
35364.00
35364.00
图2 17 HumCyr61基本原则因的8种组织表达谱
1心脏2 脑3胎盘4肺，5肝6骨骼肌7肾8胰腺
为探讨HumCyr61 基因的功能，分析其在不同组织中的表达谱很有必要。首先，我们通过计算机辅助的电子杂交步移策略[7，8]，从理论上预测出HumCyr61基因还具有3个潜在的变异剪接位点。由于目前情况下变异剪接位点支持的EST片段并不太多，应密切注意dbEST库的扩展。但是，这种充分利用国际上的公用数据库进行实验前设计的手段，不仅减少了实验的盲目性，也说明电子杂交步移策略是切实可行的。为了证明计算机预测的结果，又进行了人8种组织的Northern杂交，杂交结果与理论上的推测互相吻合。胰腺组织中显示了两种不同长度的杂交带，表明HumCyr61基因确实存在其他的剪接转录本，并且这种转录可能与胰腺的分泌功能有一定的关系。由于鼠Cyr61蛋白也能分泌到细胞外，并与细胞增殖和迁移、黏附有关[4]，可以认为，HumCyr61基因与细胞间的通讯密切相关。从杂交结果上还可以看出，HumCyr61在脑组织中未见条带，表明它是一种外周系统特异表达的基因，因此在进行此基因的细胞及分子水平研究时，不应选用脑组织。HumCyr61除了在肾脏和骨骼肌中高表达外，在人其他组织中也有不同程度的表达，提示它不仅与肾脏、骨骼肌的生理活动密切相关，还可能参与体内许多不同的代谢过程。
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蒋滢 导师
参考文献
[1] Genini M, Schwalbe P, Scholl F A, et al. Isolation of genes differentially expressed in human primary myoblasts and embryonal rhabdomyosarcoma. Int J Cancer, 1996，66∶571
[2] Bi Anding, Yu Long, Zhang Ming, et al. Cloning of HumCyr61 gene expressing down-regulatedly in Rhabdomyosarcoma. Chinese Science Bulletin，1998，43(10)∶878
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[3] Lau L F，Nathans. Expression of growth-related immediate early genes in BALB/c 3T3 cell: Coodinate regulation with c-fos or c-myc. Proc Natl Acad Sci USA，1987，84∶1182
[4] Maria L K,Fan-E MO,George P Y，et al. Cyr61, a product of a growth factor-inducible immediate-early gene, promotes cell proliferation, migration and adhesion. Molecular and Cellular Biology，1996，16(4)∶1326
[5] Lau L F，Nathans. Identification of a set of genes expressed during the G0/G1 transition of cultured mouse cells.1985，EMBO J, 4∶3145
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[6] Brunner A, Chinn J, Neubauer M，et al.Identification of a gene family regulated by transforming growth factor-β. DNA and Cell Biology，1991， 10(4)∶293
[7] Marra MA, Hillier L，Waterston R.Expressed sequence tags -ESTablishing bridges between genomes. Trends in Genetics，1998，14∶4
[8] Benson DA, Boguski MS, Lipman DJ,et al.GenBank. Nucleic Acids Research,1998,26(1)∶1
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