同型半胱氨酸和低密度脂蛋白对内皮细胞的协同损伤作用
作者：景冬樱 王树人 王廷华 杨志梅 顾玲 邓峰美
单位：景冬樱(解放军兰州医学高等专科学校中心实验室， 甘肃 兰州 730020)；王树人 王廷华 杨志梅 顾玲 邓峰美(华西医科大学病理生理教研室， 四川 成都 610040)
关键词：高半胱氨酸；脂蛋白类，LDL；动脉粥样硬化；一氧化氮；巯基化合物
中国病理生理杂志000612
[摘 要] 目的：探索同型半胱氨酸和低密度脂蛋白在致动脉粥样硬化的作用中是否具有协同效应。方法：将同型半胱氨酸和低密度脂蛋白分别和共同作用于培养的兔主动脉内皮细胞，以脂质过氧化终产物丙二醛含量和内皮细胞的凋亡为检测指标。结果：共同作用的丙二醛生成量为分别作用的4.9～7.7倍，并产生明显的内皮细胞凋亡，即使将同型半胱氨酸和低密度脂蛋白的分别作用相加，二者的丙二醛之和也仅及共同作用的1/3, 且未发现明显的细胞凋亡表现。加入叶酸、叶酸和L-精氨酸或谷氨酸和甘氨酸可一定程度的抑制同型半胱氨酸和低密度脂蛋白的促脂质氧化和诱导内皮细胞凋亡的效应。结论:同型半胱氨酸和低密度脂蛋白在致动脉粥样硬化的作用中具有协同效应，该效应可能与同型半胱氨酸的自由巯基和它们对一氧化氮系统的损伤有关。
, 百拇医药
[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0522-05
Co-injury effects of homocysteine and low density lipoprotein on endothelial cell
JING Dong-ying
(Central Laboratory ,Lanzhou Medical School of PLA, Lanzhou 730020)
WANG Shu-ren, WANG Ting-hua, YANG Zhi-mei, GU Ling, DENG Feng-mei
(Department of Pathophysiology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041,China)
, 百拇医药
[Abstract] AIM:To evaluated weather homocysteine(Hcy) and low density lipoprotein(LDL) had co-effects in pathogenesis of atherosclerosis (As). METHOD: Thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) and apoptotic cells were measured after endothelial cell(EC) being exposed commonly or separated to Hcy and LDL. RESULTS: TBARS content in Hcy +LDL group was 4.9～7.7 times of that in single Hcy or LDL group, even put together TBARS contents of single Hcy or LDL groups, the co-effect of Hcy+LDL still showed 3 times higher than the former. Furthermore, Hcy+LDL showed obvious apoptosization effect on EC. The lipid peroxidization and EC apoptosization effects of Hcy+LDL were inhibited by adding folic acid , L-arginine+folic acid or glutamate+glycine. CONCLUSION: Hcy+LDL have co-injury effects on EC which may lead to As. The pathogenic factors of these effects probably involve the thiol groups of Hcy and their injury on nitric oxide system of EC.
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[MeSH] Homocysteine; Lipoproteins, LDL; Atherosclerosis; Nitric oxide; Sulfhydryl compounds
高同型半胱氨酸(hyperhomocysteine, Hcy)血症和血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)升高都被确立为动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)的独立危险因子[1～3]，但两者在致As的作用中是否具有协同效应尚未见研究报道，这涉及到同时具备高Hcy和高LDL血症的病人是否会有As发病的明显增加和加重。由于近年来对动脉内皮细胞(endothelial cell, EC)的研究进展，EC的损伤在As发病中的意义已受到广泛关注。因此，本文以培养EC为对象，探讨Hcy和LDL对EC的作用是否具有协同效应，并对其可能的机制作了初步的探索。现将结果报道如下。
材 料 和 方 法
, 百拇医药
一、 主要实验仪器及药品
实验仪器主要有：CO2孵箱(Heraeus Germany)、倒置显微镜(Olympus Japan)、 超净工作台(YJ-1450， 苏州)、超速离心机(Beckman U.S.A. )、751分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司),流式细胞仪(Coulterepics SP Finland)等。细胞培养、实验用药品及细胞凋亡实验所用试剂主要购自美国Sigma公司和德国Boehringer Mannheim(BM)公司，常规用生化试剂均为国产分析纯。
