基因重组人骨形成蛋白-2对培养骨髓细胞的生物学效应
陈富林 任卫红 蒲勤 毛天球 杨连甲
摘 要 目的：骨髓是机体重要的造血器官，其中的单个核细胞主要是单核细胞和巨噬细胞,骨髓组织在骨损伤修复过程中也发挥重要的作用. 为提高骨形成蛋白(BMP)修复骨缺损的能力. 方法: 本实验观察了基因重组人骨形成蛋白-2(recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2,rhBMP2)对培养骨髓细胞生物学活性的影响. 结果:低浓度的rhBMP2(<0.16 mg/L)对培养骨髓细胞的碱性磷酸酶活性、蛋白质含量均有明显的促进作用,且呈剂量依赖性，高浓度的rhBMP2(>0.16 mg/L)对培养骨髓细胞的增殖也有一定促进作用. 结论：本研究的结果进一步证实, 骨髓细胞也是BMP重要的靶细胞,BMP不仅促进骨髓细胞向成骨细胞的表型转化, 而且可以促进骨髓细胞的增殖,因此在使用复合BMP的植骨材料进行骨缺损修复时,如能辅以骨髓细胞植入,将会大大提高骨缺损的修复效果.
关键词：rhBMP2 骨髓细胞 细胞分裂 细胞分化
, 百拇医药
0 引言
骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是一种广泛分布于动物骨组织中的酸性蛋白质, 将其植入皮下和肌肉中,均可通过诱导未分化的间充质细胞而形成软骨和骨组织,将BMP与一定的支架材料复合而用于骨缺损的修复,是目前植骨材料研究领域的重要内容. BMP植入骨缺损后,主要通过诱导未分化的间充质细胞、骨膜细胞等分化为成骨细胞而发挥骨缺损的修复作用. 但由于骨组织中缺乏血管系统，未分化间充质细胞数量很低，而且许多骨缺损同时伴有骨膜缺损，使BMP缺乏靶细胞，大大降低了其诱导成骨活性. 因而增加缺损中的靶细胞数量, 将是提高BMP生物学效应，增强其骨缺损修复能力的重要方法[1]. 以往的研究表明，骨髓基质细胞是BMP的重要靶细胞，但BMP对于不同的骨髓基质细胞系具有不同的生物学效应[2～4]. 我们观察了基因重组人骨形成蛋白-2(recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2,rhBMP2)对新鲜培养骨髓细胞生物效应，从而为BMP-骨髓细胞复合移植修复骨缺损的研究打下基础.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养液(Gibco, USA)，MTT(Sigma)，FBS(浙江金华清湖犊牛利用研究所)，胰蛋白酶(上海浦东生化试剂厂)，DMSO(上海东风试剂厂),DG-1型酶联检测仪(华东电子管厂)，CO2细胞培养箱(美国Forma Scientific公司)，YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置显微镜及照相系统(Olympus)，ALP检测试剂盒(台湾BGH公司)，Triton X-100(华美生物工程公司),考马斯亮蓝G-250(Sigma)，rhBMP2(第四军医大学生物化学教研室).
1.2 方法
1.2.1 rhBMP2诱骨活性实验 rhBMP2 1 mg, 无菌条件下植入昆明小鼠股部肌袋中, 术后1,2,3 wk取材, 组织学观察其诱骨活性.
, http://www.100md.com 1.2.2 兔骨髓细胞培养 出生1 mo的新西兰幼兔1只，断头处死，无菌条件下取四肢长骨，纵行剖开，用含100 mL/L FBS的DMEM培养液冲洗骨髓腔，轻轻吹打，静置1 min，使大块组织沉降，取上清进行培养[5]. 24 h后换液，去除未贴壁的血细胞，以后每3 d换液1次，2.5 g/L胰酶常规传代. 倒置显微镜下进行观察.
