乳香提取物诱导急性非淋巴细胞性白血病细胞凋亡的实验研究
齐振华 张国平 朱文辉 谭桂山 任波 唐果成
提 要 目的：研究乳香提取物诱导急性非淋巴细胞性白血病细胞凋亡作用。方法：应用形态学观察、DNA电泳、DNA片段百分率、流式细胞仪分析检测白血病细胞凋亡。结果：乳香提取物能诱导急性非淋巴性白血病细胞凋亡。结论：乳香提取物具有诱导急非淋白血病细胞凋亡作用。
关键词：白血病，非淋巴细胞性，急性 乳香提取物 细胞凋亡
细胞凋亡是目前研究药物作用机制重要检测方法之一[1]。本研究以检测细胞凋亡为手段，探讨乳香提取物抗白血病作用的机制。
1 对象与方法
1.1 对象 30例急性非淋巴细胞性白血病(急非淋白血病)病人，为本院住院及门诊病例，其中(M1 3，M2a11，M3 10，M4 1，M5 5)，男16例，女14例，年龄10～60(29.26±13.14)岁；均经骨髓及组织化学染色确诊，急非淋M3白血病经PMI-RARα融合基因证实。骨髓原加早(幼单)细胞72.6±13.4%。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞 HL60细胞引自湖南医科大学血液生理研究室，用含15%胎牛血清，100IU.ml-1青霉素，100μg.ml-1链霉素的RPMI 1640培养基在37℃ 5% CO2饱和湿度条件下培养，取指数生长期细胞进行实验。
1.2.2 药物 乳香提取物为本院药剂科制备，采用水蒸蒸馏，除去部分挥发油水提液过滤离心，以每毫升相当的量计算提取物浓度，乳香挥发油(BVO)，有效部分(BEP)，BVL(BVO+BEP)。全反式维甲酸(All-trans retinoic acid, ATRA)上海第六制药厂产品。阿糖胞苷(Ara-C)北京医科大学产品。
1.2.3 细胞培养 以2×106个.ml-1细胞浓度接种急非淋白血病(ANLL)原代细胞及HL60细胞株细胞于新鲜RPMI 1640培养液中培养(37℃ 5% CO2全湿空气培养)，实验时收集细胞。细胞活力要求大于85%，按细胞数2×107.ml-1，每瓶10ml，共分6组，即对照组和加药组(Ara-C 40μg.ml-1,ATRA 1μmol.ml-1，BVO 100μg.ml-1，BEP 100μg.ml-1，BVL 100μg.ml-1)，培养24h。
, 百拇医药
1.2.4 DNA凝胶电泳 经乳香提取物处理后细胞加入2ml裂解缓冲液(50mmol.L-1 Tris-HCl pH7.5,100μl,20mmol.L-1 EDTA,pH7.5,80μl，加蒸馏水至2ml含1%NP-40) 37℃过夜，然后加入0.8ml饱和NaCl溶液，离心2次(3000r.min-1, 6min)合并上清液并加入终浓度20μg.ml-1 mRNA酶37℃孵育15min，经二倍体积无水乙醇沉淀DNA，在1.5%琼脂糖胶上电泳以DNA EcoRI+Hind作为分子量标志(1.375，957，831，564，125)。
1.2.5 DNA片段百分率 ANLL细胞及HL60细胞按上述方法裂解完整DNA经25%三氯醋酸(TCA)沉淀后再次溶于160μl 5% TCA中90℃热解10min，用二苯胺试剂显色，测定吸收光度值A570nm。
, 百拇医药
1.2.6 流式细胞仪分析细胞DNA含量分布 经一定浓度乳香提取物处理后骨髓细胞培养24h，取培养后细胞0.5～1ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，取1～2×106细胞，PBS洗2次，PI一步染色在室温染色30min过滤，流式细胞仪检测。
1.2.7 形态学观察 在电镜及光学显微镜下观察，细胞形态。
1.3 统计学处理 测得指标用均数±标准差(X±s)表示，组间比较，采用t检验。
2 结 果
2.1 DNA凝胶电泳 在乳香提取物作用下，凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活，其DNA核小体之间的连接处被切断，降解呈倍数关系的DNA片段(图1)。
, http://www.100md.com
图1 乳香有效成分诱导原代急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡“梯状DNA”凝胶电泳图 1 BVO 2 BEP 3 BVL 4 ATRA 5 Ara-C 6 Markers分子量标志(1375，957，831，564，125) 7 Control
