IL-8单抗对炎症性中性粒细胞浸润的阻断作用
作者：刘继明 张学光 张毅 朱华亭 许志祥 於葛华 强亦忠
单位：苏州医学院免疫学研究室，苏州，215007
关键词：IL-8；单克隆抗体；拮抗剂；炎症
苏州医学院学报000604 摘要 目的 建立可特异性识别IL-8抗原并具有拮抗IL-8生物学活性的单抗，观察抗体对炎症性损伤的保护作用。方法 采用常规方法免疫和细胞融合，经间接ELISA检测和有限稀释亚克隆、筛选，建立稳定分泌抗人IL-8的杂交瘤细胞株。通过趋化阻断实验，观察抗体在体外拮抗IL-8生物学活性的作用；以家兔为模型，通过皮肤注射LPS诱导局部产生炎症反应，同时静脉注射IL-8抗体，观察抗体对炎症性损伤的保护作用。结果 经筛选获得3株稳定分泌IL-8单抗的杂交瘤细胞株，一株为IgG1(SI98), 另两株为IgM(SI96、SI97)。这3株单抗在体外具有阻断IL-8对中性粒细胞的趋化作用；在体内，皮肤局部注射LPS产生的炎症反应，导致大量中性粒细胞的浸润，体内预先注射IL-8抗体后，可明显阻断中性粒细胞在炎症部位的浸润。结论 3株单抗均可作为拮抗IL-8生物学功能的拮抗剂，阻断炎症反应过程中中性粒细胞的浸润。
, 百拇医药
中图法分类号 R392.11
Inhibition Effect of Monoclonal Antibody against Interleukin-8
on LPS Induced Neutrophil Infiltration
Liu Jiming, Zhang Xueguang, Zhang Yi, et al
(Department of Immunology, Suzhou Medical College, Suzhou，215007)
Abstract Objective To establish a monoclonal antibody against Interleukin-8 (IL-8) and investigate its roles in inflammatory injury.Methods Balb/c mice were immunized with human IL-8 by routine methods. IL-8 hybridoma was screened by an indirect Enzyme linked Immuno-Sorbed Assay (ELISA). Interleukin-8 has chemotactic activity on PMN in vitro, and the anti-chemotactic activity of the monoclonal antibody against IL-8 was examined using a modified-multiwell Boyden chamber system. To investigate its roles when inflammation, LPS was injected into rabbit skin for inducing inflammation, neutrophil infiltration was examinated by routine histological method after inhibited by IL-8 antibody.Results Three anti-IL-8 mAbs were obtained, SI96 and SI97 are IgM mAbs, SI98 belongs to IgG1. Three mAbs have the blocking effect on IL-8 in vitro, and the chemotactic effect of IL-8 was completely inhibited when the concentration of antibody was increased. After injecting LPS 4 h, lots of neutrophils were infiltrated in inflammatory skin, but obviously decreased when protected by IL-8 antibody.Conclusion Three IL-8 mAbs have the blocking effect against IL-8 in vivo, which can be used to inhibit inflammatory injury in vivo.