二、 兔主动脉内皮细胞培养
细胞取材于健康、年幼家兔的胸主动脉,用0.1%胶原酶消化，1000 r/min，10 min离心后，在含20%小牛血清M199培养液中，37℃、5% CO2条件下常规培养。细胞传代用0.25%胰蛋白酶加等量的EDTA，第2～3代细胞用于实验。
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三、 内皮细胞鉴定
光镜下EC贴壁生长，铺满处呈卵石(cobblestone)样排列；电镜下可见EC特异结构 Weibel-Palade(W-P)小体。
四、 兔天然低密度脂蛋白分离、提取及蛋白定量
采用一次性密度梯度超速离心分离血清脂蛋白法，用NaBr调血清密度至1.4000 g/mL，隔夜后不同密度液铺样，超速(50 000 r/min)离心5.5 h，提取天然LDL层蛋白液，聚乙二醇(MW20000)浓缩后，在4℃、含2.0 mg/mL EDTA, pH7.4的PBS中透析72 h。蛋白浓度定量采用考马斯亮兰蛋白浓度测定法。
五、 脂质过氧化测定
以硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substance, TBARS)法测定细胞培养液脂质过氧化终产物丙二醛(malondialdelyde, MDA)含量，结果以TBARS μmol/L表示。
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六、内皮细胞凋亡测定
(一) DNA末端标记法[4] 采用TUNEL(terminal transferase deoxyuridine nick-end labelling, TUNEL)法检测细胞凋亡。TUNEL试剂盒为德国BM公司生产，方法及步骤：培养于盖玻片上的细胞用4%多聚甲醛固定4 h，细胞盖玻片入PBS 5 min×3洗涤，蛋白酶K消化37℃ 30 min PBS 5 min×3洗涤，入0.1% Triton Х-100(含10%牛血清白蛋白、0.01 mol/L PBS, pH7.2) 4℃ 20 min，入反应液(1液∶2液=1∶9)37℃ 1 h，PBS 5 min×2洗涤，入荧光抗体(0.01 mol/L Tris HCl, pH7.5, 0.9% NaCl, 2%牛血清白蛋白配制)37℃ 1 h, PBS 5 min×3洗涤，Red Fast 室温30 min显色，0.01mol/L PBS 5 min×3洗涤，甘油封片后镜检。同批标本行苏木精染色作对照观察。
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(二) 流式细胞术 采用碘化丙啶插入定量染色法。常规消化细胞得到细胞沉淀后，加入0.5 mL PBS液(0.15 mol/L,pH7.2, 无Ca2+,Mg2+)制成细胞悬液标本，按1/50悬浮于2 mL左右含0.1% Triton X-100和PI荧光剂的液体中(染液即配即用,含0.1% Triton X-100, 50 μg/mL PI, 5 μg/mL RNAase A) ，轻轻振荡，使细胞分散，再置于-4℃黑暗处荧光染色60 min，最后以300目的筛网过滤，调整细胞浓度，即可上机检测。每份样品检测5 000～10 000个细胞，细胞流速为342～890个/s。数据结合二维点图(dot plot)和单参数直方图(histogram)采用Coulter公司Multicycle分析软件包计算细胞凋亡率。
七、 实验分组
将第2～3代培养EC消化计数后，接种于6孔培养板，每孔提前放一灭菌盖玻片，待细胞均匀铺满孔底后，进行实验。实验前1天换液，改为无血清培养基(CHO-S-SFM II，GiBco)，实验共分6组(表 1)实验培养时间24 h。
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表1 实验分组
Tab 1 Experiment groups Group
Reagents(μmol/mL)
1
EC+Hcy(20)
2
EC+LDL
3
EC+Hcy(20)+LDL
4
EC+Hcy(20)+LDL+folic acid(100)
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5
EC+Hcy(20)+LDL+folic acid (100) +L-arginine(10)
6
EC+Hcy(20)+LDL+glutamate(2)+glycine(10)
The amounts of LDL in various group: 48 μg/mL
八、 统计方法
实验数据用均值±标准差(
±s)表示 ，显著性检验用t检验和方差分析(F检验、q检验)。
结 果
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一、脂质过氧化测定
以各组EC培养上清液测得的TBARS浓度代表脂质过氧化程度，结果见表2。
表2 各组EC培养上清液TBARS含量
Tab 2 TBARS contents of EC conditioned medium
of various groups(n=6) Group
TBARS μmol/L (±s)
1
1.008±0.267
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0.641±0.167
3
4.958±0.600*
4
4.000±0.513
5
2.858±0.544
6
2.026±0.511
*P<0.01,vs all other groups
