小鼠睾丸Ⅳ型胶原的合成与分布
宋阳 许增禄 崔丽 刘霄 徐健 钱晓菁 黄玉苓
摘 要 目的 研究小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布。方法 应用生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光法和原位杂交法检测幼年、成年及老年小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布的变化。结果 小鼠睾丸支持细胞具有合成Ⅳ型胶原的功能，小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的含量及支持细胞内Ⅳ型胶原mRNA水平随小鼠年龄的增加而变化。15天幼鼠睾丸内含量最高，成年及老年小鼠睾丸内含量依次减少。结论 睾丸内的细胞外基质可能在生精过程中起重要作用。
关键词：胶原 睾丸 间接免疫荧光 原位杂交
睾丸内的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要包括纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(laminin，LN)、巢蛋白(entactin)、SPARC(secreted protein，acidic，and rich in cysteine)、蛋白多糖和Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原等[1～4]，与精子发生和生精细胞的分化具有密切关系，曲细精管基膜是睾丸内ECM的主要分布位置，Ⅳ型胶原是基膜内含量最丰富的ECM成分。在睾丸内，支持细胞(Sertoli cell，SC)和管周肌样细胞(Peritublar cell，PC)可以产生ECM[5]。本研究采用生物素-抗生物素蛋白DCS(avidin D cell sorter)体系间接免疫荧光法和原位杂交法检测各年龄段小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布，以阐明ECM在生精过程中的重要作用，并试图对其作用机制进行初步探讨。
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1 材料和方法
实验分组 体内实验：实验动物为昆明小鼠，按年龄分为4组：(1)新生鼠，出生后5 d; (2) 幼鼠，出生后15 d； (3) 成年鼠，3个月； (4) 老年鼠，18个月。体外实验：培养的支持细胞来自出生后10 d的昆明小鼠。各年龄段使用动物数8～12只。
支持细胞的分离与培养 支持细胞分离参照Hadley等[6]方法进行。用培养液悬浮细胞，用吸管将细胞接种在有盖玻片的培养瓶内，于31℃，5%CO2条件下培养10～14 d。分离培养的细胞存在核卫星小体，可鉴定为支持细胞。
生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色
组织切片的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色：参照许增禄[7]法。应用兔抗小鼠Ⅳ型胶原为第一抗体，生物素化的山羊抗兔IgG为第二抗体。染色后滴加甘油封片剂(含10%PBS和1%对苯基二胺)封片，OLYMPUS反射式荧光显微镜下观察，Kodak 400ASA胶卷照相。
, 百拇医药
体外培养的SC生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色：将长有SC的盖玻片从培养瓶内取出，D-Hank液洗1次，放入丙酮固定20 s，PBS洗2次，每次5 min，然后加用PBS配制的10%山羊血清于4℃孵育20 min，以下操作同上。
原位杂交
cDNA探针的制备：含小鼠α1(Ⅳ)cDNA(1.8 kb)的重组质粒PE123由预防医学科学院劳动卫生研究所刘秉慈教授惠赠。按文献[8]方法转染细菌后，大量制备质粒，用相应内切酶酶解质粒后，再用低融点琼脂糖法回收cDNA片段。
缺口平移法标记探针：应用缺口平移试剂盒(华美公司)，依照说明书将α-35S-dATP标记到探针上，标记探针经Sephadex G-50柱层析后回收，标记探针的比活性达2.78×106Bq/μg。
, 百拇医药
组织cDNA-mRNA原位杂交：采用林月珍等[9]方法。
新鲜睾丸组织制成冰冻切片，经原位杂交后，放射自显影及HE复染，树胶封片，OLYMPUS光学显微镜观察，Kodak 100ASA胶卷照相。
体外培养的SC的原位杂交：将长有SC的盖玻片从培养瓶内取出，直接放入PBS配制的4%多聚甲醛中固定20 min，以下操作同组织cDNA-mRNA原位杂交。
阴性对照标本的设置：
A.杂交液中无标记探针的空白对照。
B.以标记的λDNA代替目的探针。
原位杂交结果的半定量及统计学处理：每个动物取1张切片，则每个年龄组为8张切片，在每张切片上取左上、右上、中、左下、右下5个区域(n=40)，在400×下计数银颗粒数，结果以银颗粒数/10000 μm2表示。实验数据以均数±标准差(
±s)表示，用t检验进行组间比较，P<0.05为差异有显著性意义。
, 百拇医药
2 结果
细胞免疫化学结果
组织切片的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色结果：5天小鼠曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光最弱，呈薄层状围绕曲细精管，血管基膜处亦有荧光存在(图1a)，15天小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光最强(图1b)，3及18个月小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光依次减弱(图1c)。对照染色标本未见荧光。