, 百拇医药
Key words IL-8；monoclonal antibody；inflammatory；blocking
IL-8是机体最主要的炎症因子，对中性粒细胞有明显趋化和功能活化作用，还可诱导CD4+和CD8+ T细胞的趋化。目前已知IL-8参与了多种疾病的发展和组织损伤[1]，如类风湿性关节炎、牛皮癣、缺血回灌综合征(包括心肌梗死和多器官功能衰竭)、肾小球肾炎以及其他各类感染性疾病等。因此研制拮抗IL-8生物学活性的单克隆抗体，可为治疗IL-8介导的炎症性病理损伤提供有效的手段。本室建立IL-8单抗，并观察其对炎症性损伤的保护作用。结果报告于下。
1 材料与方法
1.1 免疫原的制备 用大肠杆菌表达，经提取、纯化后获得的重组人IL-8(rhIL-8)，经SDS-PAGE鉴定为单一区[2]。
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1.2 单克隆抗体的制备 按本室常规方法进行。将纯化的rhIL-8 20μg/次免疫Balb/c小鼠，共3次，每次间隔2周。免疫第3周后尾静脉取血测效价，效价较好的小鼠尾静脉加强免疫后，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，用50%PEG进行融合，HAT培养基选择性培养。以HPLC纯IL-8(日本东京大学松岛教授惠赠)包板，用间接ELISA法筛选强阳性细胞株，经3次亚克隆稳定化。抗体用亚型快速鉴定条(ARGENE Biosoft, France)鉴定其亚型。将筛选出的强阳性杂交瘤细胞5×106接种于Pristane 预致敏1周的Balb/c小鼠腹腔中制备腹水。用CaCl2去除纤维蛋白后于-20℃冻存备用。
1.3 单抗的纯化与定量 IgM型单抗用优球蛋白沉淀法[3]纯化，IgG1型单抗采用硫酸铵沉淀法纯化。蛋白质定量采用改良的Bradford法[3]，定量用标准蛋白(中国生物制品鉴定所提供)。
, http://www.100md.com
1.4 电泳和免疫印迹 电泳采用10%还原变性SDS-PAGE, 免疫印迹按常规方法进行。
1.5 单抗对IL-8生物学功能的拮抗作用
1.5.1 中性粒细胞(PMN)趋化试验 按文献[4]进行。96孔趋化板(ChemoTx, Neuro Probe)，其膜厚10μm，孔径大小3μm。新鲜分离的外周血PMN调节其浓度至1×106个/ml。上层加2μl的细胞悬液，下层加入29μl不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μg/ml)的单抗和10ng/ml IL-8，样品用0.5%BSA-RPMI1640稀释, 对照样品为0.5%BSA-RPMI1640。37℃、CO2培养箱放置40min，70%甲醇固定后吉姆萨液染色观察下层膜面上的细胞，用40×光学显微镜观察计算下层细胞数。趋化指数用样品迁移细胞数 / 对照样品迁移细胞数表示。
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1.5.2 LPS介导的PMN浸润实验 健康新西兰家兔2～2.5kg/只，实验前1周将背部毛剃去，皮下局部注射1μg/ml LPS 0.1ml，同时通过耳静脉注射IL-8单抗(2mg/kg)，对照注射生理盐水。4h后取局部皮肤组织，10%甲醛固定，作普通病理切片，HE染色观察。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 将双扩散血清效价比高达1∶16～1∶32的小鼠脾脏细胞与SP2/0融合，按本室的常规方法进行，然后用HAT选择培养剂置细胞于96孔板中，5h后可见明显的克隆细胞生长。14h时用间接ELISA法筛选，获得12株分泌抗IL-8单抗的杂交瘤细胞株，其中3株具有强阳性反应的细胞株进行3次亚克隆和稳定化，分别命名为SI96、SI97和SI98。
2.2 单抗的纯化及鉴定 培养上清采用抗体亚类快速鉴定试剂条鉴定，鉴定结果SI96、SI97为IgM亚类，SI98为IgG1亚类。SI96和SI97腹水采用优球蛋白沉淀法纯化，经还原性SDS-PAGE检测证实，SI97由两个亚基组成，其分子量分别为25kd和70kd，SI96结果相似。SI98腹水采用硫酸铵一步纯化法，因此不能获得高纯度的抗体。纯化的SI98电泳显示除了一些杂蛋白区带外，还具有IgG1显著的结构特征，即由25kd和50kd的两条亚基组成(图1)。将标准IL-8进行普通电泳后进行免疫印迹检测，结果显示SI98可特异性识别位于9kd处的标准IL-8抗原(图2)；SI96、SI97得到类似的结果，表明抗体可特异性识别IL-8抗原。
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图1 10%还原性SDS-PAGE分析纯化的单抗条带
1.优球蛋白沉淀法纯化的SI98(IgM);2.低分子量标准蛋白；3.SI98(IgG)
图2 SI98单抗的免疫印迹分析
2.3 抗体拮抗IL-8活性的作用 新鲜分离的PMN，在IL-8的趋化作用下能穿过微孔滤膜进入下层，预先加入IL-8单抗可抑制IL-8对PMN的趋化作用，SI96、SI97和SI98在体外能明显抑制IL-8对PMN的趋化作用，随着单抗浓度的增加，3株单抗均能完全抑制IL-8对PMN的趋化活性(图3)。
2.4 单抗对炎症性损伤的保护作用 通过在兔皮下注射LPS诱导局部产生炎症反应，4 h后LPS注射部位产生红肿块，普通病理切片显示有大量PMN对炎症部位浸润(图4左)；在体内预先注射IL-8单抗后，可明显抑制红肿块的产生，普通病理切片显示PMN对LPS注射部位的浸润明显减少(图4右)。该结果显示，IL-8对炎症性损伤的保护作用主要是通过阻断PMN浸润至炎症部位产生的。