表2结果显示，EC培养液中同时加入Hcy和LDL(组3)可显著增强脂质过氧化，与单独分别加入Hcy和LDL的作用相比，其增强脂质过氧化的作用约为前两者的4.9～7.7倍。即使将Hcy和LDL的分别作用相加，同时加入Hcy和LDL的作用亦为前两者之和的3倍[4.958/(1.008±0.641)=3.0]，显示出Hcy和LDL在培养EC中促进脂质过氧化中的明显协同效应。本文还探索性的加入了某些非抗氧化试剂，以期初步了解Hcy和LDL促进脂质过氧化的可能机制，结果表明，叶酸(高Hcy血症治疗药物)，L-精氨酸(NO合成底物)，甘氨酸和谷氨酸(谷胱甘肽合成底物)，都分别显示了一定程度的拮抗Hcy和LDL的促脂质过氧化作用。
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二、 内皮细胞的调亡
(一) TUNEL法 本文以TUNEL法检测培养EC的凋亡改变，以苏木精染色作对照观察，结果见图1～3和表3。分别加入Hcy(组 1)和LDL(组2)后，无玫瑰红阳性染色，组3同时加入Hcy和LDL 后(图 1)，可见大量典型玫瑰红阳性核染色，着色的细胞核呈环形，核中央染色较浅，周边(近核膜处)着色较深，有的染色质不均匀浓缩呈块状、新月形，并可见凋亡小体，同组细胞的苏木精染色亦显示出细胞形态的破损及细胞核的浓缩(图2)。在上述处理的基础上分别加入叶酸(组4)、叶酸+L-精氨酸(组5)或谷氨酸+甘氨酸(组6)后，凋亡细胞明显少(图3)，苏木精染色亦显示多数核的形态较完整，各组随机选取10个视野，计数其同等面积的凋亡细胞数，结果见表3。
Fig 1 The TUNEL results of group 3, the nuclei of apoptotic cells were rosestained, chromatin condensated under nuclear membrane while the central area of nuclei stained weakly, some condensated chromeatin showed a pattern of new-moon(↑),there is apoptotic bodies (▲)(×400)
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图1 组3 EC的TUNEL染色，凋亡细胞呈玫瑰红色，染色质聚集于核膜下，核中心染色浅，有的染色质浓缩呈新月形(↑)，并可见凋亡小体(▲)
Fig 2 The hematoxylin staining of group 3 EC, showed nuclear condensation and cells injuries, which was coincident with the TUNEL staining(×400)
图2 组3 EC的苏木精染色，示胞核浓缩及细胞破损，与TUNEL染色结果相吻合
表3 EC凋亡计数
Tab 3 The results of TUNEL staining of EC in various groups (n=6) Group
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Apoptotic cells(cells/2.5×103μ2)
1
0
2
0
3
40±5**
4
20±5△
5
17±4△
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6
5 ±1
** P<0.01, vs all other groups；△ P<0.05, vs group 6
Fig 3 The TUNEL staining of group 5 EC showed the apoptosis, which compared with group 3, the number of apoptotic cells obviously decreased (×400)
图3 组 5 EC的TUNEL染色，示细胞凋亡，与组3相比，凋亡细胞数量明显减少
(二) 流式细胞术 以流式细胞术对组1,2,3和空白对照(未加任何药物的培养EC)所作的细胞凋亡率检测结果见表4。
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表4 流式细胞术显示的细胞凋亡率
Tab 4 Apoptotic rate of EC by method of flow cytometry
Blank
control
Group 1
Group 2
Group 3
Apoptotic rate
2.87±0.67
3.24±0.15
3.70±0.01
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5.20±0.15*
* P<0.01, vs Blank control
结果表明，流式细胞术可测得培养的EC有一定的基础凋亡率，分别加入Hcy或LDL后，凋亡率似有上升趋势，但无显著差异。同时加入Hcy 和LDL后，EC的凋亡率出现显著的升高(P<0.01), 与TUNEL结果吻合。本结果还显示，流式细胞术对凋亡细胞的检出率似高于TUNEL法，因此在空白对照中检出一定量的基础凋亡。本实验由于条件所限，未作4,5,6组的流式细胞术检测。
讨 论
本实验组 1、组 2在培养EC中分别加入Hcy 和LDL，显示出一定程度的促脂质过氧化作用，但并未显示明显的促细胞凋亡作用。当Hcy和LDL同时作用于EC后(组3)，其促脂质过氧化作用显著加强，显示出两者具明显的协同作用，而非简单的相加作用，并出现诱使细胞凋亡的显著表现，该结果提示，病人若同时具有高LDL血症和高Hcy血症，则As的危险度可能会明显增加。