图1 Ⅳ型胶原抗体在小鼠睾丸冰冻切片上的间接免疫荧光染色结果
Fig 1 Immunofluorescent photomicrograph of frozen section of testis in mouse stained with antibody
, 百拇医药
against type Ⅳ collagen ×200
a.5-day-old mouse; b.15-day-old mouse; c.18-month-old mouse
体外培养SC的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色结果：体外培养的SC胞质内和胞膜上可见中等强度的Ⅳ型胶原的荧光，胞核处无荧光(图2)。对照染色标本未见荧光。
图2 Ⅳ型胶原抗体在培养小鼠睾丸SC上间接免疫荧光染色结果
Fig 2 Immunofluorescent photomicrograph of cultured SC stained with antibody against type Ⅳ collagen ×200
, 百拇医药
原位杂交结果
组织切片的原位杂交结果：杂交银颗粒主要位于小鼠睾丸支持细胞胞质内。15天小鼠睾丸内Ⅳ型胶原cDNA-mRNA杂交银颗粒密度最高(图3a)，3和18个月小鼠睾丸内杂交银颗粒密度依次减弱(图3b)。阴性对照实验几乎看不见杂交银颗粒。
图3 原位杂交法显示小鼠睾丸内Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)mRNA的分布(以Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)cDNA为探针)
Fig 3 Distribution of type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) mRNA in testis in mouse，as detected by in situ hybridization with type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) cDNA probe ×400
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a.15-day old mouse; b.18-month old mouse
体外培养的SC的原位杂交结果：体外培养的SC胞质内可见较高密度的Ⅳ型胶原cDNA-mRNA杂交银颗粒(图4a)，阴性对照实验几乎看不见杂交银颗粒(图4b)。
图4 原位杂交法显示培养小鼠睾丸支持细胞内Ⅳ型胶原α1(Ⅳ) mRNA的分布(以Ⅳ型胶原α1(Ⅳ) cDNA为探针)
Fig 4 Distribution of type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) mRNA in cultured SC，as detected by in situ hybridization with type Ⅳ collagen α1(Ⅳ)cDNA probe ×400
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a.positive signals; b.negative control
原位杂交结果的半定量及统计学处理：15天、3和18个月小鼠银颗粒数分别为(492.98±63.48)、(248.85±42.70)和(177.53±40.54)/10000 μm2，3个月与15天比较P<0.001，18个月与3个月比较P<0.001。
3 讨论
Ⅳ型胶原为小鼠睾丸基膜中含量最丰富的ECM成分，它形成基膜的结构网架。基膜中最常见的分子组成是[α1(Ⅳ)]2 α2(Ⅳ)，为三螺旋型的三聚体[10]。由于基膜中Ⅳ型胶原分子含两条α1(Ⅳ)链，所以本研究原位杂交所用的探针为α1(Ⅳ) cDNA探针，这样可以较高效率地检测出小鼠睾丸基膜中Ⅳ型胶原的mRNA水平。Ⅳ型胶原是基膜中最主要，也是含量最丰富的ECM成分，而基膜又是ECM的特殊型，本研究进一步探讨小鼠睾丸中基膜的组成和功能是否随年龄而变化。
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小鼠睾丸中ECM随小鼠的年龄而变化，小鼠睾丸的发育、生长、成熟、衰老都离不开ECM的参与和作用。胚胎12.5 d时，SC和前精原细胞一起从生精索分化出来。此时，发育着的生精索通过位于生精上皮基底面的基板与间充质分开。已证明此第一基板包括LN、Ⅲ和Ⅳ型胶原、FN和硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)[11]。由此可见，SC的分化和ECM的产生是同时进行的。生后10 d左右，电镜观察到第二基板位于分化着的PC和淋巴内皮细胞间[12]。15 d小鼠睾丸内Ⅳ型胶原mRNA的水平处于高峰，这是由于此时小鼠处于青春前期，生殖系统发育迅速，需要合成足量的Ⅳ型胶原来满足生殖系统发育的需求。3个月小鼠睾丸内Ⅳ型胶原mRNA的含量又回到较低水平，这可能是由于此时小鼠处于性成熟期，睾丸内曲细精管的管径已达到顶峰，不再增粗，睾丸的各项生理功能及各种结构已经稳定，合成与降解达到平衡，对ECM合成的需求与青春前期相比有所降低。