Fig. 1 The Boswellia Carterii Birdw on induction apoptosis acute promyelocytic leukemia(APL) cells shows such a ladder produced by electrophoresis of DNA extractecd from apoptotic APL cells
2.2 DNA片段百分率 乳香提取物诱导急非淋白血病细胞及HL60 cells凋亡。特异性DNA片段百分率见附表。
附表 乳香提取物诱导ANLL Cells及HL60 Cells DNA片段百分率(X±s)
, 百拇医药
对照
Ara-C(40μg.ml-1)
RA(1μmol.ml-1)
BVO(100μg.ml-1)
BEP(100μg.ml-1)
BVL(100μg.ml-1)
ANLL Cells
24.2±12.9
44.9±12.6
, 百拇医药
47.9±4.2
45.9±10.9①
47.9±9.6①
48.1±11.3①
HL60 Cells
27.2±0.5
47.5±0.5
48.4±0.4
50.9±0.8
53.6±0.7
59.3±0.4
, 百拇医药
①与对照组比较P<0.01;①与RA比较P>0.052.3 流式细胞仪分析细胞DNA含量 结果显示典型凋亡细胞群(图2)。
图2 流式细胞仪检测乳香有效成分诱导原代急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡
Fig. 2 The Boswellia carterii Birdw on induction apoptosis APL cells by flow Cytometric cell cycle analysis
2.4 电镜及光学显微镜下形态学变化 急性非淋巴细胞白血病细胞经乳香提取物处理后，出现典型凋亡形态特征：细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核固缩，染色质凝集，核碎裂形成凋亡小体(图3)。
, 百拇医药
图3 HL60细胞经乳香有效成分处理后出现典型凋亡的形态 A 光镜下(1?400×1) B 电镜下(6?000×1)
Fig. 3 Morphology of HL60 apoptotic cells induced by Boswellia Carterii Birdw after A. Light micrograph magnification ×1?400 B. electron micrograph magnification ×6?000
3 讨 论
细胞凋亡是机体进化过程中生理性与坏死完全不同的另一种细胞死亡的机制[2]，其深入研究将有助于阐明肿瘤细胞发生发展和衰亡的全过程，为探讨肿瘤药物作用机制开辟一条新途径。乳香在中医中药中作为活血化瘀药使用。经研究它又是DNA拓扑异构酶Ⅰ，Ⅱ抑制剂[3]。本研究证明一定剂量的乳香提取物能诱导急非淋白血病细胞凋亡，而不是坏死。白血病细胞表现为分化不全，其终末分化相关凋亡过程受到抑制，而诱导分化剂可使白血病细胞重新分化[4]，但是经诱导分化剂使白血病细胞分化成熟，能否像正常成熟细胞凋亡，最终得到清除，是鉴定诱导分化剂治疗恶性肿瘤的一个重要问题。据文献报道维甲酸诱导HL60细胞凋亡，并且这种凋亡与终末分化有关[5]。本实验结果证实乳香提取物与全反式维甲酸相似，同样可诱导急非淋白血病细胞及HL60细胞分化[7，8]，同时也诱导凋亡。流式细胞仪检测表明，凋亡峰提前出现，峰值增高，诱导凋亡能力与维甲酸相似(图2)。凝胶电泳出现“梯状DNA”，电镜及光学显微镜观察，出现典型凋亡特征，细胞体积缩小，核固缩，染色质浓集，核碎裂出芽破裂形成凋亡小体(图3)。1994年元月以来，我室采用乳香提取物制成口服液(鲍威勒口服液)加化疗治疗急非淋白血病人54例，完全缓解率85%(46/54)，部分缓解率6%(3/54)，未缓解9.3%(5/54)，有效率90.7%，随机抽样单用化疗治疗35例，完全缓解率42.9%(15/35)，部分缓解12.5%(4/35)，未缓解45.7%，有效率54%。表明乳香提取物能明显提高治疗急非淋白血病的疗效，是治疗白血病有前途的药物之一。
, 百拇医药
作者：齐振华 女 61岁 教授 ①本课题为卫生部科学基金(编号94-2-067)和省科委重点课题[编号01-951-28-1(5)]
作者单位：齐振华 张国平 朱文辉 谭桂山 任 波 唐果成(附属湘雅医院血液科 长沙 410008)
参考文献
[1]戴育成.深入开展细胞凋亡的研究.中华血液学杂志，1996，17(12)：617-618