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IL-8单抗浓度(ng/ml)
图3 不同单抗对IL-8趋化活性的抑制作用
对照：抗B7-1单抗；IL-8浓度：10ng/ml
图4 抗体对LPS介导的中性粒细胞浸润的阻断作用
3 讨论
外伤、外源性颗粒入侵、微生物感染、缺血回灌综合征、恶性肿瘤的浸润转移和自身免疫性疾病等均可引起各类急性炎症性反应或类急性炎症性反应，此时常伴随一定的组织损伤。急性炎症发生时的一个重要标志，就是PMN在炎症部位的大量聚集。IL-8是趋化PMN聚集、游走到炎症部位的关键性因子。炎症部位的各种炎症性因子如LPS、IL-1、TNFα和IFN等，均能刺激内皮细胞、单核细胞/巨噬细胞等分泌大量的IL-8。IL-8使局部血管通透性增加，改变PMN与内皮细胞的粘附，并趋化PMN游走、聚集到炎症部位，释放各种活性酶和LTB4等，参与炎症反应。炎症反应过强，将引起病理性组织损伤。在缺血回灌综合征时，如心肌梗死、脑血栓等均伴有缺血再灌注性损伤，会导致致命性死亡。Koji Masushima等[5]用IL-8中和性抗体，成功地保护了肺缺血再灌注时引起的病理损伤[5]。除此之外，近年来在兔实验动物模型中，应用IL-8中和性单抗已成功地预防急性肾炎引起的蛋白尿、降低由内毒素休克引起的死亡、断肢再植时的急性排斥反应和脑缺血再灌注引起的脑组织损伤等[6～10]。应用抗IL-8中和性抗体，将成为治疗缺血回灌综合征疾病的有效手段。
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应用间接酶联检测法，我们成功地建立了3株抗IL-8的杂交瘤细胞株。为了分析这3株抗体是否具有中和IL-8的生物学活性，以抗体在体外拮抗IL-8对中性粒细胞的趋化作用为指标，检测了这3株单抗对IL-8生物学活性的拮抗作用。在体外，IL-8对新鲜分离的PMN具有明显的趋化作用，能使PMN有效地穿过孔径为3μm的薄膜。应用穿膜实验能有效检测IL-8对PMN的趋化活性。通过预先加入适量的IL-8单抗，观察单抗抑制IL-8趋化PMN的作用，随着单抗浓度的增加，3株单抗可完全抑制IL-8对中性粒细胞的趋化作用。
鉴于炎症性损伤通常伴随有大量 PMN的浸润和IL-8的产生[10]，我们以家兔为实验模型，在皮肤局部注射LPS诱导产生炎症反应，同时静脉注射IL-8单抗，观察其对炎症性反应的保护作用。该结果表明，IL-8抗体对炎症性损伤具有保护作用，进一步证实了炎症发生时，IL-8是介导中性粒细胞浸润的关键因子，对阐明IL-8在微生物感染时所发挥的重要作用具有显著意义。鉴于这3株单抗均能拮抗IL-8生物学活性，将来在体内联合应用，可能对预防缺血回灌综合征会产生更好的效果。我们建立的3株拮抗人IL-8生物学活性的鼠源性单抗为将来开展动物实验性治疗各种炎症性损伤的研究提供了良好的物质基础。
, 百拇医药
江苏省科委优秀青年教师基金(BQ96016)和核工业总公司民品技术开发项目(H7410262)资助课题
刘继明 硕士研究生
张学光 导师
参考文献
[1] Harada A, Sekido N, Akahoshi T, et al. Essential involvement of interleukin-8 (IL-8) in acute inflammation. J Leukoc Biol，1994，56∶559
[2] 刘继明，张学光，施 勤，等. 大肠杆菌表达重组人白细胞介素-8分离纯化工艺的建立. 苏州医学院学报，2000，20(4)∶340
[3] 刘继明,孙晓燕,邱玉华, 等.小鼠腹水IgM型抗体的纯化. 中国免疫学杂志,1999，15(11)∶501
, 百拇医药
[4] Harada A, Sekido N, Kuno K, et al. Expression of recombinant rabbit IL-8 in Escherichia coli and establishment of the essential involvement of IL-8 in recruiting neutropils into lipopolysaccharide-induced inflammatory site of rabbit skin. Internat Immunol, 5(6)∶681
[5] Sekido N, Mukaida M, Harada A, et al. Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against interleukin-8. Nature, 1993, 365∶654
, http://www.100md.com [6] Mukaida N，Matsumoto T，Yokoi K, et al. Inhibition of neutrophil-mediated acute inflammation injury by an antibody against interleukin-8 (IL-8). Inflamm Res, 1998, 47 Suppl 3∶S151
[7] Matsumoto T, Ikeda K, Mukaida N, et al. Prevention of cerebral edema and infarct in cerebral reperfusion injury by an antibody to interleukin-8. Lab Invest, 1997, 77(2)∶119
[8] Carvalho GL, Wakabayashi G, Shimazu M, et al. Anti-interleukin-8 monoclonal antibody reduces free radical production and improves hemodynamics and survival rate in endotoxic shock in rabbits. Surgery, 1997, 122(1)∶60
