良恶性骨肿瘤p27蛋白表达与DNA含量研究
曾建成 胡云洲 裴福兴 雷松 毛咏秋 魏于全
摘 要 目的：探讨良恶性骨肿瘤细胞p27蛋白表达与DNA含量的关系及意义。方法：取骨肿瘤新鲜标本52例(骨软骨瘤10例，骨巨细胞瘤10例，骨肉瘤20例，其他恶性骨肿瘤12例)，运用流式细胞术、单克隆抗体技术和定量免疫荧光技术，检测瘤细胞p27蛋白表达、S期细胞百分数(SPF)及DNA含量(DI)，分析三者之间的关系。结果：52例骨肿瘤p27蛋白表达的平均FI值为1.37(骨软骨瘤2.24±0.38，骨巨细胞瘤1.79±0.36，骨肉瘤1.06±0.39，其他恶性骨肿瘤1.01±0.45)；p27<1.37组25例，均为恶性骨肿瘤；p27<1.37组的DI、SPF均明显高于p27≥1.37组(P<0.001)。结论：p27蛋白表达减少，导致细胞周期失调，S期细胞增多，DNA合成增强，细胞过度增生、恶变，可能是骨肿瘤发生发展的原因之一。
关键词：p27 基因表达 骨肿瘤 DNA 流式细胞术
, http://www.100md.com
为了更深入地了解良恶性骨肿瘤细胞增殖动力学特点和生物学行为，指导临床诊断治疗及预后判断，我们利用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)、单克隆抗体技术和定量免疫荧光技术，对手术或活检所得的人骨肿瘤新鲜标本进行了瘤细胞DNA含量、细胞周期和p27蛋白表达的定量分析，对三者的关系及意义进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本 取自华西医科大学附属第一医院骨科1997年6月至1998年6月手术或活检所得的人骨肿瘤新鲜瘤组织标本(均经本院病理科组织切片证实诊断)共52例：骨软骨瘤10例，骨巨细胞瘤10例，骨肉瘤20例，骨恶性纤维组织细胞瘤5例，软骨肉瘤5例，骨纤维肉瘤2例。所有病例均为无转移的原发骨肿瘤，在院外未行化疗及手术等处理。
1.1.2 试剂 碘化丙啶染液(PI，50μg/ml)，0.5%Triton X-100(Sigma公司)。鼠抗人p27蛋白单克隆抗体(一抗)，羊抗鼠异硫氰基荧光素-IgG(FITC-IgG,二抗)系Immunotech公司产品。
, 百拇医药
1.1.3 流式细胞仪 美国Coulter公司生产的Elite Esp型，其光源为Ar+激光器，激发光波长为488nm。
1.2 实验方法
1.2.1 骨肿瘤细胞DNA含量及细胞周期分析：将瘤组织用PBS液漂洗，去除表面血污及脂肪、结缔组织后，切割成1mm3大的碎块，装入试管中，加入30倍体积0.05%胶原酶，置37℃水浴中消化60分钟，间断振荡数次。终止消化后，用100目网眼的筛网过滤，去除未消化的组织，收集细胞悬液于离心管中。1 200rpm离心5分钟，去上清液；加入PBS液漂洗、离心，800rpm，3分钟，共两次，以除去细胞碎片。用300目筛网过滤，去除粘连细胞。用PBS液调整细胞浓度至1×106个/ml。加入DNA结合性荧光染料PI染液(50μg/ml)1ml，染色30分钟。流式细胞仪检测瘤细胞DNA含量及G1/G0期、G2/M期、S期百分数(S-phase fraction,SPF)。检测前先用标准微球(DNA Check)校准仪器，使其CV值在5%以内，并检测正常人外周血淋巴细胞作为DNA含量标准对照。检测时每个样品测5 000个细胞，其荧光信号经流式细胞仪Multicycle细胞周期分析软件处理后以直方图和数据表方式在荧光屏上显示。
, 百拇医药
1.2.2 p27蛋白表达的检测 将瘤组织用生理盐水反复洗涤3次(去除红细胞)，3%多聚甲醛固定10小时(4℃冰箱存放)。弃甲醛，PBS洗涤1次后，超声振荡器处理5分钟(使细胞分散)。加入0.5%TritonX-100 2ml，室温处理20分钟。用PBS洗涤3次，离心弃上清液，调整细胞浓度至1×106个/ml。细胞样品40μl，加入1∶5一抗10μl(对照组不加一抗)，37℃孵育1小时。加入2%小牛血清白蛋白50μl，室温作用20分钟，封闭无关抗原。PBS洗涤3次。加入荧光标记的二抗50μl(1∶50)，37℃孵育1小时。PBS洗涤3次，离心弃上清液。流式细胞仪检测瘤细胞的荧光强度，每个样品测5 000个细胞，用 Elite分析软件分析处理。
1.3 资料统计分析方法
1.3.1 DNA含量表示法 瘤细胞DNA含量以DNA指数(DNA Index,DI)表示。
, 百拇医药 以DI值作为判定DNA倍体的标准：DI=1.0±2CV，即0.90-1.10为二倍体；超出此范围者为异倍体。