[2]Kerr JFB, Winterord CM. Biol ADA, et al. Aptosis its significance in cancer and cancer therapy cancer. 1994,73:2013-2026
[3]韩锐主编.肿瘤化学预防及药物治疗.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991：47
, 百拇医药
[4]Sachs L, Lotem J. Control of programmed cell death in normal and leukemic cells: new implications for therapy. Blood, 1993,82:15-21
[5]Marrin SJ, Bradley JG, Cotter TG. HL60 cells induced to differentiate towards neutrophils subsequently die via apoptosis. Clin EXP Immunol, 1990,79:448-453
[6]Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line. Blood, 1993,81:151-157
[7]齐振华，张国平，谭桂山，等.乳香提取物对急性非淋巴细胞白血病细胞诱导分化作用.湖南中医学院学报，1998，18(2)：P18-19
[8]Wojciech Gorczyca, Jianping Gong, Barbara Ardelt, et al. The cell cycle Related differences in susceptibility of HL60 cells apoptosis induced by various antitumor agents. Cancer Research, 1993,53:3186-3192, http://www.100md.com
提 要 目的：研究乳香提取物诱导急性非淋巴细胞性白血病细胞凋亡作用。方法：应用形态学观察、DNA电泳、DNA片段百分率、流式细胞仪分析检测白血病细胞凋亡。结果：乳香提取物能诱导急性非淋巴性白血病细胞凋亡。结论：乳香提取物具有诱导急非淋白血病细胞凋亡作用。
关键词：白血病，非淋巴细胞性，急性 乳香提取物 细胞凋亡
细胞凋亡是目前研究药物作用机制重要检测方法之一[1]。本研究以检测细胞凋亡为手段，探讨乳香提取物抗白血病作用的机制。
1 对象与方法
1.1 对象 30例急性非淋巴细胞性白血病(急非淋白血病)病人，为本院住院及门诊病例，其中(M1 3，M2a11，M3 10，M4 1，M5 5)，男16例，女14例，年龄10～60(29.26±13.14)岁；均经骨髓及组织化学染色确诊，急非淋M3白血病经PMI-RARα融合基因证实。骨髓原加早(幼单)细胞72.6±13.4%。
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1.2 方法
1.2.1 细胞 HL60细胞引自湖南医科大学血液生理研究室，用含15%胎牛血清，100IU.ml-1青霉素，100μg.ml-1链霉素的RPMI 1640培养基在37℃ 5% CO2饱和湿度条件下培养，取指数生长期细胞进行实验。
1.2.2 药物 乳香提取物为本院药剂科制备，采用水蒸蒸馏，除去部分挥发油水提液过滤离心，以每毫升相当的量计算提取物浓度，乳香挥发油(BVO)，有效部分(BEP)，BVL(BVO+BEP)。全反式维甲酸(All-trans retinoic acid, ATRA)上海第六制药厂产品。阿糖胞苷(Ara-C)北京医科大学产品。
1.2.3 细胞培养 以2×106个.ml-1细胞浓度接种急非淋白血病(ANLL)原代细胞及HL60细胞株细胞于新鲜RPMI 1640培养液中培养(37℃ 5% CO2全湿空气培养)，实验时收集细胞。细胞活力要求大于85%，按细胞数2×107.ml-1，每瓶10ml，共分6组，即对照组和加药组(Ara-C 40μg.ml-1,ATRA 1μmol.ml-1，BVO 100μg.ml-1，BEP 100μg.ml-1，BVL 100μg.ml-1)，培养24h。
