傅里叶变换红外光谱法定量研究抗氧化剂对β-淀粉样蛋白1-40老化过程中二级结构变化的影响
作者：庾照学 姚志彬
单位：(中山医科大学解剖学教研室，广东 广州 510089)
关键词：阿尔茨海默病；淀粉样β-蛋白；抗氧化药；光谱，傅里叶变换红外
中国病理生理杂志000616
[摘 要] 目的：研究抗氧化剂TA9901抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集和纤维形成的机制。方法：运用傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)和曲线拟合法定量研究TA9901对Aβ1-40无细胞液体外老化过程中二级结构变化的影响。结果：Aβ单独老化30 min，β-折叠片含量为43.17%， β-转角为32.9%。Aβ单独老化7 d，β-折叠片增加约10%，出现自由卷曲向β-折叠转化。TA9901与Aβ1-40共同孵育，β-转角和β-折叠片的含量分别为23.5%和26.4%。维生素E的存在主要减少了β-折叠片的含量(30.8%)，而二者联用使β-转角的量(16.7%)明显下降。结论：TA9901和VE均能抑制β-折叠的形成，但以TA9901对β-转角和β-折叠片的抑制作用较为强烈，提示其抑制Aβ的聚集和纤维形成的机制可能与抑制Aβ分子中β-折叠结构的形成有关。
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[中图分类号] R364； R394 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0540-05
Effect of antioxidants on secondary conformational transition of aged amyloid β-peptide1-40 by FT-IR quantitative study
YU Zhao-xue, YAO Zhi-bin
(Department of Anatomy, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
[Abstract] AIM: To investigate the mechanism that antioxidants TA9901, inhibit the formation of amyloid-β-protein(Aβ) fibril. METHODS: Fourier-transform infrared spectroscopy was used to study the secondary structure changes on aging Aβ in vitro. RESULTS: Aβ aged alone for 30 min, the content of β-pleated sheet and β-turn were 43.17% and 32.9% respectively. Aβ aged alone for 7 days, the content of β-pleated sheet increased abuot 10% and produced a shift of random coil toward β-pleated sheet. TA9901 induced a significant decrease of the content of β-turn (23.5%) and β-pleated sheet (26.4%). VE mainly decreased the β-pleated sheet content (30.8%). The combination of TA9901 and VE promoted transition of β-turn (16.7%) toward α-helix and random coil. CONCLUSIONS: Both of TA9901 and VE can effectively diminish the β-structural content. TA9901 showed more intensitive inhibition than VE. The effect of TA9901 on the secondary structure of aged Aβ was associated with the mechanism that TA9901 inhibited Aβ aggregation and fibril formation.
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[MeSH] Alzheimer's disease； Amyloid beta-protein; Antioxidants; Spectra, Fourier transform infrared