, http://www.100md.com
[9] Nishimura A, Akahoshi T, Takahashi M, et al. Attenuation of monosodium urate crystal-induced arthritis in rabbits by a neutralizing antibody against interleukin-8. J Leukoc Biol, 1997, 62(4)∶444
[10] Keane MP, Belperio JA, Moore TA, et al. Neutralization of the CXC chemokine, macrophage inflammatory protein-2, attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J Immunol,1997，162∶5511
(2000年3月20日收稿), 百拇医药
单位：苏州医学院免疫学研究室，苏州，215007
关键词：IL-8；单克隆抗体；拮抗剂；炎症
苏州医学院学报000604 摘要 目的 建立可特异性识别IL-8抗原并具有拮抗IL-8生物学活性的单抗，观察抗体对炎症性损伤的保护作用。方法 采用常规方法免疫和细胞融合，经间接ELISA检测和有限稀释亚克隆、筛选，建立稳定分泌抗人IL-8的杂交瘤细胞株。通过趋化阻断实验，观察抗体在体外拮抗IL-8生物学活性的作用；以家兔为模型，通过皮肤注射LPS诱导局部产生炎症反应，同时静脉注射IL-8抗体，观察抗体对炎症性损伤的保护作用。结果 经筛选获得3株稳定分泌IL-8单抗的杂交瘤细胞株，一株为IgG1(SI98), 另两株为IgM(SI96、SI97)。这3株单抗在体外具有阻断IL-8对中性粒细胞的趋化作用；在体内，皮肤局部注射LPS产生的炎症反应，导致大量中性粒细胞的浸润，体内预先注射IL-8抗体后，可明显阻断中性粒细胞在炎症部位的浸润。结论 3株单抗均可作为拮抗IL-8生物学功能的拮抗剂，阻断炎症反应过程中中性粒细胞的浸润。
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中图法分类号 R392.11
Inhibition Effect of Monoclonal Antibody against Interleukin-8
on LPS Induced Neutrophil Infiltration
Liu Jiming, Zhang Xueguang, Zhang Yi, et al
(Department of Immunology, Suzhou Medical College, Suzhou，215007)
Abstract Objective To establish a monoclonal antibody against Interleukin-8 (IL-8) and investigate its roles in inflammatory injury.Methods Balb/c mice were immunized with human IL-8 by routine methods. IL-8 hybridoma was screened by an indirect Enzyme linked Immuno-Sorbed Assay (ELISA). Interleukin-8 has chemotactic activity on PMN in vitro, and the anti-chemotactic activity of the monoclonal antibody against IL-8 was examined using a modified-multiwell Boyden chamber system. To investigate its roles when inflammation, LPS was injected into rabbit skin for inducing inflammation, neutrophil infiltration was examinated by routine histological method after inhibited by IL-8 antibody.Results Three anti-IL-8 mAbs were obtained, SI96 and SI97 are IgM mAbs, SI98 belongs to IgG1. Three mAbs have the blocking effect on IL-8 in vitro, and the chemotactic effect of IL-8 was completely inhibited when the concentration of antibody was increased. After injecting LPS 4 h, lots of neutrophils were infiltrated in inflammatory skin, but obviously decreased when protected by IL-8 antibody.Conclusion Three IL-8 mAbs have the blocking effect against IL-8 in vivo, which can be used to inhibit inflammatory injury in vivo.