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1.2.4 DNA凝胶电泳 经乳香提取物处理后细胞加入2ml裂解缓冲液(50mmol.L-1 Tris-HCl pH7.5,100μl,20mmol.L-1 EDTA,pH7.5,80μl，加蒸馏水至2ml含1%NP-40) 37℃过夜，然后加入0.8ml饱和NaCl溶液，离心2次(3000r.min-1, 6min)合并上清液并加入终浓度20μg.ml-1 mRNA酶37℃孵育15min，经二倍体积无水乙醇沉淀DNA，在1.5%琼脂糖胶上电泳以DNA EcoRI+Hind作为分子量标志(1.375，957，831，564，125)。
1.2.5 DNA片段百分率 ANLL细胞及HL60细胞按上述方法裂解完整DNA经25%三氯醋酸(TCA)沉淀后再次溶于160μl 5% TCA中90℃热解10min，用二苯胺试剂显色，测定吸收光度值A570nm。
, 百拇医药
1.2.6 流式细胞仪分析细胞DNA含量分布 经一定浓度乳香提取物处理后骨髓细胞培养24h，取培养后细胞0.5～1ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，取1～2×106细胞，PBS洗2次，PI一步染色在室温染色30min过滤，流式细胞仪检测。
1.2.7 形态学观察 在电镜及光学显微镜下观察，细胞形态。
1.3 统计学处理 测得指标用均数±标准差(X±s)表示，组间比较，采用t检验。
2 结 果
2.1 DNA凝胶电泳 在乳香提取物作用下，凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活，其DNA核小体之间的连接处被切断，降解呈倍数关系的DNA片段(图1)。
, http://www.100md.com
图1 乳香有效成分诱导原代急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡“梯状DNA”凝胶电泳图 1 BVO 2 BEP 3 BVL 4 ATRA 5 Ara-C 6 Markers分子量标志(1375，957，831，564，125) 7 Control
Fig. 1 The Boswellia Carterii Birdw on induction apoptosis acute promyelocytic leukemia(APL) cells shows such a ladder produced by electrophoresis of DNA extractecd from apoptotic APL cells
2.2 DNA片段百分率 乳香提取物诱导急非淋白血病细胞及HL60 cells凋亡。特异性DNA片段百分率见附表。
附表 乳香提取物诱导ANLL Cells及HL60 Cells DNA片段百分率(X±s)
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对照
Ara-C(40μg.ml-1)
RA(1μmol.ml-1)
BVO(100μg.ml-1)
BEP(100μg.ml-1)
BVL(100μg.ml-1)
ANLL Cells
24.2±12.9
44.9±12.6
, 百拇医药
47.9±4.2
45.9±10.9①
47.9±9.6①
48.1±11.3①
HL60 Cells
27.2±0.5
47.5±0.5
48.4±0.4
50.9±0.8
53.6±0.7
59.3±0.4
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①与对照组比较P<0.01;①与RA比较P>0.052.3 流式细胞仪分析细胞DNA含量 结果显示典型凋亡细胞群(图2)。
图2 流式细胞仪检测乳香有效成分诱导原代急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡
Fig. 2 The Boswellia carterii Birdw on induction apoptosis APL cells by flow Cytometric cell cycle analysis
2.4 电镜及光学显微镜下形态学变化 急性非淋巴细胞白血病细胞经乳香提取物处理后，出现典型凋亡形态特征：细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核固缩，染色质凝集，核碎裂形成凋亡小体(图3)。
, 百拇医药
图3 HL60细胞经乳香有效成分处理后出现典型凋亡的形态 A 光镜下(1?400×1) B 电镜下(6?000×1)