β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)在脑内的纤维状沉积是老年性痴呆(Alzheimer's disease，AD)的主要病理变化。已有相当多的资料表明，这种淀粉样沉积在AD的发病过程中起着非常重要的作用[1]，并可能与细胞骨架蛋白变性及神经元损伤有关。Aβ是一个含39～43个氨基酸的多肽，由其前体蛋白(amyloid β-precursor protein, APP)裂解而来，其二级结构主要包括α-螺旋，自由卷曲，β-转角和伸展结构(β-折叠片)。Aβ二级结构的改变是影响Aβ聚集和纤维形成的重要因素。通常以β-折叠结构为主的Aβ能快速的聚集，而以α-螺旋、自由卷曲结构为主的Aβ则聚集缓慢[2,3]。合成的Aβ或从老年斑中分离出的蛋白能自发地聚集成典型的直径的为6～10 nm的淀粉样纤维，这种纤维的二级结构主要为β-折叠结构[4]，这与天然的AD样或其他已知的淀粉蛋白的结构相一致[5]。因此，干预β-折叠结构的形成以减少Aβ的聚集和淀粉样纤维的沉积是进行AD病理治疗的理想方法。寻找能有效的干预β-折叠结构的形成，阻止淀粉样纤维的产生的物质是实施这一病理治疗策略的关键。
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我们最近的研究已经证实，抗氧化剂TA9901能有效的抑制Aβ聚集和纤维形成(待发表)。为进一步探讨TA9901抑制Aβ纤维化的作用机制，本研究运用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)及曲线拟合法，定量研究TA9901和维生素E(Vitamin E, VE)对Aβ1-40无细胞孵育液体外老化过程中二级结构变化的影响。
材 料 和 方 法
一、 样品处理
Aβ1-40为Sigma公司产品， 参照Fraser 和Barrow等人的实验[4,9,11]，取1.0 mg/mL Aβ1-40溶液(50 mmol/L PBS配制， pH 7.4)各20 μL，在室温下(22℃)分别孵育30 min和7 d；Aβ1-40分别与TA9901、VE乳化液及TA9901+VE乳化液的混合孵育液各20 μL(Aβ1-40的终浓度为1.0 mg/mL，百分浓度比：Aβ1-40∶TA9901∶VE=1∶1∶1)在相同条件下共同孵育7 d，孵育后各样品均经过真空冷冻干燥处理。
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二、 FT-IR分析及曲线拟合
取出上述冷冻干燥处理后的Aβ1-40与无水溴化钾(约150～200 mg)充分混合，在约1333.22 Pa/cm2的压力下加压15 min形成溴化钾压片。用Nicolet Magna 760 FT-IR谱仪对其进行测量和分析，分辨率为4 cm-1，扫描累加400次，光谱观察范围为4 000～200 cm-1。主要测量1 700～1 600 cm-1范围内酰胺I谱带，从原谱得出二阶导数谱和去卷积谱，所用参数为半高宽18 cm-1，分辨增强因子K为2.2，去卷积谱和二阶导数谱峰位基本相同。根据二阶导数谱采用Gauss和Lorentz功能对原谱进行曲线拟合，拟合符合率以均方根误差RMS显示<0.01为止，去卷积及曲线拟合步骤均按软件包(OPUS, version2.0)程序进行。由于样品成分的复杂性，考虑到酰胺I带附近的振动峰对二级结构的影响，拟合范围扩大到1 750～1 550 cm-1。
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结 果
傅里叶变换红外光谱法是近十几年发展起来的能对蛋白质的二级结构进行定量研究的方法，最多用于二级结构分析的红外谱带为酰胺I带，位于1 700～1 600 cm-1之间，主要涉及C=O的伸缩振动。根据Byler等[6]和Susi等[7]以及Krimm等[8]的研究，指认各子峰位置与二级结构成分的对应关系为：(1694±2) cm-1、(1689±2) cm-1、(1683±2) cm-1、(1671±3) cm-1、(1663±4) cm-1为转角结构，(1653±4) cm-1为α-螺旋，(1645±4) cm-1为自由卷曲(无序结构)，(1675±5) cm-1及(1630±10) cm-1为伸展肽链(β-折叠片)。据此，将各组相关峰位的指认和面积列于表1。
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图1A显示Aβ1-40单独孵育30 min的FT-IR光谱及曲线拟合谱，其强峰位于1635 cm-1附近，1688 cm-1处也有较强的吸收，1608 cm-1和1584 cm-1处的峰位与二级结构关系不大，属于氨基酸侧链的振动，其二级结构定量分析结果为：43.17%为β-折叠片，32.9%为β-转角，9.06%属α-螺旋， 14.35%为自由卷曲。老化7 d的Aβ1-40光谱(图1B)与老化30min的光谱比较，强峰位移至1628 cm-1附近，1688 cm-1峰向高波数方向偏移形成1695cm-1处的吸收，1676cm-1处新峰的出现与二级结构的转化有关。1610cm-1和1586cm-1为侧链振动吸收。定量分析结果主要是β-折叠片结构增加(53.2%)，β-转角量(32.5%)与α-螺旋(8.95%)基本不变，自由卷曲含量减少(5.24%)，表明老化处理对Aβ分子结构的影响总的趋向是使自由卷曲结构向β-折叠片转化。