1.3.2 细胞周期计算方法 由计算机的Multicycle周期分析软件确定G0/G1期、S期、G2/M期的道次范围后，计算落在各期内的细胞数总和即得各期细胞数，并用百分率表示。其中S期百分数(S-phase fraction)用SPF表示。
1.3.3 p27蛋白表达的定量分析 以荧光指数(fluorescence index,FI)表示p27蛋白的相对含量。
1.3.4 统计处理 测得的数据用均数(x)±标准差(s)表示。所有数据均采用SAS V6.12统计软件处理，行t检验或q检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 骨肿瘤良恶性与DNA倍体、DNA含量(DI)、S期百分数(SPF)和p27蛋白表达的关系
20例良性骨肿瘤均为二倍体，32例恶性骨肿瘤仅3例为二倍体，其余29例均为异倍体。恶性骨肿瘤的DI值、S期细胞所占百分比均明显高于良性骨肿瘤，但p27蛋白表达水平却明显低于良性骨肿瘤。良恶性骨肿瘤之间DI值、SPF、p27蛋白表达的差异，经统计学处理，有显著意义(表1)。
表1 骨肿瘤良恶性与DNA倍体、DI、SPF和p27的关系
例数
DNA倍体
DI值
(x±s)
SPF(%)
, 百拇医药
(x±s)
p27(FI值)
(x±s)
二倍体
异倍体
良性
20
20
0
1.02±0.03
9.84±3.96
2.01±0.42
恶性
, 百拇医药
32
3
29
1.63±0.34
18.98±6.14
1.09±0.35
t检验
-
-
-
P<0.001
P<0.001
P<0.05
, 百拇医药
2.2 骨肿瘤的病理类型、恶性程度与DI、SPF、p27的关系
骨软骨瘤、骨巨细胞瘤、骨肉瘤和其他恶性骨肿瘤之间比较结果显示：骨肿瘤的恶性程度越高，瘤细胞DNA含量和S期细胞所占比例越高，p27蛋白表达水平却相应降低。经多样本均数两两比较的q检验，它们之间的差异(骨肉瘤和其他恶性骨肿瘤之间的差异除外)有显著性(表2)。表2 骨肿瘤的病理类型、恶性程度与DI、SPF、p27的关系
肿瘤类型
例数
DI
P值
SPF(%)
P值
p27
, http://www.100md.com
P值
骨软骨瘤
10
1.01±0.02
6.07±2.16
2.24±0.38
>0.05
<0.001
<0.05
骨巨细胞瘤
10
1.02±0.03
12.93±1.68
, http://www.100md.com
1.79±0.36
<0.01
<0.005
<0.001
骨肉瘤
20
1.72±0.36
17.86±2.87
1.06±0.39
>0.05
>0.05
>0.05
, 百拇医药
其他恶性骨肿瘤
12
1.49±0.30
20.23±8.83
1.01±0.45
2.3 p27蛋白表达与DNA含量、SPF的关系
52例骨肿瘤p27蛋白表达的平均FI值x=1.37。以x=1.37为界限，将52例骨肿瘤分成两组：p27≥1.37组，27例(骨软骨瘤10例，骨巨细胞胞瘤10例，骨肉瘤3例，骨恶性纤维组织细胞瘤1例，骨软骨肉瘤3例)；p27<1.37组，25例，均为恶性骨肿瘤。比较发现，p27<1.37组的DI、SPF值均明显高于p27≥1.37组，两组之间的差异有显著性(P<0.001)，见表3。表3 p27蛋白表达与DI、SPF的关系
, 百拇医药
p27
例数
DI
SPF(%)
≥1.37
27
1.10±0.19
5.65±5.18
<1.37
25
1.73±0.28
20.49±6.03
t检验
, 百拇医药
-
P<0.001
P<0.001
3 讨论
肿瘤的发生、发展和恶变与细胞周期失控密切相关。细胞周期的顺利进行和完成依赖于一系列正负调节因子的相互作用，主要有细胞周期素(cyclins)、细胞周期素依赖激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)和细胞周期素依赖激酶抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase inhibitors,CDKIs)。CDKIs是近几年来分离得到一类重要的细胞周期调控蛋白，参与细胞G1期进入S期的负调控，可防止细胞过度增殖和恶变[1]。