1.2.3 药物加入
1.2.3.1 rhBMP2对骨髓细胞增殖的影响 生长良好的第5代骨髓细胞, 胰酶消化后吹散,细胞记数后,用培养液调整细胞浓度至1×104/mL,加入96孔板，每孔100 μL. 培养24 h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，加入用含10 mL/L FBS DMEM倍比稀释的rhBMP2，共设6组，rhBMP2浓度分别为0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 mg/L,每组4孔共24孔,对照组仅加培养液.
, 百拇医药
MTT比色法测定：培养96 h后,每孔加入50 g/L MTT 20 μL. 继续培养4 h，每孔加入150 μL二甲基亚砜,振荡10 min，用酶联免疫检测仪490 nm波长测光吸收值. 结果进行统计学分析.
1.2.3.2 rhBMP2对骨髓细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响 分组及药物加入同1.2.3.1, 细胞接种浓度为5×104/mL, 每孔加入100 μL, 培养96 h后,弃去液体，0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗各培养孔3次，然后加入2 mL/L Triton X-100 100 μL，4 ℃冰箱过夜，每孔加入150 μL ALP底物液，37 ℃孵育30 min，以1 mol/L KOH终止反应，用酶联免疫检测仪410 nm波长测光吸收值. 结果进行统计学分析.
1.2.3.3 rhBMP2对骨髓细胞蛋白质含量的影响 分组及细胞接种同1.2.3.2. 培养96 h后，弃去液体，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗各培养孔3次，然后加入2 mL/L Triton X-100 100 μL，4 ℃冰箱过夜，每孔加入150 μL考马斯亮蓝染液，室温10 min后，用酶联免疫检测仪595 nm波长测光吸收值. 结果进行统计学分析.
, 百拇医药
2 结果
2.1 rhBMP2诱骨活性实验 组织学检查，1 wk时肌袋中即有大量间充质细胞增生，并有少量软骨形成,2 wk时见大量软骨形成, 3 wk时可见小梁骨形成. 表明本实验所用的rhBMP2具有良好的诱骨活性.
2.2 倒置显微镜下观察 培养的骨髓细胞较大，多边形，胞核圆形或椭圆形，居中，有2个～3个清晰可见的核仁.
2.3 rhBMP2对培养骨髓细胞增殖、ALP活性、蛋白质含量的作用 见Tab 1.从表中可以看出,与对照组相比,rhBMP2在较低浓度时(0.02 mg/L)即可以显著增加骨髓细胞的ALP活性，在0.08 mg/L浓度时可显著增加细胞内蛋白质含量(P<0.05), 其作用呈剂量-效应依赖关系. 在0.16 mg/L浓度时对细胞的增殖也有显著促进作用(P<0.05).
表1 rhBMP2对培养骨髓细胞生物学活性的影响
, http://www.100md.com
Tab 1 Effects of rhBMP2 on biological characters of cultured bone marrow cells
(mg/L, X±s)
Item
0
0.02
0.04
0.08
0.16
0.32
0.64
Proliferation
, 百拇医药
0.54±0.02
0.52±0.03
0.55±0.02
0.56±0.01
0.61±0.03a
0.65±0.04a
0.70±0.06b
ALP activity
0.52±0.02
0.56±0.02a
, 百拇医药 0.59±0.01b
0.62±0.05a
0.66±0.03b
0.68±0.04b
0.73±0.03b
Protein content
0.17±0.01
0.16±0.03
0.18±0.03
0.21±0.02a
, 百拇医药
0.24±0.03b
0.28±0.02b
0.29±0.04b
aP<0.05，bP<0.01，vs control.
3 讨论
BMP在骨组织的发生和损伤修复中都具有重要的作用. 植入肌肉中，其诱骨过程先是诱导局部间充质细胞的聚集和分化，包括形态和代谢的改变，如表达Ⅱ型胶原、合成蛋白聚糖、糖胺聚糖等，逐渐形成软骨基质，继而软骨细胞向成骨细胞表型转化，局部ALP活性增高，以软骨内成骨的方式形成骨组织[6]. Yang等[7]用免疫组化方法观察到正常骨组织的BMP主要分布于胶原纤维、骨膜和骨髓基质中,当骨组织损伤时BMP的量迅速增加且活性增强.