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表1 Aβ1-40FT-IR拟合谱与二级结构相关的波数和面积
Tab 1 FT-IR band wavenumbers and areas of Aβ1-40 Fig 1A
cm-1
1621.70
1635.10
1646.80
1656.30
1666.60
1681.10
1688.40
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%
18.97
24.20
14.75
9.06
8.30
4.60
20.00
Fig 1B
cm-1
1628.00
1639.30
, http://www.100md.com 1647.00
1654.50
1663.50
1676.70
1695.50
%
25.50
11.10
5.24
8.95
11.10
16.60
21.40
, http://www.100md.com
Fig 2A
cm-1
1620.60
1632.40
1647.30
1659.90
1682.10
1693.00
%
10.30
16.10
16.10
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33.80
19.10
4.40
Fig 2B
cm-1
1621.00
1632.10
1646.90
1658.20
1680.50
1696.90
%
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9.40
21.40
18.90
18.90
7.50
23.90
Fig 2C
cm-1
1629.00
1648.40
1658.90
1671.80
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1682.20
1692.70
%
55.00
14.40
13.75
8.75
3.56
4.40
Assignment
E
E
U
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H
T
E
T
T
H: total helix; E: extended chain; T: turns; U: unorder structure
Fig 1A FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) for 30 min
图 1A Aβ1-40在PBS(pH7.4)溶液中老化30 min的FT-IR光谱
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Fig 1B FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) for 7 days
图 1B Aβ1-40在PBS(pH7.4)溶液中老化7 d的FT-IR光谱
图2A为TA9901与Aβ1-40共同孵育7 d的FT-IR光谱，其强峰位于1659 cm-1处，1693 cm-1和1620 cm-1附近的吸收均为弱吸收，1682 cm-1处的吸收峰与老化30 min光谱中的1681 cm-1峰位相似，无老化7 d光谱中1676 cm-1处的吸收峰。1614 cm-1为侧链振动吸收。这种峰位及其强弱的变化反映了Aβ1-40二级结构组成的变化。与单纯Aβ老化处理7 d的定量结果相比，β-转角(23.5%)及β-折叠片(26.4%)的含量显著下降， α-螺旋(33.8%)和自由卷曲(16.1%)的含量明显增高，即呈现β-折叠向α-螺旋和自由卷曲方向的转化。
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VE对Aβ1-40老化的二级结构的影响见图2B。其强峰位于1696cm-1及1632cm-1附近,与Aβ单独老化7 d相比，VE对峰位和峰数的影响与TA9901相似，提示它们可能存在相同的作用机制,但其强弱有所不同。定量分析结果主要是β-折叠片(30.8%)含量下降，β-转角(31.4%)的量基本不变，α-螺旋(18.9%)与自由卷曲(18.9%)含量增加。与TA9901对整个Aβ结构的影响有两点不同：(1)α-螺旋增加和β-折叠减少的百分比要小于TA9901的影响。(2)对β-结构的作用主要表现是减少了β-折叠片，而对β-转角影响不大。