p27是新近发现的CDKIs家族成员之一[2，3]。p27基因位于12p12-13.1，其编码的p27蛋白可抑制细胞从G1期进入S期而参与细胞周期的调控[4～6]。Loda[7]通过对结直肠癌p27蛋白表达的研究发现：p27蛋白低表达或不表达的患者的生存期明显低于p27蛋白阳性表达者；p27蛋白低表达或不表达主要是由于p27蛋白降解加强所致，p27基因缺失、突变少见；p27蛋白降解增加，引起p27蛋白低水平是侵袭性肿瘤发生的原因之一。Porter[8]、Steeg[9]等也认为p27蛋白水平的改变与肿瘤的发生、发展有关，可作为肿瘤生物学行为的预测指标。
, http://www.100md.com
本研究对骨软骨瘤、骨巨细胞瘤、骨肉瘤和其他恶性骨肿瘤DNA含量、SPF和p27蛋白的流式定量分析结果表明：骨肿瘤的恶性程度越高，瘤细胞的p27蛋白表达水平越低，瘤细胞DNA含量(DI)和S期细胞百分比却相应增高。骨肿瘤细胞的DI和SPF值的高低与p27蛋白表达水平有一定的相关性。由此可以推测，p27蛋白可能与骨肿瘤的发生、发展、恶变及预后有关。p27蛋白表达减少，导致细胞周期失调，S期细胞增多，DNA合成增强，细胞过度增生，可能是骨肿瘤发生、发展、恶变的原因之一。
利用流式细胞术定量分析骨肿瘤细胞DNA含量、S期细胞百分比与p27蛋白表达，将有助于骨肿瘤生物学行为和细胞增殖动力学特点的认识，对骨肿瘤良恶性鉴别、治疗方案的制定和预后的推断均有一定的临床意义。
基金项目：本文课题受四川省卫生厅科学研究基金资助
作者单位：曾建成(华西医科大学附属第一医院骨科 成都市 610041)
, 百拇医药
胡云洲(华西医科大学附属第一医院骨科 成都市 610041)
裴福兴(华西医科大学附属第一医院骨科 成都市 610041)
雷松(肿瘤生物治疗研究中心)
毛咏秋(肿瘤生物治疗研究中心)
魏于全(肿瘤生物治疗研究中心)
参考文献：
1，Hunter T,Pines J.Cyclins and cancer Ⅱ：cyclin D and CDK in-hibitors come of age.Cell,1994;79：573～82
2，Polyak K,Lee MH,Bromage HE,et al.Cloning of p27Kip1,a cycl in-dependent Kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals.Cell,1994;78：59～66
, 百拇医药
3，Toyoshima H,Hunter T.p27,a novel inhibitor of G1 cyclin-CDK protein kinase activity,is related to p21. Cell,1994;78：67～74
4，Pietenpol JA,Bohlander SK,Sato Y,et al.Assignment of the human p27Kip1 gene to 12p13 and its analysis in leukemias.Cancer Res,1995;55：1206～10
5，Ponce-Castaneda MV,Lee MH,Latres E,et al.p27kip1：chromoso mal mapping to 12p12-12p13.1 and absence of mutations in human tumors.Cancer Res,1995;55：1211～4
, 百拇医药
6，Hengst L,Read SI.Translational control of p27kip1 accumulation during the cell cycle.Science,1996;271：1861～4
7，Loda M,Cukor B,Tam SW,et al.Increased proteasome-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in aggressive colorectal carcinomas.Nat1 Med,1997;3(2)：231～4
8，Porter PL,Malone KE,Heagerty PJ,et al.Expression of cell-cycle regulators p27kip1 and cyclin E,alone and in combination,correlate with survival in young breast cancer patients.Nat1 Med,1997;3(2)：222～5
9，Steeg PS, Abrams JS. Cancer prognostices： past, present and p27.Nat1 Med,1997;3(2)：152～4, 百拇医药