本研究体外实验部分证明：SC具有合成和分泌Ⅳ型胶原的功能，这与以前的研究结果[6]一致。在小鼠发育的不同年龄阶段，SC的功能与Ⅳ型胶原的合成量密切相关，并随着小鼠年龄的变化而变化。如上所述，在小鼠胚胎12.5 d时，SC和前精原细胞一起从生精索中分化出来，此时由ECM组成的第一基板出现[11]；在小鼠睾丸发育的新生阶段PC分化出来，含有ECM成分的第二基板也随后出现[12]。由此可见，SC和PC的分化与ECM的产生密切相关，并在小鼠的睾丸发育、生精上皮的形成及生精功能的启动过程中起重要作用。
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ECM具有重要的生物活性，参与细胞的迁移、粘附、增殖和分化，介导细胞与细胞间、细胞与生物大分子间的相互作用，从而在各种生理和病理过程中发挥重要作用[10]。睾丸中的ECM作为曲细精管基膜的组成成分而参与血睾屏障的构成，它还作为细胞间传递信息的信号，介导SC、PC和睾丸间质细胞间的相互作用，睾丸中ECM与精子的发生和生精细胞的分化有着密切的关系[1，5]。另外，ECM具有促进迁移和粘附的功能，它可以促进生精细胞从管壁移向管腔，逐渐走向成熟[5]。可见ECM对精子生成具有重要的作用，其作用机制还有待进一步深入研究。
△国家自然科学基金(39270380)资助
许增禄为通讯作者
作者单位：宋阳 许增禄 刘霄 徐健 钱晓菁 黄玉苓 (中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎学室，北京 100005)
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崔丽 (白求恩医科大学组织胚胎学教研室)
参考文献
1 Hadley MA，Dym M.Immunocytochemistry of extracellular matrix in the lamina propria of the rat testis: electron microscopic localization.Biol Reprod，1987，37(5): 1283～1289
2 Vernon RB，Sage H.The calcium-binding protein SPARC is secreted by Leydig and Sertoli cells of the adult mouse testis.Biol Reprod，1989，40(6): 1329～1340
3 Lian G，Miller KA，Enders GC.Localization and synthesis of entactin in seminiferous tubules of the mouse.Biol Reprod，1992，47(2): 316～325
, 百拇医药
4 Paranko J.Expression of type Ⅰ and Ⅲ collagen during morphogensis of fetal rat testis and ovary.Anat Rec，1987，219(1): 91～101
5 Skinner MK，Tung PS，Fritz IB.Cooperativity between Sertoli cells and testicular peritubular cells in the production and deposition of extracellular matrix components.J Cell Biol，1985，100(5); 1941～1947
6 Hadely MA，Byers SW，Suarez-Quian CA，et al.Extracellular matrix regulates Sertoli cell differentiation，testicular cord formation，and germ cell development in vitro.J Cell Biol，1985，101(6): 1511～1522
, http://www.100md.com
7 Xu Zenglu，Parker SB，Minkoff R.Distribution of type Ⅳ collagen，laminin and fibronectin during maxillary process formation in the chick embryo.Am J Anat，1990，187(3): 232～246
8 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.95～155
9 林月珍，丁 濂，阿晋彦.一种简化的原位核酸杂交法.中华病理学杂志，1993，22(5): 305～306
10 李玉瑞主编.细胞外间质的生物化学及研究方法.北京：人民卫生出版社，1988.1～44
11 Pelliniemi LJ，Frojdman K，Paranko J.Embryological and prenatal development and functions of Sertoli cells.In: Russell LD，Griswold MD eds.The Sertoli cell clearwater.FL: Cache River Press，1993.87～114
12 Leeson CR，Leeson TS.The postnatal development and differentiation of the boundary tissue of the seminiferous tubule of the rat.Anat Rec，1963，147(3):243～259, 百拇医药