TA9901和VE联用对老化Aβ1-40二级结构的影响较为复杂(图2C)。其特点是在1629cm-1处产生强达55%的吸收，与Aβ1-40单独老化7 d的光谱比较，缺乏TA9901和VE处理样本中1621 cm-1或Aβ1-40单独老化7 d样本中1639 cm-1处的吸收峰。此外， 在1671 cm-1处出现了被指认为β-转角的新的吸收峰。与Aβ1-40老化7 d的结果比较，主要表现为β-转角结构(16.7%)含量下降，α-螺旋(13.75%)及自由卷曲(14.4%)有所增加。
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Fig 2A FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) with TA9901 for 7 days (percent ratio: Aβ1-40∶TA9901=1∶1)
图 2A Aβ1-40在含TA9901的PBS(pH7.4)溶液中老化7 d的FT-IR光谱
Fig 2B FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) with VE for 7 days (percent ratio: Aβ1-40∶VE=1∶1)
图 2B Aβ1-40在含VE乳化液的PBS(pH7.4)溶液中老化7 d的FT-IR光谱
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Fig 2C FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) with TA9901 and VE for 7 days (percent ratio: Aβ1-40∶TA9901∶VE=1∶1∶1)
图 2C Aβ1-40在含TA9901+VE乳化液的PBS(pH7.4)溶液中老化7 d的FT-IR光谱
讨 论
我们用电镜观察显示，Aβ老化处理后出现大量的Aβ纤维(待发表)。而本实验结果证实Aβ老化时其二级结构中β-折叠结构的含量明显增加，出现自由卷曲向β-折叠转化。表明β-折叠结构的增加与Aβ的聚集和纤维形成有密切联系。Barrow等[9]证实，Aβ二级结构在某些因素的作用下可出现α-螺旋、自由卷曲与β-结构之间的转化，这种转化与可溶性单聚体逐渐聚集有关。影响其转化平衡的因素包括环境的pH值、蛋白质结构的化学修饰或与其他病理相关蛋白如水解糖蛋白、载脂蛋白E的结合等。另外，Aβ肽链氨基酸序列自身结构的变化，如遗传性AD患者因APP基因突变导致Aβ氨基酸序列的改变，也会影响Aβ的二级结构。在本研究中，TA9901及VE对老化的Aβ二级结构的影响可能属于一种化学修饰作用，这与它们的抗氧化特性有关。有资料表明Aβ在老化过程中能产生自由基[10]，通过活化氧分子包括单线态氧、超氧阴离子和羟自由基等的能量传递，改变氨基酸残基的疏水性和电荷数，从而影响蛋白质的二级结构，使β-结构含量增加[11]。TA9901和VE均属酚类抗氧化剂，其酚羟基中的活泼氢原子易释放并与活性氧分子结合，阻止其能量传递，使平衡由β-结构向α-螺旋或自由卷曲转化。TA9901和VE对老化Aβ1-40二级结构的不同影响，可能与它们抗氧化能力的强弱及在Aβ1-40上的结合位点不同有关。TA9901含多个酚羟基，存在多个活性供氢位点，可与β-转角或β-折叠片上的活性位点结合，从而影响这些结构的形成。VE只含有一个酚羟基，其在Aβ1-40上的结合位点可能主要存在于β-折叠片上，因而主要对β-折叠片的结构产生影响而对β-转角的影响较小。TA9901与VE共同作用的结果并没有使β-结构的含量进一步减少，可能是二者在β-折叠片上存在竞争性的结合位点，VE的存在削弱了TA9901对β-折叠片形成的抑制效应，相对增强了TA9901对β-转角形成的抑制，也可能是TA9901和VE对肽链多位点的质子化增加了疏水性成分的相互作用，使β-折叠片含量增加。
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已有研究表明， α-螺旋、自由卷曲和β-结构之间的转换与可溶性的Aβ单聚体和不溶性的Aβ纤维之间的平衡密切相关，Aβ单聚体通过β-结构间的相互作用，聚集形成Aβ纤维[12]，β-结构减少则可阻止Aβ单聚体聚集成为Aβ纤维。由于TA9901能显著减少β-结构成份，因此它能显著抑制Aβ纤维的形成，且其抑制效果要明显强于 VE。
总之，本实验结果表明，TA9901能抑制Aβ老化时β-结构的形成，促使β-结构向α-螺旋或自由卷曲方向转化。提示TA9901通过干预β-折叠结构的形成阻止Aβ的聚集和纤维化。
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 2000-03-15 [修回日期] 2000-05-18