, 百拇医药
近年来，人们将BMP与多种载体材料复合，以寻求一种既具有骨引导活性，又具有骨诱导活性的新型植骨材料，进行骨缺损的修复. 但一方面由于BMP来源有限，另一方面由于骨缺损中缺乏靶细胞，目前这种方法还远远不能满足临床治疗的需要.
BMP对细胞主要起促分化作用,BMP不但能促进成骨前体细胞如骨膜细胞分化为成骨细胞,而且可以诱导多能细胞的增殖和向成骨细胞分化. BMP的促分化作用主要通过增加细胞内的ALP活性和胶原蛋白含量表现出来. 根据本实验的结果, 低浓度的rhBMP2(<0.16 mg/L)即可以明显促进培养骨髓细胞的ALP活性和细胞内蛋白质含量, 使骨髓细胞向成骨细胞的表型转化.
Akira等[4]的实验证实,rhBMP2对多能的细胞系ROB-C26,不仅促进其分化,而且可以促进其增殖,而对于分化较高的成骨样细胞系ROB-C20则促进其分化、抑制其增殖,表明BMP对于不同分化程度的细胞效应不尽相同. 本研究利用新鲜骨髓组织进行细胞培养，细胞由处于不同分化阶段的多种细胞成分构成. 我们观察到,较高浓度的rhBMP2(>0.16 mg/L)对培养骨髓细胞也具有明显的促增殖作用,这可能是由于细胞中含有一定数量的低分化细胞.
, 百拇医药
骨髓细胞在矿化条件下在体外即具有很强的成骨能力，可以在培养瓶中合成、分泌胶原纤维，并进一步通过钙质沉积，形成骨小梁样结构[8]. 本研究的结果证实rhBMP2对培养骨髓细胞的ALP活性、蛋白质含量均有明显的促进作用, 对细胞的增殖也有一定的促进作用, 进一步表明骨髓细胞也是BMP重要的靶细胞. 而且骨髓细胞取材方便,易于进行传代培养,因此在体外大量扩增培养骨髓细胞,与BMP复合后移植用于骨缺损的修复,能大大增加BMP的靶细胞，将是骨缺损治疗的一种有效手段,这也是我们下一步的研究内容.
作者简介：陈富林，男，1970-07-06生，河南省沁阳人，汉族. 1994年四医大口腔系本科毕业，1997年获口腔颌面外科专业硕士学位. 现在攻读口腔颌面外科专业博士学位，已发表论文6篇. 电话：(029)3376102
作者单位：陈富林 毛天球 第四军医大学秦都口腔医学院颌面外科 陕西 西安 710033
, 百拇医药
任卫红 杨连甲 第四军医大学秦都口腔医学院病理科
蒲 勤 第四军医大学生物化学教研室
参考文献
1.张森林.人基因重组骨形成蛋白-2与珊瑚复合移植的实验研究.第四军医大学硕士学位论文，1996：6-8
2.Yamaguchi A，Ishizuya T，Kintou N et al.Effects of BMP-2, BMP-4, and BMP-6 on osteoblastic differentiation of bone marrow-derived stromal cell lines,ST2 and MC3T3-G2/PA6.Biochem Biophys Res Commun，1996；220(2): 366-371
3.Rickard DJ，Sullivan TA，Shenker BJ et al.Induction of rapid osteoblast differentiation in rat bone marrow stromal cell cultures by dexamethasone and BMP-2.Dev Biol，1994; 161(1): 218-228
, http://www.100md.com
4.Akira Y,Takenobu K,Tohru I et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2 stimulate osteoblastic maturation and inhibits myogenic differentiation in vitro.J Cell Biol，1996；113(2):681-687
5.司徒镇强,吴军正主编.细胞培养.西安：世界图书出版公司,1996：114-115
6.谭祖健,李起鸿.BMP及其诱导成骨的分子生物学基础.中华骨科杂志，1996；16(1):9-12