摘 要 目的 研究小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布。方法 应用生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光法和原位杂交法检测幼年、成年及老年小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布的变化。结果 小鼠睾丸支持细胞具有合成Ⅳ型胶原的功能，小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的含量及支持细胞内Ⅳ型胶原mRNA水平随小鼠年龄的增加而变化。15天幼鼠睾丸内含量最高，成年及老年小鼠睾丸内含量依次减少。结论 睾丸内的细胞外基质可能在生精过程中起重要作用。
关键词：胶原 睾丸 间接免疫荧光 原位杂交
睾丸内的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要包括纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(laminin，LN)、巢蛋白(entactin)、SPARC(secreted protein，acidic，and rich in cysteine)、蛋白多糖和Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原等[1～4]，与精子发生和生精细胞的分化具有密切关系，曲细精管基膜是睾丸内ECM的主要分布位置，Ⅳ型胶原是基膜内含量最丰富的ECM成分。在睾丸内，支持细胞(Sertoli cell，SC)和管周肌样细胞(Peritublar cell，PC)可以产生ECM[5]。本研究采用生物素-抗生物素蛋白DCS(avidin D cell sorter)体系间接免疫荧光法和原位杂交法检测各年龄段小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布，以阐明ECM在生精过程中的重要作用，并试图对其作用机制进行初步探讨。
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1 材料和方法
实验分组 体内实验：实验动物为昆明小鼠，按年龄分为4组：(1)新生鼠，出生后5 d; (2) 幼鼠，出生后15 d； (3) 成年鼠，3个月； (4) 老年鼠，18个月。体外实验：培养的支持细胞来自出生后10 d的昆明小鼠。各年龄段使用动物数8～12只。
支持细胞的分离与培养 支持细胞分离参照Hadley等[6]方法进行。用培养液悬浮细胞，用吸管将细胞接种在有盖玻片的培养瓶内，于31℃，5%CO2条件下培养10～14 d。分离培养的细胞存在核卫星小体，可鉴定为支持细胞。
生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色
组织切片的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色：参照许增禄[7]法。应用兔抗小鼠Ⅳ型胶原为第一抗体，生物素化的山羊抗兔IgG为第二抗体。染色后滴加甘油封片剂(含10%PBS和1%对苯基二胺)封片，OLYMPUS反射式荧光显微镜下观察，Kodak 400ASA胶卷照相。
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体外培养的SC生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色：将长有SC的盖玻片从培养瓶内取出，D-Hank液洗1次，放入丙酮固定20 s，PBS洗2次，每次5 min，然后加用PBS配制的10%山羊血清于4℃孵育20 min，以下操作同上。
原位杂交
cDNA探针的制备：含小鼠α1(Ⅳ)cDNA(1.8 kb)的重组质粒PE123由预防医学科学院劳动卫生研究所刘秉慈教授惠赠。按文献[8]方法转染细菌后，大量制备质粒，用相应内切酶酶解质粒后，再用低融点琼脂糖法回收cDNA片段。
缺口平移法标记探针：应用缺口平移试剂盒(华美公司)，依照说明书将α-35S-dATP标记到探针上，标记探针经Sephadex G-50柱层析后回收，标记探针的比活性达2.78×106Bq/μg。
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组织cDNA-mRNA原位杂交：采用林月珍等[9]方法。
新鲜睾丸组织制成冰冻切片，经原位杂交后，放射自显影及HE复染，树胶封片，OLYMPUS光学显微镜观察，Kodak 100ASA胶卷照相。
体外培养的SC的原位杂交：将长有SC的盖玻片从培养瓶内取出，直接放入PBS配制的4%多聚甲醛中固定20 min，以下操作同组织cDNA-mRNA原位杂交。
阴性对照标本的设置：
A.杂交液中无标记探针的空白对照。
B.以标记的λDNA代替目的探针。
原位杂交结果的半定量及统计学处理：每个动物取1张切片，则每个年龄组为8张切片，在每张切片上取左上、右上、中、左下、右下5个区域(n=40)，在400×下计数银颗粒数，结果以银颗粒数/10000 μm2表示。实验数据以均数±标准差(
±s)表示，用t检验进行组间比较，P<0.05为差异有显著性意义。, 百拇医药
2 结果
细胞免疫化学结果
组织切片的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色结果：5天小鼠曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光最弱，呈薄层状围绕曲细精管，血管基膜处亦有荧光存在(图1a)，15天小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光最强(图1b)，3及18个月小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光依次减弱(图1c)。对照染色标本未见荧光。