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单位：(中山医科大学解剖学教研室，广东 广州 510089)
关键词：阿尔茨海默病；淀粉样β-蛋白；抗氧化药；光谱，傅里叶变换红外
中国病理生理杂志000616
[摘 要] 目的：研究抗氧化剂TA9901抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集和纤维形成的机制。方法：运用傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)和曲线拟合法定量研究TA9901对Aβ1-40无细胞液体外老化过程中二级结构变化的影响。结果：Aβ单独老化30 min，β-折叠片含量为43.17%， β-转角为32.9%。Aβ单独老化7 d，β-折叠片增加约10%，出现自由卷曲向β-折叠转化。TA9901与Aβ1-40共同孵育，β-转角和β-折叠片的含量分别为23.5%和26.4%。维生素E的存在主要减少了β-折叠片的含量(30.8%)，而二者联用使β-转角的量(16.7%)明显下降。结论：TA9901和VE均能抑制β-折叠的形成，但以TA9901对β-转角和β-折叠片的抑制作用较为强烈，提示其抑制Aβ的聚集和纤维形成的机制可能与抑制Aβ分子中β-折叠结构的形成有关。
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[中图分类号] R364； R394 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0540-05
Effect of antioxidants on secondary conformational transition of aged amyloid β-peptide1-40 by FT-IR quantitative study
YU Zhao-xue, YAO Zhi-bin
(Department of Anatomy, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
[Abstract] AIM: To investigate the mechanism that antioxidants TA9901, inhibit the formation of amyloid-β-protein(Aβ) fibril. METHODS: Fourier-transform infrared spectroscopy was used to study the secondary structure changes on aging Aβ in vitro. RESULTS: Aβ aged alone for 30 min, the content of β-pleated sheet and β-turn were 43.17% and 32.9% respectively. Aβ aged alone for 7 days, the content of β-pleated sheet increased abuot 10% and produced a shift of random coil toward β-pleated sheet. TA9901 induced a significant decrease of the content of β-turn (23.5%) and β-pleated sheet (26.4%). VE mainly decreased the β-pleated sheet content (30.8%). The combination of TA9901 and VE promoted transition of β-turn (16.7%) toward α-helix and random coil. CONCLUSIONS: Both of TA9901 and VE can effectively diminish the β-structural content. TA9901 showed more intensitive inhibition than VE. The effect of TA9901 on the secondary structure of aged Aβ was associated with the mechanism that TA9901 inhibited Aβ aggregation and fibril formation.
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[MeSH] Alzheimer's disease； Amyloid beta-protein; Antioxidants; Spectra, Fourier transform infrared