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理论上，Hcy含还原性巯基(-SH)，应是一个还原性物质，但为什么Hcy能促进脂质过氧化，至今没有一个满意的解释[5，6]，我们的前期工作表明(已发表)Hcy可损伤EC的NO合酶，从而使NO生成量下降。NO本身虽是一个自由基，但亦可作为自由基淬灭基，目前认为[7]，EC分泌的基础量NO在体内主要是作为自由基清除剂，具有抗氧化作用。因此我们在实验体系中加入了促进NO合成的非抗氧化试剂叶酸、L-精氨酸。叶酸是临床上已确认为治疗高Hcy血症的有效药物，本实验中，叶酸显示出对Hcy的促脂质过氧化有一定拮抗作用。叶酸本身并不是还原剂，其拮抗Hcy的一个可能解释是作为NO合酶的辅因子从而促进NO的生成。我们的前期工作已显示叶酸可一定程度拮抗Hcy对NO合酶的损伤，并促进NO生成量的增加(已发表)。NO合酶的限速辅因子是四氢生物蝶啶(tetrahydrobiopterin, BH4)[8]，但由于叶酸和BH4系同类物，结构功能皆十分相似，因此，叶酸有可能作为BH4的替代物，促进NO的合成而拮抗Hcy的脂质过氧化作用。在此基础上，我们进一步加入NO合成的底物L-精氨酸，显示出叶酸加L-精氨酸的明显协同效应，TBARS显著降低，细胞凋亡数量亦明显减少，这表明Hcy可能通过损伤NO系统加强LDL的氧化，从而使两者产生协同效应。
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但Hcy毕竟含有还原性巯基(-SH)，仅比半胱氨酸多一个甲基，何以就具有了促进脂质过氧化和致As的特性，至今仍是一个谜，有人推测Hcy的巯基易发生歧化反应生成H2O2[9]。因此我们在组6的培养EC中同时加入谷氨酸、甘氨酸和Hcy，由于体内几乎所有的细胞都能迅速从谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸合成谷胱甘肽[10]，因此，我们期望谷氨酸和甘氨酸有可能结合Hcy，形成(同型)谷胱甘肽，从而保护Hcy的自由巯基，拮抗其与LDL协同损伤EC的作用。结果表明，组6的TBARS生成量和细胞凋亡都显著减轻，确实显示了该种效应，这提示，Hcy的自由巯基可能是其致As的活性基团之一。
本文初步结果表明，Hcy和LDL在致As的作用中具协同效应，该效应可能与Hcy自由巯基的性质有关，并可能涉及到它们对NO系统的损伤。
[参 考 文 献]
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[1] Clark R, Daly L, Robinson K , et al . Hyperhomocysteinemia: an independent risk factor for vascular disease[J]. N Engl J Med, 1991,324: 1149.
[2] 2 Mayer EL, Jacobsen DW, Robinson K. Homocysteine and coronary atherosclerosis[J]. JACC, 1996, 27: 517.
[3] LM Graham, LE Daly, HM Refsum, et al. Plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease[J]. JAMA, 1997, 277: 1775.
[4] Wijsman JH, Jarker RR, Keijzer G, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin sections: In situ end-labeling of fragmented DNA[J]. J Histochem Cytochem, 1993, 41: 7.
, 百拇医药
[5] Wall RT, Harlan JM, Harker LA, et al. Homocysteine-induced endothelial cell injury in vitro: a model for the study of vascular injury[J]. Thromb Res, 1980, 18: 113.
[6] Heineche JW, Kawamura M, Suzuki L, et al. Oxidation of low density lipoprotein by thiols: superoxide-dependent and-independent mechanisms[J]. J Lipid Res, 1993, 34: 2051.
[7] Darley-Usmar V, Wiseman H, Halliwell B. Nitric oxide and oxygen radicals: a question of balance[J]. FEBS Lett, 1995, 369: 131.
, http://www.100md.com
[8] Scotl-Burden T. Regulation of nitric oxide production by tetrahydrobiopterin[J]. Circulation, 1995, 91: 248.
[9] Lundell GB ,Jones BG,Rose FA, et al. Homocysteine mediated endothelial cell toxicity and its amelioration[J]. Atherosclerosis, 1996, 122: 163.
[10] Yudkoff M, Pleasure D, Cregan L, et al. Glutathione turnover in cultured astrocytes: Studies with [15N] glutamate[J]. J Neurochem, 1990, 55: 137.