图1 Ⅳ型胶原抗体在小鼠睾丸冰冻切片上的间接免疫荧光染色结果
Fig 1 Immunofluorescent photomicrograph of frozen section of testis in mouse stained with antibody
, 百拇医药
against type Ⅳ collagen ×200
a.5-day-old mouse; b.15-day-old mouse; c.18-month-old mouse
体外培养SC的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色结果：体外培养的SC胞质内和胞膜上可见中等强度的Ⅳ型胶原的荧光，胞核处无荧光(图2)。对照染色标本未见荧光。
图2 Ⅳ型胶原抗体在培养小鼠睾丸SC上间接免疫荧光染色结果
Fig 2 Immunofluorescent photomicrograph of cultured SC stained with antibody against type Ⅳ collagen ×200
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原位杂交结果
组织切片的原位杂交结果：杂交银颗粒主要位于小鼠睾丸支持细胞胞质内。15天小鼠睾丸内Ⅳ型胶原cDNA-mRNA杂交银颗粒密度最高(图3a)，3和18个月小鼠睾丸内杂交银颗粒密度依次减弱(图3b)。阴性对照实验几乎看不见杂交银颗粒。
图3 原位杂交法显示小鼠睾丸内Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)mRNA的分布(以Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)cDNA为探针)
Fig 3 Distribution of type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) mRNA in testis in mouse，as detected by in situ hybridization with type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) cDNA probe ×400
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a.15-day old mouse; b.18-month old mouse
体外培养的SC的原位杂交结果：体外培养的SC胞质内可见较高密度的Ⅳ型胶原cDNA-mRNA杂交银颗粒(图4a)，阴性对照实验几乎看不见杂交银颗粒(图4b)。
图4 原位杂交法显示培养小鼠睾丸支持细胞内Ⅳ型胶原α1(Ⅳ) mRNA的分布(以Ⅳ型胶原α1(Ⅳ) cDNA为探针)
Fig 4 Distribution of type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) mRNA in cultured SC，as detected by in situ hybridization with type Ⅳ collagen α1(Ⅳ)cDNA probe ×400
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a.positive signals; b.negative control
原位杂交结果的半定量及统计学处理：15天、3和18个月小鼠银颗粒数分别为(492.98±63.48)、(248.85±42.70)和(177.53±40.54)/10000 μm2，3个月与15天比较P<0.001，18个月与3个月比较P<0.001。
3 讨论
Ⅳ型胶原为小鼠睾丸基膜中含量最丰富的ECM成分，它形成基膜的结构网架。基膜中最常见的分子组成是[α1(Ⅳ)]2 α2(Ⅳ)，为三螺旋型的三聚体[10]。由于基膜中Ⅳ型胶原分子含两条α1(Ⅳ)链，所以本研究原位杂交所用的探针为α1(Ⅳ) cDNA探针，这样可以较高效率地检测出小鼠睾丸基膜中Ⅳ型胶原的mRNA水平。Ⅳ型胶原是基膜中最主要，也是含量最丰富的ECM成分，而基膜又是ECM的特殊型，本研究进一步探讨小鼠睾丸中基膜的组成和功能是否随年龄而变化。
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小鼠睾丸中ECM随小鼠的年龄而变化，小鼠睾丸的发育、生长、成熟、衰老都离不开ECM的参与和作用。胚胎12.5 d时，SC和前精原细胞一起从生精索分化出来。此时，发育着的生精索通过位于生精上皮基底面的基板与间充质分开。已证明此第一基板包括LN、Ⅲ和Ⅳ型胶原、FN和硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)[11]。由此可见，SC的分化和ECM的产生是同时进行的。生后10 d左右，电镜观察到第二基板位于分化着的PC和淋巴内皮细胞间[12]。15 d小鼠睾丸内Ⅳ型胶原mRNA的水平处于高峰，这是由于此时小鼠处于青春前期，生殖系统发育迅速，需要合成足量的Ⅳ型胶原来满足生殖系统发育的需求。3个月小鼠睾丸内Ⅳ型胶原mRNA的含量又回到较低水平，这可能是由于此时小鼠处于性成熟期，睾丸内曲细精管的管径已达到顶峰，不再增粗，睾丸的各项生理功能及各种结构已经稳定，合成与降解达到平衡，对ECM合成的需求与青春前期相比有所降低。