β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)在脑内的纤维状沉积是老年性痴呆(Alzheimer's disease，AD)的主要病理变化。已有相当多的资料表明，这种淀粉样沉积在AD的发病过程中起着非常重要的作用[1]，并可能与细胞骨架蛋白变性及神经元损伤有关。Aβ是一个含39～43个氨基酸的多肽，由其前体蛋白(amyloid β-precursor protein, APP)裂解而来，其二级结构主要包括α-螺旋，自由卷曲，β-转角和伸展结构(β-折叠片)。Aβ二级结构的改变是影响Aβ聚集和纤维形成的重要因素。通常以β-折叠结构为主的Aβ能快速的聚集，而以α-螺旋、自由卷曲结构为主的Aβ则聚集缓慢[2,3]。合成的Aβ或从老年斑中分离出的蛋白能自发地聚集成典型的直径的为6～10 nm的淀粉样纤维，这种纤维的二级结构主要为β-折叠结构[4]，这与天然的AD样或其他已知的淀粉蛋白的结构相一致[5]。因此，干预β-折叠结构的形成以减少Aβ的聚集和淀粉样纤维的沉积是进行AD病理治疗的理想方法。寻找能有效的干预β-折叠结构的形成，阻止淀粉样纤维的产生的物质是实施这一病理治疗策略的关键。
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我们最近的研究已经证实，抗氧化剂TA9901能有效的抑制Aβ聚集和纤维形成(待发表)。为进一步探讨TA9901抑制Aβ纤维化的作用机制，本研究运用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)及曲线拟合法，定量研究TA9901和维生素E(Vitamin E, VE)对Aβ1-40无细胞孵育液体外老化过程中二级结构变化的影响。
材 料 和 方 法
一、 样品处理
Aβ1-40为Sigma公司产品， 参照Fraser 和Barrow等人的实验[4,9,11]，取1.0 mg/mL Aβ1-40溶液(50 mmol/L PBS配制， pH 7.4)各20 μL，在室温下(22℃)分别孵育30 min和7 d；Aβ1-40分别与TA9901、VE乳化液及TA9901+VE乳化液的混合孵育液各20 μL(Aβ1-40的终浓度为1.0 mg/mL，百分浓度比：Aβ1-40∶TA9901∶VE=1∶1∶1)在相同条件下共同孵育7 d，孵育后各样品均经过真空冷冻干燥处理。
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二、 FT-IR分析及曲线拟合
取出上述冷冻干燥处理后的Aβ1-40与无水溴化钾(约150～200 mg)充分混合，在约1333.22 Pa/cm2的压力下加压15 min形成溴化钾压片。用Nicolet Magna 760 FT-IR谱仪对其进行测量和分析，分辨率为4 cm-1，扫描累加400次，光谱观察范围为4 000～200 cm-1。主要测量1 700～1 600 cm-1范围内酰胺I谱带，从原谱得出二阶导数谱和去卷积谱，所用参数为半高宽18 cm-1，分辨增强因子K为2.2，去卷积谱和二阶导数谱峰位基本相同。根据二阶导数谱采用Gauss和Lorentz功能对原谱进行曲线拟合，拟合符合率以均方根误差RMS显示<0.01为止，去卷积及曲线拟合步骤均按软件包(OPUS, version2.0)程序进行。由于样品成分的复杂性，考虑到酰胺I带附近的振动峰对二级结构的影响，拟合范围扩大到1 750～1 550 cm-1。
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结 果
傅里叶变换红外光谱法是近十几年发展起来的能对蛋白质的二级结构进行定量研究的方法，最多用于二级结构分析的红外谱带为酰胺I带，位于1 700～1 600 cm-1之间，主要涉及C=O的伸缩振动。根据Byler等[6]和Susi等[7]以及Krimm等[8]的研究，指认各子峰位置与二级结构成分的对应关系为：(1694±2) cm-1、(1689±2) cm-1、(1683±2) cm-1、(1671±3) cm-1、(1663±4) cm-1为转角结构，(1653±4) cm-1为α-螺旋，(1645±4) cm-1为自由卷曲(无序结构)，(1675±5) cm-1及(1630±10) cm-1为伸展肽链(β-折叠片)。据此，将各组相关峰位的指认和面积列于表1。
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图1A显示Aβ1-40单独孵育30 min的FT-IR光谱及曲线拟合谱，其强峰位于1635 cm-1附近，1688 cm-1处也有较强的吸收，1608 cm-1和1584 cm-1处的峰位与二级结构关系不大，属于氨基酸侧链的振动，其二级结构定量分析结果为：43.17%为β-折叠片，32.9%为β-转角，9.06%属α-螺旋， 14.35%为自由卷曲。老化7 d的Aβ1-40光谱(图1B)与老化30min的光谱比较，强峰位移至1628 cm-1附近，1688 cm-1峰向高波数方向偏移形成1695cm-1处的吸收，1676cm-1处新峰的出现与二级结构的转化有关。1610cm-1和1586cm-1为侧链振动吸收。定量分析结果主要是β-折叠片结构增加(53.2%)，β-转角量(32.5%)与α-螺旋(8.95%)基本不变，自由卷曲含量减少(5.24%)，表明老化处理对Aβ分子结构的影响总的趋向是使自由卷曲结构向β-折叠片转化。