[收稿日期] 1999-04-05 [修回日期] 1999-07-22, 百拇医药
单位：景冬樱(解放军兰州医学高等专科学校中心实验室， 甘肃 兰州 730020)；王树人 王廷华 杨志梅 顾玲 邓峰美(华西医科大学病理生理教研室， 四川 成都 610040)
关键词：高半胱氨酸；脂蛋白类，LDL；动脉粥样硬化；一氧化氮；巯基化合物
中国病理生理杂志000612
[摘 要] 目的：探索同型半胱氨酸和低密度脂蛋白在致动脉粥样硬化的作用中是否具有协同效应。方法：将同型半胱氨酸和低密度脂蛋白分别和共同作用于培养的兔主动脉内皮细胞，以脂质过氧化终产物丙二醛含量和内皮细胞的凋亡为检测指标。结果：共同作用的丙二醛生成量为分别作用的4.9～7.7倍，并产生明显的内皮细胞凋亡，即使将同型半胱氨酸和低密度脂蛋白的分别作用相加，二者的丙二醛之和也仅及共同作用的1/3, 且未发现明显的细胞凋亡表现。加入叶酸、叶酸和L-精氨酸或谷氨酸和甘氨酸可一定程度的抑制同型半胱氨酸和低密度脂蛋白的促脂质氧化和诱导内皮细胞凋亡的效应。结论:同型半胱氨酸和低密度脂蛋白在致动脉粥样硬化的作用中具有协同效应，该效应可能与同型半胱氨酸的自由巯基和它们对一氧化氮系统的损伤有关。
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[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)06-0522-05
Co-injury effects of homocysteine and low density lipoprotein on endothelial cell
JING Dong-ying
(Central Laboratory ,Lanzhou Medical School of PLA, Lanzhou 730020)
WANG Shu-ren, WANG Ting-hua, YANG Zhi-mei, GU Ling, DENG Feng-mei
(Department of Pathophysiology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041,China)
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[Abstract] AIM:To evaluated weather homocysteine(Hcy) and low density lipoprotein(LDL) had co-effects in pathogenesis of atherosclerosis (As). METHOD: Thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) and apoptotic cells were measured after endothelial cell(EC) being exposed commonly or separated to Hcy and LDL. RESULTS: TBARS content in Hcy +LDL group was 4.9～7.7 times of that in single Hcy or LDL group, even put together TBARS contents of single Hcy or LDL groups, the co-effect of Hcy+LDL still showed 3 times higher than the former. Furthermore, Hcy+LDL showed obvious apoptosization effect on EC. The lipid peroxidization and EC apoptosization effects of Hcy+LDL were inhibited by adding folic acid , L-arginine+folic acid or glutamate+glycine. CONCLUSION: Hcy+LDL have co-injury effects on EC which may lead to As. The pathogenic factors of these effects probably involve the thiol groups of Hcy and their injury on nitric oxide system of EC.
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[MeSH] Homocysteine; Lipoproteins, LDL; Atherosclerosis; Nitric oxide; Sulfhydryl compounds
高同型半胱氨酸(hyperhomocysteine, Hcy)血症和血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)升高都被确立为动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)的独立危险因子[1～3]，但两者在致As的作用中是否具有协同效应尚未见研究报道，这涉及到同时具备高Hcy和高LDL血症的病人是否会有As发病的明显增加和加重。由于近年来对动脉内皮细胞(endothelial cell, EC)的研究进展，EC的损伤在As发病中的意义已受到广泛关注。因此，本文以培养EC为对象，探讨Hcy和LDL对EC的作用是否具有协同效应，并对其可能的机制作了初步的探索。现将结果报道如下。
材 料 和 方 法
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一、 主要实验仪器及药品