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Key words IL-8；monoclonal antibody；inflammatory；blocking
IL-8是机体最主要的炎症因子，对中性粒细胞有明显趋化和功能活化作用，还可诱导CD4+和CD8+ T细胞的趋化。目前已知IL-8参与了多种疾病的发展和组织损伤[1]，如类风湿性关节炎、牛皮癣、缺血回灌综合征(包括心肌梗死和多器官功能衰竭)、肾小球肾炎以及其他各类感染性疾病等。因此研制拮抗IL-8生物学活性的单克隆抗体，可为治疗IL-8介导的炎症性病理损伤提供有效的手段。本室建立IL-8单抗，并观察其对炎症性损伤的保护作用。结果报告于下。
1 材料与方法
1.1 免疫原的制备 用大肠杆菌表达，经提取、纯化后获得的重组人IL-8(rhIL-8)，经SDS-PAGE鉴定为单一区[2]。
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1.2 单克隆抗体的制备 按本室常规方法进行。将纯化的rhIL-8 20μg/次免疫Balb/c小鼠，共3次，每次间隔2周。免疫第3周后尾静脉取血测效价，效价较好的小鼠尾静脉加强免疫后，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞，用50%PEG进行融合，HAT培养基选择性培养。以HPLC纯IL-8(日本东京大学松岛教授惠赠)包板，用间接ELISA法筛选强阳性细胞株，经3次亚克隆稳定化。抗体用亚型快速鉴定条(ARGENE Biosoft, France)鉴定其亚型。将筛选出的强阳性杂交瘤细胞5×106接种于Pristane 预致敏1周的Balb/c小鼠腹腔中制备腹水。用CaCl2去除纤维蛋白后于-20℃冻存备用。
1.3 单抗的纯化与定量 IgM型单抗用优球蛋白沉淀法[3]纯化，IgG1型单抗采用硫酸铵沉淀法纯化。蛋白质定量采用改良的Bradford法[3]，定量用标准蛋白(中国生物制品鉴定所提供)。
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1.4 电泳和免疫印迹 电泳采用10%还原变性SDS-PAGE, 免疫印迹按常规方法进行。
1.5 单抗对IL-8生物学功能的拮抗作用
1.5.1 中性粒细胞(PMN)趋化试验 按文献[4]进行。96孔趋化板(ChemoTx, Neuro Probe)，其膜厚10μm，孔径大小3μm。新鲜分离的外周血PMN调节其浓度至1×106个/ml。上层加2μl的细胞悬液，下层加入29μl不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μg/ml)的单抗和10ng/ml IL-8，样品用0.5%BSA-RPMI1640稀释, 对照样品为0.5%BSA-RPMI1640。37℃、CO2培养箱放置40min，70%甲醇固定后吉姆萨液染色观察下层膜面上的细胞，用40×光学显微镜观察计算下层细胞数。趋化指数用样品迁移细胞数 / 对照样品迁移细胞数表示。
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1.5.2 LPS介导的PMN浸润实验 健康新西兰家兔2～2.5kg/只，实验前1周将背部毛剃去，皮下局部注射1μg/ml LPS 0.1ml，同时通过耳静脉注射IL-8单抗(2mg/kg)，对照注射生理盐水。4h后取局部皮肤组织，10%甲醛固定，作普通病理切片，HE染色观察。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 将双扩散血清效价比高达1∶16～1∶32的小鼠脾脏细胞与SP2/0融合，按本室的常规方法进行，然后用HAT选择培养剂置细胞于96孔板中，5h后可见明显的克隆细胞生长。14h时用间接ELISA法筛选，获得12株分泌抗IL-8单抗的杂交瘤细胞株，其中3株具有强阳性反应的细胞株进行3次亚克隆和稳定化，分别命名为SI96、SI97和SI98。