摘 要 目的：探讨良恶性骨肿瘤细胞p27蛋白表达与DNA含量的关系及意义。方法：取骨肿瘤新鲜标本52例(骨软骨瘤10例，骨巨细胞瘤10例，骨肉瘤20例，其他恶性骨肿瘤12例)，运用流式细胞术、单克隆抗体技术和定量免疫荧光技术，检测瘤细胞p27蛋白表达、S期细胞百分数(SPF)及DNA含量(DI)，分析三者之间的关系。结果：52例骨肿瘤p27蛋白表达的平均FI值为1.37(骨软骨瘤2.24±0.38，骨巨细胞瘤1.79±0.36，骨肉瘤1.06±0.39，其他恶性骨肿瘤1.01±0.45)；p27<1.37组25例，均为恶性骨肿瘤；p27<1.37组的DI、SPF均明显高于p27≥1.37组(P<0.001)。结论：p27蛋白表达减少，导致细胞周期失调，S期细胞增多，DNA合成增强，细胞过度增生、恶变，可能是骨肿瘤发生发展的原因之一。
关键词：p27 基因表达 骨肿瘤 DNA 流式细胞术
, http://www.100md.com
为了更深入地了解良恶性骨肿瘤细胞增殖动力学特点和生物学行为，指导临床诊断治疗及预后判断，我们利用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)、单克隆抗体技术和定量免疫荧光技术，对手术或活检所得的人骨肿瘤新鲜标本进行了瘤细胞DNA含量、细胞周期和p27蛋白表达的定量分析，对三者的关系及意义进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本 取自华西医科大学附属第一医院骨科1997年6月至1998年6月手术或活检所得的人骨肿瘤新鲜瘤组织标本(均经本院病理科组织切片证实诊断)共52例：骨软骨瘤10例，骨巨细胞瘤10例，骨肉瘤20例，骨恶性纤维组织细胞瘤5例，软骨肉瘤5例，骨纤维肉瘤2例。所有病例均为无转移的原发骨肿瘤，在院外未行化疗及手术等处理。
1.1.2 试剂 碘化丙啶染液(PI，50μg/ml)，0.5%Triton X-100(Sigma公司)。鼠抗人p27蛋白单克隆抗体(一抗)，羊抗鼠异硫氰基荧光素-IgG(FITC-IgG,二抗)系Immunotech公司产品。
, 百拇医药
1.1.3 流式细胞仪 美国Coulter公司生产的Elite Esp型，其光源为Ar+激光器，激发光波长为488nm。
1.2 实验方法
1.2.1 骨肿瘤细胞DNA含量及细胞周期分析：将瘤组织用PBS液漂洗，去除表面血污及脂肪、结缔组织后，切割成1mm3大的碎块，装入试管中，加入30倍体积0.05%胶原酶，置37℃水浴中消化60分钟，间断振荡数次。终止消化后，用100目网眼的筛网过滤，去除未消化的组织，收集细胞悬液于离心管中。1 200rpm离心5分钟，去上清液；加入PBS液漂洗、离心，800rpm，3分钟，共两次，以除去细胞碎片。用300目筛网过滤，去除粘连细胞。用PBS液调整细胞浓度至1×106个/ml。加入DNA结合性荧光染料PI染液(50μg/ml)1ml，染色30分钟。流式细胞仪检测瘤细胞DNA含量及G1/G0期、G2/M期、S期百分数(S-phase fraction,SPF)。检测前先用标准微球(DNA Check)校准仪器，使其CV值在5%以内，并检测正常人外周血淋巴细胞作为DNA含量标准对照。检测时每个样品测5 000个细胞，其荧光信号经流式细胞仪Multicycle细胞周期分析软件处理后以直方图和数据表方式在荧光屏上显示。
, 百拇医药
1.2.2 p27蛋白表达的检测 将瘤组织用生理盐水反复洗涤3次(去除红细胞)，3%多聚甲醛固定10小时(4℃冰箱存放)。弃甲醛，PBS洗涤1次后，超声振荡器处理5分钟(使细胞分散)。加入0.5%TritonX-100 2ml，室温处理20分钟。用PBS洗涤3次，离心弃上清液，调整细胞浓度至1×106个/ml。细胞样品40μl，加入1∶5一抗10μl(对照组不加一抗)，37℃孵育1小时。加入2%小牛血清白蛋白50μl，室温作用20分钟，封闭无关抗原。PBS洗涤3次。加入荧光标记的二抗50μl(1∶50)，37℃孵育1小时。PBS洗涤3次，离心弃上清液。流式细胞仪检测瘤细胞的荧光强度，每个样品测5 000个细胞，用 Elite分析软件分析处理。
1.3 资料统计分析方法
1.3.1 DNA含量表示法 瘤细胞DNA含量以DNA指数(DNA Index,DI)表示。
, 百拇医药 以DI值作为判定DNA倍体的标准：DI=1.0±2CV，即0.90-1.10为二倍体；超出此范围者为异倍体。