7.Yang LJ,Jin Y.Immunohistochemical observations on bone morphogenetic protein in normal and abnormal conditions.Clin Orthop，1990;257(4):249-256
8.陈富林,毛天球.培养兔骨髓细胞体外成骨能力的实验研究.现代口腔医学杂志，1997；11(增刊)：71-72, http://www.100md.com
摘 要 目的：骨髓是机体重要的造血器官，其中的单个核细胞主要是单核细胞和巨噬细胞,骨髓组织在骨损伤修复过程中也发挥重要的作用. 为提高骨形成蛋白(BMP)修复骨缺损的能力. 方法: 本实验观察了基因重组人骨形成蛋白-2(recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2,rhBMP2)对培养骨髓细胞生物学活性的影响. 结果:低浓度的rhBMP2(<0.16 mg/L)对培养骨髓细胞的碱性磷酸酶活性、蛋白质含量均有明显的促进作用,且呈剂量依赖性，高浓度的rhBMP2(>0.16 mg/L)对培养骨髓细胞的增殖也有一定促进作用. 结论：本研究的结果进一步证实, 骨髓细胞也是BMP重要的靶细胞,BMP不仅促进骨髓细胞向成骨细胞的表型转化, 而且可以促进骨髓细胞的增殖,因此在使用复合BMP的植骨材料进行骨缺损修复时,如能辅以骨髓细胞植入,将会大大提高骨缺损的修复效果.
关键词：rhBMP2 骨髓细胞 细胞分裂 细胞分化
, 百拇医药
0 引言
骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是一种广泛分布于动物骨组织中的酸性蛋白质, 将其植入皮下和肌肉中,均可通过诱导未分化的间充质细胞而形成软骨和骨组织,将BMP与一定的支架材料复合而用于骨缺损的修复,是目前植骨材料研究领域的重要内容. BMP植入骨缺损后,主要通过诱导未分化的间充质细胞、骨膜细胞等分化为成骨细胞而发挥骨缺损的修复作用. 但由于骨组织中缺乏血管系统，未分化间充质细胞数量很低，而且许多骨缺损同时伴有骨膜缺损，使BMP缺乏靶细胞，大大降低了其诱导成骨活性. 因而增加缺损中的靶细胞数量, 将是提高BMP生物学效应，增强其骨缺损修复能力的重要方法[1]. 以往的研究表明，骨髓基质细胞是BMP的重要靶细胞，但BMP对于不同的骨髓基质细胞系具有不同的生物学效应[2～4]. 我们观察了基因重组人骨形成蛋白-2(recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2,rhBMP2)对新鲜培养骨髓细胞生物效应，从而为BMP-骨髓细胞复合移植修复骨缺损的研究打下基础.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养液(Gibco, USA)，MTT(Sigma)，FBS(浙江金华清湖犊牛利用研究所)，胰蛋白酶(上海浦东生化试剂厂)，DMSO(上海东风试剂厂),DG-1型酶联检测仪(华东电子管厂)，CO2细胞培养箱(美国Forma Scientific公司)，YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置显微镜及照相系统(Olympus)，ALP检测试剂盒(台湾BGH公司)，Triton X-100(华美生物工程公司),考马斯亮蓝G-250(Sigma)，rhBMP2(第四军医大学生物化学教研室).
1.2 方法
1.2.1 rhBMP2诱骨活性实验 rhBMP2 1 mg, 无菌条件下植入昆明小鼠股部肌袋中, 术后1,2,3 wk取材, 组织学观察其诱骨活性.
, http://www.100md.com 1.2.2 兔骨髓细胞培养 出生1 mo的新西兰幼兔1只，断头处死，无菌条件下取四肢长骨，纵行剖开，用含100 mL/L FBS的DMEM培养液冲洗骨髓腔，轻轻吹打，静置1 min，使大块组织沉降，取上清进行培养[5]. 24 h后换液，去除未贴壁的血细胞，以后每3 d换液1次，2.5 g/L胰酶常规传代. 倒置显微镜下进行观察.