实验仪器主要有：CO2孵箱(Heraeus Germany)、倒置显微镜(Olympus Japan)、 超净工作台(YJ-1450， 苏州)、超速离心机(Beckman U.S.A. )、751分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司),流式细胞仪(Coulterepics SP Finland)等。细胞培养、实验用药品及细胞凋亡实验所用试剂主要购自美国Sigma公司和德国Boehringer Mannheim(BM)公司，常规用生化试剂均为国产分析纯。
二、 兔主动脉内皮细胞培养
细胞取材于健康、年幼家兔的胸主动脉,用0.1%胶原酶消化，1000 r/min，10 min离心后，在含20%小牛血清M199培养液中，37℃、5% CO2条件下常规培养。细胞传代用0.25%胰蛋白酶加等量的EDTA，第2～3代细胞用于实验。
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三、 内皮细胞鉴定
光镜下EC贴壁生长，铺满处呈卵石(cobblestone)样排列；电镜下可见EC特异结构 Weibel-Palade(W-P)小体。
四、 兔天然低密度脂蛋白分离、提取及蛋白定量
采用一次性密度梯度超速离心分离血清脂蛋白法，用NaBr调血清密度至1.4000 g/mL，隔夜后不同密度液铺样，超速(50 000 r/min)离心5.5 h，提取天然LDL层蛋白液，聚乙二醇(MW20000)浓缩后，在4℃、含2.0 mg/mL EDTA, pH7.4的PBS中透析72 h。蛋白浓度定量采用考马斯亮兰蛋白浓度测定法。
五、 脂质过氧化测定
以硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substance, TBARS)法测定细胞培养液脂质过氧化终产物丙二醛(malondialdelyde, MDA)含量，结果以TBARS μmol/L表示。
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六、内皮细胞凋亡测定
(一) DNA末端标记法[4] 采用TUNEL(terminal transferase deoxyuridine nick-end labelling, TUNEL)法检测细胞凋亡。TUNEL试剂盒为德国BM公司生产，方法及步骤：培养于盖玻片上的细胞用4%多聚甲醛固定4 h，细胞盖玻片入PBS 5 min×3洗涤，蛋白酶K消化37℃ 30 min PBS 5 min×3洗涤，入0.1% Triton Х-100(含10%牛血清白蛋白、0.01 mol/L PBS, pH7.2) 4℃ 20 min，入反应液(1液∶2液=1∶9)37℃ 1 h，PBS 5 min×2洗涤，入荧光抗体(0.01 mol/L Tris HCl, pH7.5, 0.9% NaCl, 2%牛血清白蛋白配制)37℃ 1 h, PBS 5 min×3洗涤，Red Fast 室温30 min显色，0.01mol/L PBS 5 min×3洗涤，甘油封片后镜检。同批标本行苏木精染色作对照观察。
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(二) 流式细胞术 采用碘化丙啶插入定量染色法。常规消化细胞得到细胞沉淀后，加入0.5 mL PBS液(0.15 mol/L,pH7.2, 无Ca2+,Mg2+)制成细胞悬液标本，按1/50悬浮于2 mL左右含0.1% Triton X-100和PI荧光剂的液体中(染液即配即用,含0.1% Triton X-100, 50 μg/mL PI, 5 μg/mL RNAase A) ，轻轻振荡，使细胞分散，再置于-4℃黑暗处荧光染色60 min，最后以300目的筛网过滤，调整细胞浓度，即可上机检测。每份样品检测5 000～10 000个细胞，细胞流速为342～890个/s。数据结合二维点图(dot plot)和单参数直方图(histogram)采用Coulter公司Multicycle分析软件包计算细胞凋亡率。
七、 实验分组
将第2～3代培养EC消化计数后，接种于6孔培养板，每孔提前放一灭菌盖玻片，待细胞均匀铺满孔底后，进行实验。实验前1天换液，改为无血清培养基(CHO-S-SFM II，GiBco)，实验共分6组(表 1)实验培养时间24 h。
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表1 实验分组
Tab 1 Experiment groups Group
Reagents(μmol/mL)
1
EC+Hcy(20)
2
EC+LDL
3
EC+Hcy(20)+LDL
4
EC+Hcy(20)+LDL+folic acid(100)
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5
EC+Hcy(20)+LDL+folic acid (100) +L-arginine(10)
6
EC+Hcy(20)+LDL+glutamate(2)+glycine(10)
The amounts of LDL in various group: 48 μg/mL
八、 统计方法
实验数据用均值±标准差(
±s)表示 ，显著性检验用t检验和方差分析(F检验、q检验)。结 果
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一、脂质过氧化测定
以各组EC培养上清液测得的TBARS浓度代表脂质过氧化程度，结果见表2。
表2 各组EC培养上清液TBARS含量
Tab 2 TBARS contents of EC conditioned medium
of various groups(n=6) Group
TBARS μmol/L (
±s)1
1.008±0.267
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0.641±0.167
3