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表1 Aβ1-40FT-IR拟合谱与二级结构相关的波数和面积
Tab 1 FT-IR band wavenumbers and areas of Aβ1-40 Fig 1A
cm-1
1621.70
1635.10
1646.80
1656.30
1666.60
1681.10
1688.40
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%
18.97
24.20
14.75
9.06
8.30
4.60
20.00
Fig 1B
cm-1
1628.00
1639.30
, http://www.100md.com 1647.00
1654.50
1663.50
1676.70
1695.50
%
25.50
11.10
5.24
8.95
11.10
16.60
21.40
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Fig 2A
cm-1
1620.60
1632.40
1647.30
1659.90
1682.10
1693.00
%
10.30
16.10
16.10
, http://www.100md.com
33.80
19.10
4.40
Fig 2B
cm-1
1621.00
1632.10
1646.90
1658.20
1680.50
1696.90
%
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9.40
21.40
18.90
18.90
7.50
23.90
Fig 2C
cm-1
1629.00
1648.40
1658.90
1671.80
, 百拇医药
1682.20
1692.70
%
55.00
14.40
13.75
8.75
3.56
4.40
Assignment
E
E
U
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H
T
E
T
T
H: total helix; E: extended chain; T: turns; U: unorder structure
Fig 1A FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) for 30 min
图 1A Aβ1-40在PBS(pH7.4)溶液中老化30 min的FT-IR光谱
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Fig 1B FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) for 7 days
图 1B Aβ1-40在PBS(pH7.4)溶液中老化7 d的FT-IR光谱
图2A为TA9901与Aβ1-40共同孵育7 d的FT-IR光谱，其强峰位于1659 cm-1处，1693 cm-1和1620 cm-1附近的吸收均为弱吸收，1682 cm-1处的吸收峰与老化30 min光谱中的1681 cm-1峰位相似，无老化7 d光谱中1676 cm-1处的吸收峰。1614 cm-1为侧链振动吸收。这种峰位及其强弱的变化反映了Aβ1-40二级结构组成的变化。与单纯Aβ老化处理7 d的定量结果相比，β-转角(23.5%)及β-折叠片(26.4%)的含量显著下降， α-螺旋(33.8%)和自由卷曲(16.1%)的含量明显增高，即呈现β-折叠向α-螺旋和自由卷曲方向的转化。
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VE对Aβ1-40老化的二级结构的影响见图2B。其强峰位于1696cm-1及1632cm-1附近,与Aβ单独老化7 d相比，VE对峰位和峰数的影响与TA9901相似，提示它们可能存在相同的作用机制,但其强弱有所不同。定量分析结果主要是β-折叠片(30.8%)含量下降，β-转角(31.4%)的量基本不变，α-螺旋(18.9%)与自由卷曲(18.9%)含量增加。与TA9901对整个Aβ结构的影响有两点不同：(1)α-螺旋增加和β-折叠减少的百分比要小于TA9901的影响。(2)对β-结构的作用主要表现是减少了β-折叠片，而对β-转角影响不大。