1.2.3 药物加入
1.2.3.1 rhBMP2对骨髓细胞增殖的影响 生长良好的第5代骨髓细胞, 胰酶消化后吹散,细胞记数后,用培养液调整细胞浓度至1×104/mL,加入96孔板，每孔100 μL. 培养24 h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，加入用含10 mL/L FBS DMEM倍比稀释的rhBMP2，共设6组，rhBMP2浓度分别为0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 mg/L,每组4孔共24孔,对照组仅加培养液.
, 百拇医药
MTT比色法测定：培养96 h后,每孔加入50 g/L MTT 20 μL. 继续培养4 h，每孔加入150 μL二甲基亚砜,振荡10 min，用酶联免疫检测仪490 nm波长测光吸收值. 结果进行统计学分析.
1.2.3.2 rhBMP2对骨髓细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的影响 分组及药物加入同1.2.3.1, 细胞接种浓度为5×104/mL, 每孔加入100 μL, 培养96 h后,弃去液体，0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗各培养孔3次，然后加入2 mL/L Triton X-100 100 μL，4 ℃冰箱过夜，每孔加入150 μL ALP底物液，37 ℃孵育30 min，以1 mol/L KOH终止反应，用酶联免疫检测仪410 nm波长测光吸收值. 结果进行统计学分析.
1.2.3.3 rhBMP2对骨髓细胞蛋白质含量的影响 分组及细胞接种同1.2.3.2. 培养96 h后，弃去液体，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗各培养孔3次，然后加入2 mL/L Triton X-100 100 μL，4 ℃冰箱过夜，每孔加入150 μL考马斯亮蓝染液，室温10 min后，用酶联免疫检测仪595 nm波长测光吸收值. 结果进行统计学分析.
, 百拇医药
2 结果
2.1 rhBMP2诱骨活性实验 组织学检查，1 wk时肌袋中即有大量间充质细胞增生，并有少量软骨形成,2 wk时见大量软骨形成, 3 wk时可见小梁骨形成. 表明本实验所用的rhBMP2具有良好的诱骨活性.
2.2 倒置显微镜下观察 培养的骨髓细胞较大，多边形，胞核圆形或椭圆形，居中，有2个～3个清晰可见的核仁.
2.3 rhBMP2对培养骨髓细胞增殖、ALP活性、蛋白质含量的作用 见Tab 1.从表中可以看出,与对照组相比,rhBMP2在较低浓度时(0.02 mg/L)即可以显著增加骨髓细胞的ALP活性，在0.08 mg/L浓度时可显著增加细胞内蛋白质含量(P<0.05), 其作用呈剂量-效应依赖关系. 在0.16 mg/L浓度时对细胞的增殖也有显著促进作用(P<0.05).
表1 rhBMP2对培养骨髓细胞生物学活性的影响
, http://www.100md.com
Tab 1 Effects of rhBMP2 on biological characters of cultured bone marrow cells
(mg/L, X±s)
Item
0
0.02
0.04
0.08
0.16
0.32
0.64
Proliferation
, 百拇医药
0.54±0.02
0.52±0.03
0.55±0.02
0.56±0.01
0.61±0.03a
0.65±0.04a
0.70±0.06b
ALP activity
0.52±0.02
0.56±0.02a
, 百拇医药 0.59±0.01b
0.62±0.05a
0.66±0.03b
0.68±0.04b
0.73±0.03b
Protein content
0.17±0.01
0.16±0.03
0.18±0.03
0.21±0.02a
, 百拇医药
0.24±0.03b
0.28±0.02b
0.29±0.04b
aP<0.05，bP<0.01，vs control.