2.2 单抗的纯化及鉴定 培养上清采用抗体亚类快速鉴定试剂条鉴定，鉴定结果SI96、SI97为IgM亚类，SI98为IgG1亚类。SI96和SI97腹水采用优球蛋白沉淀法纯化，经还原性SDS-PAGE检测证实，SI97由两个亚基组成，其分子量分别为25kd和70kd，SI96结果相似。SI98腹水采用硫酸铵一步纯化法，因此不能获得高纯度的抗体。纯化的SI98电泳显示除了一些杂蛋白区带外，还具有IgG1显著的结构特征，即由25kd和50kd的两条亚基组成(图1)。将标准IL-8进行普通电泳后进行免疫印迹检测，结果显示SI98可特异性识别位于9kd处的标准IL-8抗原(图2)；SI96、SI97得到类似的结果，表明抗体可特异性识别IL-8抗原。
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图1 10%还原性SDS-PAGE分析纯化的单抗条带
1.优球蛋白沉淀法纯化的SI98(IgM);2.低分子量标准蛋白；3.SI98(IgG)
图2 SI98单抗的免疫印迹分析
2.3 抗体拮抗IL-8活性的作用 新鲜分离的PMN，在IL-8的趋化作用下能穿过微孔滤膜进入下层，预先加入IL-8单抗可抑制IL-8对PMN的趋化作用，SI96、SI97和SI98在体外能明显抑制IL-8对PMN的趋化作用，随着单抗浓度的增加，3株单抗均能完全抑制IL-8对PMN的趋化活性(图3)。
2.4 单抗对炎症性损伤的保护作用 通过在兔皮下注射LPS诱导局部产生炎症反应，4 h后LPS注射部位产生红肿块，普通病理切片显示有大量PMN对炎症部位浸润(图4左)；在体内预先注射IL-8单抗后，可明显抑制红肿块的产生，普通病理切片显示PMN对LPS注射部位的浸润明显减少(图4右)。该结果显示，IL-8对炎症性损伤的保护作用主要是通过阻断PMN浸润至炎症部位产生的。
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IL-8单抗浓度(ng/ml)
图3 不同单抗对IL-8趋化活性的抑制作用
对照：抗B7-1单抗；IL-8浓度：10ng/ml
图4 抗体对LPS介导的中性粒细胞浸润的阻断作用
3 讨论
外伤、外源性颗粒入侵、微生物感染、缺血回灌综合征、恶性肿瘤的浸润转移和自身免疫性疾病等均可引起各类急性炎症性反应或类急性炎症性反应，此时常伴随一定的组织损伤。急性炎症发生时的一个重要标志，就是PMN在炎症部位的大量聚集。IL-8是趋化PMN聚集、游走到炎症部位的关键性因子。炎症部位的各种炎症性因子如LPS、IL-1、TNFα和IFN等，均能刺激内皮细胞、单核细胞/巨噬细胞等分泌大量的IL-8。IL-8使局部血管通透性增加，改变PMN与内皮细胞的粘附，并趋化PMN游走、聚集到炎症部位，释放各种活性酶和LTB4等，参与炎症反应。炎症反应过强，将引起病理性组织损伤。在缺血回灌综合征时，如心肌梗死、脑血栓等均伴有缺血再灌注性损伤，会导致致命性死亡。Koji Masushima等[5]用IL-8中和性抗体，成功地保护了肺缺血再灌注时引起的病理损伤[5]。除此之外，近年来在兔实验动物模型中，应用IL-8中和性单抗已成功地预防急性肾炎引起的蛋白尿、降低由内毒素休克引起的死亡、断肢再植时的急性排斥反应和脑缺血再灌注引起的脑组织损伤等[6～10]。应用抗IL-8中和性抗体，将成为治疗缺血回灌综合征疾病的有效手段。
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应用间接酶联检测法，我们成功地建立了3株抗IL-8的杂交瘤细胞株。为了分析这3株抗体是否具有中和IL-8的生物学活性，以抗体在体外拮抗IL-8对中性粒细胞的趋化作用为指标，检测了这3株单抗对IL-8生物学活性的拮抗作用。在体外，IL-8对新鲜分离的PMN具有明显的趋化作用，能使PMN有效地穿过孔径为3μm的薄膜。应用穿膜实验能有效检测IL-8对PMN的趋化活性。通过预先加入适量的IL-8单抗，观察单抗抑制IL-8趋化PMN的作用，随着单抗浓度的增加，3株单抗可完全抑制IL-8对中性粒细胞的趋化作用。
鉴于炎症性损伤通常伴随有大量 PMN的浸润和IL-8的产生[10]，我们以家兔为实验模型，在皮肤局部注射LPS诱导产生炎症反应，同时静脉注射IL-8单抗，观察其对炎症性反应的保护作用。该结果表明，IL-8抗体对炎症性损伤具有保护作用，进一步证实了炎症发生时，IL-8是介导中性粒细胞浸润的关键因子，对阐明IL-8在微生物感染时所发挥的重要作用具有显著意义。鉴于这3株单抗均能拮抗IL-8生物学活性，将来在体内联合应用，可能对预防缺血回灌综合征会产生更好的效果。我们建立的3株拮抗人IL-8生物学活性的鼠源性单抗为将来开展动物实验性治疗各种炎症性损伤的研究提供了良好的物质基础。