1.3.2 细胞周期计算方法 由计算机的Multicycle周期分析软件确定G0/G1期、S期、G2/M期的道次范围后，计算落在各期内的细胞数总和即得各期细胞数，并用百分率表示。其中S期百分数(S-phase fraction)用SPF表示。
1.3.3 p27蛋白表达的定量分析 以荧光指数(fluorescence index,FI)表示p27蛋白的相对含量。
1.3.4 统计处理 测得的数据用均数(x)±标准差(s)表示。所有数据均采用SAS V6.12统计软件处理，行t检验或q检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 骨肿瘤良恶性与DNA倍体、DNA含量(DI)、S期百分数(SPF)和p27蛋白表达的关系
20例良性骨肿瘤均为二倍体，32例恶性骨肿瘤仅3例为二倍体，其余29例均为异倍体。恶性骨肿瘤的DI值、S期细胞所占百分比均明显高于良性骨肿瘤，但p27蛋白表达水平却明显低于良性骨肿瘤。良恶性骨肿瘤之间DI值、SPF、p27蛋白表达的差异，经统计学处理，有显著意义(表1)。
表1 骨肿瘤良恶性与DNA倍体、DI、SPF和p27的关系
例数
DNA倍体
DI值
(x±s)
SPF(%)
, 百拇医药
(x±s)
p27(FI值)
(x±s)
二倍体
异倍体
良性
20
20
0
1.02±0.03
9.84±3.96
2.01±0.42
恶性
, 百拇医药
32
3
29
1.63±0.34
18.98±6.14
1.09±0.35
t检验
-
-
-
P<0.001
P<0.001
P<0.05
, 百拇医药
2.2 骨肿瘤的病理类型、恶性程度与DI、SPF、p27的关系
骨软骨瘤、骨巨细胞瘤、骨肉瘤和其他恶性骨肿瘤之间比较结果显示：骨肿瘤的恶性程度越高，瘤细胞DNA含量和S期细胞所占比例越高，p27蛋白表达水平却相应降低。经多样本均数两两比较的q检验，它们之间的差异(骨肉瘤和其他恶性骨肿瘤之间的差异除外)有显著性(表2)。表2 骨肿瘤的病理类型、恶性程度与DI、SPF、p27的关系
肿瘤类型
例数
DI
P值
SPF(%)
P值
p27
, http://www.100md.com
P值
骨软骨瘤
10
1.01±0.02
6.07±2.16
2.24±0.38
>0.05
<0.001
<0.05
骨巨细胞瘤
10
1.02±0.03
12.93±1.68
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1.79±0.36
<0.01
<0.005
<0.001
骨肉瘤
20
1.72±0.36
17.86±2.87
1.06±0.39
>0.05
>0.05
>0.05
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其他恶性骨肿瘤
12
1.49±0.30
20.23±8.83
1.01±0.45
2.3 p27蛋白表达与DNA含量、SPF的关系
52例骨肿瘤p27蛋白表达的平均FI值x=1.37。以x=1.37为界限，将52例骨肿瘤分成两组：p27≥1.37组，27例(骨软骨瘤10例，骨巨细胞胞瘤10例，骨肉瘤3例，骨恶性纤维组织细胞瘤1例，骨软骨肉瘤3例)；p27<1.37组，25例，均为恶性骨肿瘤。比较发现，p27<1.37组的DI、SPF值均明显高于p27≥1.37组，两组之间的差异有显著性(P<0.001)，见表3。表3 p27蛋白表达与DI、SPF的关系
, 百拇医药
p27
例数
DI
SPF(%)
≥1.37
27
1.10±0.19
5.65±5.18
<1.37
25
1.73±0.28
20.49±6.03
t检验
, 百拇医药
-
P<0.001
P<0.001
3 讨论
肿瘤的发生、发展和恶变与细胞周期失控密切相关。细胞周期的顺利进行和完成依赖于一系列正负调节因子的相互作用，主要有细胞周期素(cyclins)、细胞周期素依赖激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)和细胞周期素依赖激酶抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase inhibitors,CDKIs)。CDKIs是近几年来分离得到一类重要的细胞周期调控蛋白，参与细胞G1期进入S期的负调控，可防止细胞过度增殖和恶变[1]。