TA9901和VE联用对老化Aβ1-40二级结构的影响较为复杂(图2C)。其特点是在1629cm-1处产生强达55%的吸收，与Aβ1-40单独老化7 d的光谱比较，缺乏TA9901和VE处理样本中1621 cm-1或Aβ1-40单独老化7 d样本中1639 cm-1处的吸收峰。此外， 在1671 cm-1处出现了被指认为β-转角的新的吸收峰。与Aβ1-40老化7 d的结果比较，主要表现为β-转角结构(16.7%)含量下降，α-螺旋(13.75%)及自由卷曲(14.4%)有所增加。
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Fig 2A FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) with TA9901 for 7 days (percent ratio: Aβ1-40∶TA9901=1∶1)
图 2A Aβ1-40在含TA9901的PBS(pH7.4)溶液中老化7 d的FT-IR光谱
Fig 2B FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) with VE for 7 days (percent ratio: Aβ1-40∶VE=1∶1)
图 2B Aβ1-40在含VE乳化液的PBS(pH7.4)溶液中老化7 d的FT-IR光谱
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Fig 2C FT-IR spectra of Aβ1-40 in PBS(pH7.4) with TA9901 and VE for 7 days (percent ratio: Aβ1-40∶TA9901∶VE=1∶1∶1)
图 2C Aβ1-40在含TA9901+VE乳化液的PBS(pH7.4)溶液中老化7 d的FT-IR光谱
讨 论
我们用电镜观察显示，Aβ老化处理后出现大量的Aβ纤维(待发表)。而本实验结果证实Aβ老化时其二级结构中β-折叠结构的含量明显增加，出现自由卷曲向β-折叠转化。表明β-折叠结构的增加与Aβ的聚集和纤维形成有密切联系。Barrow等[9]证实，Aβ二级结构在某些因素的作用下可出现α-螺旋、自由卷曲与β-结构之间的转化，这种转化与可溶性单聚体逐渐聚集有关。影响其转化平衡的因素包括环境的pH值、蛋白质结构的化学修饰或与其他病理相关蛋白如水解糖蛋白、载脂蛋白E的结合等。另外，Aβ肽链氨基酸序列自身结构的变化，如遗传性AD患者因APP基因突变导致Aβ氨基酸序列的改变，也会影响Aβ的二级结构。在本研究中，TA9901及VE对老化的Aβ二级结构的影响可能属于一种化学修饰作用，这与它们的抗氧化特性有关。有资料表明Aβ在老化过程中能产生自由基[10]，通过活化氧分子包括单线态氧、超氧阴离子和羟自由基等的能量传递，改变氨基酸残基的疏水性和电荷数，从而影响蛋白质的二级结构，使β-结构含量增加[11]。TA9901和VE均属酚类抗氧化剂，其酚羟基中的活泼氢原子易释放并与活性氧分子结合，阻止其能量传递，使平衡由β-结构向α-螺旋或自由卷曲转化。TA9901和VE对老化Aβ1-40二级结构的不同影响，可能与它们抗氧化能力的强弱及在Aβ1-40上的结合位点不同有关。TA9901含多个酚羟基，存在多个活性供氢位点，可与β-转角或β-折叠片上的活性位点结合，从而影响这些结构的形成。VE只含有一个酚羟基，其在Aβ1-40上的结合位点可能主要存在于β-折叠片上，因而主要对β-折叠片的结构产生影响而对β-转角的影响较小。TA9901与VE共同作用的结果并没有使β-结构的含量进一步减少，可能是二者在β-折叠片上存在竞争性的结合位点，VE的存在削弱了TA9901对β-折叠片形成的抑制效应，相对增强了TA9901对β-转角形成的抑制，也可能是TA9901和VE对肽链多位点的质子化增加了疏水性成分的相互作用，使β-折叠片含量增加。
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已有研究表明， α-螺旋、自由卷曲和β-结构之间的转换与可溶性的Aβ单聚体和不溶性的Aβ纤维之间的平衡密切相关，Aβ单聚体通过β-结构间的相互作用，聚集形成Aβ纤维[12]，β-结构减少则可阻止Aβ单聚体聚集成为Aβ纤维。由于TA9901能显著减少β-结构成份，因此它能显著抑制Aβ纤维的形成，且其抑制效果要明显强于 VE。
总之，本实验结果表明，TA9901能抑制Aβ老化时β-结构的形成，促使β-结构向α-螺旋或自由卷曲方向转化。提示TA9901通过干预β-折叠结构的形成阻止Aβ的聚集和纤维化。
[参 考 文 献]
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[收稿日期] 2000-03-15 [修回日期] 2000-05-18
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