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江苏省科委优秀青年教师基金(BQ96016)和核工业总公司民品技术开发项目(H7410262)资助课题
刘继明 硕士研究生
张学光 导师
参考文献
[1] Harada A, Sekido N, Akahoshi T, et al. Essential involvement of interleukin-8 (IL-8) in acute inflammation. J Leukoc Biol，1994，56∶559
[2] 刘继明，张学光，施 勤，等. 大肠杆菌表达重组人白细胞介素-8分离纯化工艺的建立. 苏州医学院学报，2000，20(4)∶340
[3] 刘继明,孙晓燕,邱玉华, 等.小鼠腹水IgM型抗体的纯化. 中国免疫学杂志,1999，15(11)∶501
, 百拇医药
[4] Harada A, Sekido N, Kuno K, et al. Expression of recombinant rabbit IL-8 in Escherichia coli and establishment of the essential involvement of IL-8 in recruiting neutropils into lipopolysaccharide-induced inflammatory site of rabbit skin. Internat Immunol, 5(6)∶681
[5] Sekido N, Mukaida M, Harada A, et al. Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against interleukin-8. Nature, 1993, 365∶654
, http://www.100md.com [6] Mukaida N，Matsumoto T，Yokoi K, et al. Inhibition of neutrophil-mediated acute inflammation injury by an antibody against interleukin-8 (IL-8). Inflamm Res, 1998, 47 Suppl 3∶S151
[7] Matsumoto T, Ikeda K, Mukaida N, et al. Prevention of cerebral edema and infarct in cerebral reperfusion injury by an antibody to interleukin-8. Lab Invest, 1997, 77(2)∶119
[8] Carvalho GL, Wakabayashi G, Shimazu M, et al. Anti-interleukin-8 monoclonal antibody reduces free radical production and improves hemodynamics and survival rate in endotoxic shock in rabbits. Surgery, 1997, 122(1)∶60
, http://www.100md.com
[9] Nishimura A, Akahoshi T, Takahashi M, et al. Attenuation of monosodium urate crystal-induced arthritis in rabbits by a neutralizing antibody against interleukin-8. J Leukoc Biol, 1997, 62(4)∶444
[10] Keane MP, Belperio JA, Moore TA, et al. Neutralization of the CXC chemokine, macrophage inflammatory protein-2, attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J Immunol,1997，162∶5511
(2000年3月20日收稿), 百拇医药