p27是新近发现的CDKIs家族成员之一[2，3]。p27基因位于12p12-13.1，其编码的p27蛋白可抑制细胞从G1期进入S期而参与细胞周期的调控[4～6]。Loda[7]通过对结直肠癌p27蛋白表达的研究发现：p27蛋白低表达或不表达的患者的生存期明显低于p27蛋白阳性表达者；p27蛋白低表达或不表达主要是由于p27蛋白降解加强所致，p27基因缺失、突变少见；p27蛋白降解增加，引起p27蛋白低水平是侵袭性肿瘤发生的原因之一。Porter[8]、Steeg[9]等也认为p27蛋白水平的改变与肿瘤的发生、发展有关，可作为肿瘤生物学行为的预测指标。
, http://www.100md.com
本研究对骨软骨瘤、骨巨细胞瘤、骨肉瘤和其他恶性骨肿瘤DNA含量、SPF和p27蛋白的流式定量分析结果表明：骨肿瘤的恶性程度越高，瘤细胞的p27蛋白表达水平越低，瘤细胞DNA含量(DI)和S期细胞百分比却相应增高。骨肿瘤细胞的DI和SPF值的高低与p27蛋白表达水平有一定的相关性。由此可以推测，p27蛋白可能与骨肿瘤的发生、发展、恶变及预后有关。p27蛋白表达减少，导致细胞周期失调，S期细胞增多，DNA合成增强，细胞过度增生，可能是骨肿瘤发生、发展、恶变的原因之一。
利用流式细胞术定量分析骨肿瘤细胞DNA含量、S期细胞百分比与p27蛋白表达，将有助于骨肿瘤生物学行为和细胞增殖动力学特点的认识，对骨肿瘤良恶性鉴别、治疗方案的制定和预后的推断均有一定的临床意义。
基金项目：本文课题受四川省卫生厅科学研究基金资助
作者单位：曾建成(华西医科大学附属第一医院骨科 成都市 610041)
, 百拇医药
胡云洲(华西医科大学附属第一医院骨科 成都市 610041)
裴福兴(华西医科大学附属第一医院骨科 成都市 610041)
雷松(肿瘤生物治疗研究中心)
毛咏秋(肿瘤生物治疗研究中心)
魏于全(肿瘤生物治疗研究中心)
参考文献：
1，Hunter T,Pines J.Cyclins and cancer Ⅱ：cyclin D and CDK in-hibitors come of age.Cell,1994;79：573～82
2，Polyak K,Lee MH,Bromage HE,et al.Cloning of p27Kip1,a cycl in-dependent Kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals.Cell,1994;78：59～66
, 百拇医药
3，Toyoshima H,Hunter T.p27,a novel inhibitor of G1 cyclin-CDK protein kinase activity,is related to p21. Cell,1994;78：67～74
4，Pietenpol JA,Bohlander SK,Sato Y,et al.Assignment of the human p27Kip1 gene to 12p13 and its analysis in leukemias.Cancer Res,1995;55：1206～10
5，Ponce-Castaneda MV,Lee MH,Latres E,et al.p27kip1：chromoso mal mapping to 12p12-12p13.1 and absence of mutations in human tumors.Cancer Res,1995;55：1211～4
, 百拇医药
6，Hengst L,Read SI.Translational control of p27kip1 accumulation during the cell cycle.Science,1996;271：1861～4
7，Loda M,Cukor B,Tam SW,et al.Increased proteasome-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in aggressive colorectal carcinomas.Nat1 Med,1997;3(2)：231～4
8，Porter PL,Malone KE,Heagerty PJ,et al.Expression of cell-cycle regulators p27kip1 and cyclin E,alone and in combination,correlate with survival in young breast cancer patients.Nat1 Med,1997;3(2)：222～5
9，Steeg PS, Abrams JS. Cancer prognostices： past, present and p27.Nat1 Med,1997;3(2)：152～4, 百拇医药