4.958±0.600*
4
4.000±0.513
5
2.858±0.544
6
2.026±0.511
*P<0.01,vs all other groups
表2结果显示，EC培养液中同时加入Hcy和LDL(组3)可显著增强脂质过氧化，与单独分别加入Hcy和LDL的作用相比，其增强脂质过氧化的作用约为前两者的4.9～7.7倍。即使将Hcy和LDL的分别作用相加，同时加入Hcy和LDL的作用亦为前两者之和的3倍[4.958/(1.008±0.641)=3.0]，显示出Hcy和LDL在培养EC中促进脂质过氧化中的明显协同效应。本文还探索性的加入了某些非抗氧化试剂，以期初步了解Hcy和LDL促进脂质过氧化的可能机制，结果表明，叶酸(高Hcy血症治疗药物)，L-精氨酸(NO合成底物)，甘氨酸和谷氨酸(谷胱甘肽合成底物)，都分别显示了一定程度的拮抗Hcy和LDL的促脂质过氧化作用。
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二、 内皮细胞的调亡
(一) TUNEL法 本文以TUNEL法检测培养EC的凋亡改变，以苏木精染色作对照观察，结果见图1～3和表3。分别加入Hcy(组 1)和LDL(组2)后，无玫瑰红阳性染色，组3同时加入Hcy和LDL 后(图 1)，可见大量典型玫瑰红阳性核染色，着色的细胞核呈环形，核中央染色较浅，周边(近核膜处)着色较深，有的染色质不均匀浓缩呈块状、新月形，并可见凋亡小体，同组细胞的苏木精染色亦显示出细胞形态的破损及细胞核的浓缩(图2)。在上述处理的基础上分别加入叶酸(组4)、叶酸+L-精氨酸(组5)或谷氨酸+甘氨酸(组6)后，凋亡细胞明显少(图3)，苏木精染色亦显示多数核的形态较完整，各组随机选取10个视野，计数其同等面积的凋亡细胞数，结果见表3。
Fig 1 The TUNEL results of group 3, the nuclei of apoptotic cells were rosestained, chromatin condensated under nuclear membrane while the central area of nuclei stained weakly, some condensated chromeatin showed a pattern of new-moon(↑),there is apoptotic bodies (▲)(×400)
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图1 组3 EC的TUNEL染色，凋亡细胞呈玫瑰红色，染色质聚集于核膜下，核中心染色浅，有的染色质浓缩呈新月形(↑)，并可见凋亡小体(▲)
Fig 2 The hematoxylin staining of group 3 EC, showed nuclear condensation and cells injuries, which was coincident with the TUNEL staining(×400)
图2 组3 EC的苏木精染色，示胞核浓缩及细胞破损，与TUNEL染色结果相吻合
表3 EC凋亡计数
Tab 3 The results of TUNEL staining of EC in various groups (n=6) Group
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Apoptotic cells(cells/2.5×103μ2)
1
0
2
0
3
40±5**
4
20±5△
5
17±4△
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6
5 ±1
** P<0.01, vs all other groups；△ P<0.05, vs group 6
Fig 3 The TUNEL staining of group 5 EC showed the apoptosis, which compared with group 3, the number of apoptotic cells obviously decreased (×400)
图3 组 5 EC的TUNEL染色，示细胞凋亡，与组3相比，凋亡细胞数量明显减少
(二) 流式细胞术 以流式细胞术对组1,2,3和空白对照(未加任何药物的培养EC)所作的细胞凋亡率检测结果见表4。
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表4 流式细胞术显示的细胞凋亡率
Tab 4 Apoptotic rate of EC by method of flow cytometry
Blank
control
Group 1
Group 2
Group 3
Apoptotic rate
2.87±0.67
3.24±0.15
3.70±0.01
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5.20±0.15*
* P<0.01, vs Blank control
结果表明，流式细胞术可测得培养的EC有一定的基础凋亡率，分别加入Hcy或LDL后，凋亡率似有上升趋势，但无显著差异。同时加入Hcy 和LDL后，EC的凋亡率出现显著的升高(P<0.01), 与TUNEL结果吻合。本结果还显示，流式细胞术对凋亡细胞的检出率似高于TUNEL法，因此在空白对照中检出一定量的基础凋亡。本实验由于条件所限，未作4,5,6组的流式细胞术检测。
讨 论
本实验组 1、组 2在培养EC中分别加入Hcy 和LDL，显示出一定程度的促脂质过氧化作用，但并未显示明显的促细胞凋亡作用。当Hcy和LDL同时作用于EC后(组3)，其促脂质过氧化作用显著加强，显示出两者具明显的协同作用，而非简单的相加作用，并出现诱使细胞凋亡的显著表现，该结果提示，病人若同时具有高LDL血症和高Hcy血症，则As的危险度可能会明显增加。