Fig. 3 Morphology of HL60 apoptotic cells induced by Boswellia Carterii Birdw after A. Light micrograph magnification ×1?400 B. electron micrograph magnification ×6?000
3 讨 论
细胞凋亡是机体进化过程中生理性与坏死完全不同的另一种细胞死亡的机制[2]，其深入研究将有助于阐明肿瘤细胞发生发展和衰亡的全过程，为探讨肿瘤药物作用机制开辟一条新途径。乳香在中医中药中作为活血化瘀药使用。经研究它又是DNA拓扑异构酶Ⅰ，Ⅱ抑制剂[3]。本研究证明一定剂量的乳香提取物能诱导急非淋白血病细胞凋亡，而不是坏死。白血病细胞表现为分化不全，其终末分化相关凋亡过程受到抑制，而诱导分化剂可使白血病细胞重新分化[4]，但是经诱导分化剂使白血病细胞分化成熟，能否像正常成熟细胞凋亡，最终得到清除，是鉴定诱导分化剂治疗恶性肿瘤的一个重要问题。据文献报道维甲酸诱导HL60细胞凋亡，并且这种凋亡与终末分化有关[5]。本实验结果证实乳香提取物与全反式维甲酸相似，同样可诱导急非淋白血病细胞及HL60细胞分化[7，8]，同时也诱导凋亡。流式细胞仪检测表明，凋亡峰提前出现，峰值增高，诱导凋亡能力与维甲酸相似(图2)。凝胶电泳出现“梯状DNA”，电镜及光学显微镜观察，出现典型凋亡特征，细胞体积缩小，核固缩，染色质浓集，核碎裂出芽破裂形成凋亡小体(图3)。1994年元月以来，我室采用乳香提取物制成口服液(鲍威勒口服液)加化疗治疗急非淋白血病人54例，完全缓解率85%(46/54)，部分缓解率6%(3/54)，未缓解9.3%(5/54)，有效率90.7%，随机抽样单用化疗治疗35例，完全缓解率42.9%(15/35)，部分缓解12.5%(4/35)，未缓解45.7%，有效率54%。表明乳香提取物能明显提高治疗急非淋白血病的疗效，是治疗白血病有前途的药物之一。
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作者：齐振华 女 61岁 教授 ①本课题为卫生部科学基金(编号94-2-067)和省科委重点课题[编号01-951-28-1(5)]
作者单位：齐振华 张国平 朱文辉 谭桂山 任 波 唐果成(附属湘雅医院血液科 长沙 410008)
参考文献
[1]戴育成.深入开展细胞凋亡的研究.中华血液学杂志，1996，17(12)：617-618
[2]Kerr JFB, Winterord CM. Biol ADA, et al. Aptosis its significance in cancer and cancer therapy cancer. 1994,73:2013-2026
[3]韩锐主编.肿瘤化学预防及药物治疗.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991：47
, 百拇医药
[4]Sachs L, Lotem J. Control of programmed cell death in normal and leukemic cells: new implications for therapy. Blood, 1993,82:15-21
[5]Marrin SJ, Bradley JG, Cotter TG. HL60 cells induced to differentiate towards neutrophils subsequently die via apoptosis. Clin EXP Immunol, 1990,79:448-453
[6]Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line. Blood, 1993,81:151-157
[7]齐振华，张国平，谭桂山，等.乳香提取物对急性非淋巴细胞白血病细胞诱导分化作用.湖南中医学院学报，1998，18(2)：P18-19
[8]Wojciech Gorczyca, Jianping Gong, Barbara Ardelt, et al. The cell cycle Related differences in susceptibility of HL60 cells apoptosis induced by various antitumor agents. Cancer Research, 1993,53:3186-3192, http://www.100md.com