本研究体外实验部分证明：SC具有合成和分泌Ⅳ型胶原的功能，这与以前的研究结果[6]一致。在小鼠发育的不同年龄阶段，SC的功能与Ⅳ型胶原的合成量密切相关，并随着小鼠年龄的变化而变化。如上所述，在小鼠胚胎12.5 d时，SC和前精原细胞一起从生精索中分化出来，此时由ECM组成的第一基板出现[11]；在小鼠睾丸发育的新生阶段PC分化出来，含有ECM成分的第二基板也随后出现[12]。由此可见，SC和PC的分化与ECM的产生密切相关，并在小鼠的睾丸发育、生精上皮的形成及生精功能的启动过程中起重要作用。
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ECM具有重要的生物活性，参与细胞的迁移、粘附、增殖和分化，介导细胞与细胞间、细胞与生物大分子间的相互作用，从而在各种生理和病理过程中发挥重要作用[10]。睾丸中的ECM作为曲细精管基膜的组成成分而参与血睾屏障的构成，它还作为细胞间传递信息的信号，介导SC、PC和睾丸间质细胞间的相互作用，睾丸中ECM与精子的发生和生精细胞的分化有着密切的关系[1，5]。另外，ECM具有促进迁移和粘附的功能，它可以促进生精细胞从管壁移向管腔，逐渐走向成熟[5]。可见ECM对精子生成具有重要的作用，其作用机制还有待进一步深入研究。
△国家自然科学基金(39270380)资助
许增禄为通讯作者
作者单位：宋阳 许增禄 刘霄 徐健 钱晓菁 黄玉苓 (中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎学室，北京 100005)
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崔丽 (白求恩医科大学组织胚胎学教研室)
参考文献
1 Hadley MA，Dym M.Immunocytochemistry of extracellular matrix in the lamina propria of the rat testis: electron microscopic localization.Biol Reprod，1987，37(5): 1283～1289
2 Vernon RB，Sage H.The calcium-binding protein SPARC is secreted by Leydig and Sertoli cells of the adult mouse testis.Biol Reprod，1989，40(6): 1329～1340
3 Lian G，Miller KA，Enders GC.Localization and synthesis of entactin in seminiferous tubules of the mouse.Biol Reprod，1992，47(2): 316～325
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4 Paranko J.Expression of type Ⅰ and Ⅲ collagen during morphogensis of fetal rat testis and ovary.Anat Rec，1987，219(1): 91～101
5 Skinner MK，Tung PS，Fritz IB.Cooperativity between Sertoli cells and testicular peritubular cells in the production and deposition of extracellular matrix components.J Cell Biol，1985，100(5); 1941～1947
6 Hadely MA，Byers SW，Suarez-Quian CA，et al.Extracellular matrix regulates Sertoli cell differentiation，testicular cord formation，and germ cell development in vitro.J Cell Biol，1985，101(6): 1511～1522
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7 Xu Zenglu，Parker SB，Minkoff R.Distribution of type Ⅳ collagen，laminin and fibronectin during maxillary process formation in the chick embryo.Am J Anat，1990，187(3): 232～246
8 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.95～155
9 林月珍，丁 濂，阿晋彦.一种简化的原位核酸杂交法.中华病理学杂志，1993，22(5): 305～306
10 李玉瑞主编.细胞外间质的生物化学及研究方法.北京：人民卫生出版社，1988.1～44
11 Pelliniemi LJ，Frojdman K，Paranko J.Embryological and prenatal development and functions of Sertoli cells.In: Russell LD，Griswold MD eds.The Sertoli cell clearwater.FL: Cache River Press，1993.87～114
12 Leeson CR，Leeson TS.The postnatal development and differentiation of the boundary tissue of the seminiferous tubule of the rat.Anat Rec，1963，147(3):243～259, 百拇医药