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理论上，Hcy含还原性巯基(-SH)，应是一个还原性物质，但为什么Hcy能促进脂质过氧化，至今没有一个满意的解释[5，6]，我们的前期工作表明(已发表)Hcy可损伤EC的NO合酶，从而使NO生成量下降。NO本身虽是一个自由基，但亦可作为自由基淬灭基，目前认为[7]，EC分泌的基础量NO在体内主要是作为自由基清除剂，具有抗氧化作用。因此我们在实验体系中加入了促进NO合成的非抗氧化试剂叶酸、L-精氨酸。叶酸是临床上已确认为治疗高Hcy血症的有效药物，本实验中，叶酸显示出对Hcy的促脂质过氧化有一定拮抗作用。叶酸本身并不是还原剂，其拮抗Hcy的一个可能解释是作为NO合酶的辅因子从而促进NO的生成。我们的前期工作已显示叶酸可一定程度拮抗Hcy对NO合酶的损伤，并促进NO生成量的增加(已发表)。NO合酶的限速辅因子是四氢生物蝶啶(tetrahydrobiopterin, BH4)[8]，但由于叶酸和BH4系同类物，结构功能皆十分相似，因此，叶酸有可能作为BH4的替代物，促进NO的合成而拮抗Hcy的脂质过氧化作用。在此基础上，我们进一步加入NO合成的底物L-精氨酸，显示出叶酸加L-精氨酸的明显协同效应，TBARS显著降低，细胞凋亡数量亦明显减少，这表明Hcy可能通过损伤NO系统加强LDL的氧化，从而使两者产生协同效应。
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但Hcy毕竟含有还原性巯基(-SH)，仅比半胱氨酸多一个甲基，何以就具有了促进脂质过氧化和致As的特性，至今仍是一个谜，有人推测Hcy的巯基易发生歧化反应生成H2O2[9]。因此我们在组6的培养EC中同时加入谷氨酸、甘氨酸和Hcy，由于体内几乎所有的细胞都能迅速从谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸合成谷胱甘肽[10]，因此，我们期望谷氨酸和甘氨酸有可能结合Hcy，形成(同型)谷胱甘肽，从而保护Hcy的自由巯基，拮抗其与LDL协同损伤EC的作用。结果表明，组6的TBARS生成量和细胞凋亡都显著减轻，确实显示了该种效应，这提示，Hcy的自由巯基可能是其致As的活性基团之一。
本文初步结果表明，Hcy和LDL在致As的作用中具协同效应，该效应可能与Hcy自由巯基的性质有关，并可能涉及到它们对NO系统的损伤。
[参 考 文 献]
, 百拇医药
[1] Clark R, Daly L, Robinson K , et al . Hyperhomocysteinemia: an independent risk factor for vascular disease[J]. N Engl J Med, 1991,324: 1149.
[2] 2 Mayer EL, Jacobsen DW, Robinson K. Homocysteine and coronary atherosclerosis[J]. JACC, 1996, 27: 517.
[3] LM Graham, LE Daly, HM Refsum, et al. Plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease[J]. JAMA, 1997, 277: 1775.
[4] Wijsman JH, Jarker RR, Keijzer G, et al. A new method to detect apoptosis in paraffin sections: In situ end-labeling of fragmented DNA[J]. J Histochem Cytochem, 1993, 41: 7.
, 百拇医药
[5] Wall RT, Harlan JM, Harker LA, et al. Homocysteine-induced endothelial cell injury in vitro: a model for the study of vascular injury[J]. Thromb Res, 1980, 18: 113.
[6] Heineche JW, Kawamura M, Suzuki L, et al. Oxidation of low density lipoprotein by thiols: superoxide-dependent and-independent mechanisms[J]. J Lipid Res, 1993, 34: 2051.
[7] Darley-Usmar V, Wiseman H, Halliwell B. Nitric oxide and oxygen radicals: a question of balance[J]. FEBS Lett, 1995, 369: 131.
, http://www.100md.com
[8] Scotl-Burden T. Regulation of nitric oxide production by tetrahydrobiopterin[J]. Circulation, 1995, 91: 248.
[9] Lundell GB ,Jones BG,Rose FA, et al. Homocysteine mediated endothelial cell toxicity and its amelioration[J]. Atherosclerosis, 1996, 122: 163.
[10] Yudkoff M, Pleasure D, Cregan L, et al. Glutathione turnover in cultured astrocytes: Studies with [15N] glutamate[J]. J Neurochem, 1990, 55: 137.
[收稿日期] 1999-04-05 [修回日期] 1999-07-22, 百拇医药