3 讨论
BMP在骨组织的发生和损伤修复中都具有重要的作用. 植入肌肉中，其诱骨过程先是诱导局部间充质细胞的聚集和分化，包括形态和代谢的改变，如表达Ⅱ型胶原、合成蛋白聚糖、糖胺聚糖等，逐渐形成软骨基质，继而软骨细胞向成骨细胞表型转化，局部ALP活性增高，以软骨内成骨的方式形成骨组织[6]. Yang等[7]用免疫组化方法观察到正常骨组织的BMP主要分布于胶原纤维、骨膜和骨髓基质中,当骨组织损伤时BMP的量迅速增加且活性增强.
, 百拇医药
近年来，人们将BMP与多种载体材料复合，以寻求一种既具有骨引导活性，又具有骨诱导活性的新型植骨材料，进行骨缺损的修复. 但一方面由于BMP来源有限，另一方面由于骨缺损中缺乏靶细胞，目前这种方法还远远不能满足临床治疗的需要.
BMP对细胞主要起促分化作用,BMP不但能促进成骨前体细胞如骨膜细胞分化为成骨细胞,而且可以诱导多能细胞的增殖和向成骨细胞分化. BMP的促分化作用主要通过增加细胞内的ALP活性和胶原蛋白含量表现出来. 根据本实验的结果, 低浓度的rhBMP2(<0.16 mg/L)即可以明显促进培养骨髓细胞的ALP活性和细胞内蛋白质含量, 使骨髓细胞向成骨细胞的表型转化.
Akira等[4]的实验证实,rhBMP2对多能的细胞系ROB-C26,不仅促进其分化,而且可以促进其增殖,而对于分化较高的成骨样细胞系ROB-C20则促进其分化、抑制其增殖,表明BMP对于不同分化程度的细胞效应不尽相同. 本研究利用新鲜骨髓组织进行细胞培养，细胞由处于不同分化阶段的多种细胞成分构成. 我们观察到,较高浓度的rhBMP2(>0.16 mg/L)对培养骨髓细胞也具有明显的促增殖作用,这可能是由于细胞中含有一定数量的低分化细胞.
, 百拇医药
骨髓细胞在矿化条件下在体外即具有很强的成骨能力，可以在培养瓶中合成、分泌胶原纤维，并进一步通过钙质沉积，形成骨小梁样结构[8]. 本研究的结果证实rhBMP2对培养骨髓细胞的ALP活性、蛋白质含量均有明显的促进作用, 对细胞的增殖也有一定的促进作用, 进一步表明骨髓细胞也是BMP重要的靶细胞. 而且骨髓细胞取材方便,易于进行传代培养,因此在体外大量扩增培养骨髓细胞,与BMP复合后移植用于骨缺损的修复,能大大增加BMP的靶细胞，将是骨缺损治疗的一种有效手段,这也是我们下一步的研究内容.
作者简介：陈富林，男，1970-07-06生，河南省沁阳人，汉族. 1994年四医大口腔系本科毕业，1997年获口腔颌面外科专业硕士学位. 现在攻读口腔颌面外科专业博士学位，已发表论文6篇. 电话：(029)3376102
作者单位：陈富林 毛天球 第四军医大学秦都口腔医学院颌面外科 陕西 西安 710033
, 百拇医药
任卫红 杨连甲 第四军医大学秦都口腔医学院病理科
蒲 勤 第四军医大学生物化学教研室
参考文献
1.张森林.人基因重组骨形成蛋白-2与珊瑚复合移植的实验研究.第四军医大学硕士学位论文，1996：6-8
2.Yamaguchi A，Ishizuya T，Kintou N et al.Effects of BMP-2, BMP-4, and BMP-6 on osteoblastic differentiation of bone marrow-derived stromal cell lines,ST2 and MC3T3-G2/PA6.Biochem Biophys Res Commun，1996；220(2): 366-371
3.Rickard DJ，Sullivan TA，Shenker BJ et al.Induction of rapid osteoblast differentiation in rat bone marrow stromal cell cultures by dexamethasone and BMP-2.Dev Biol，1994; 161(1): 218-228
, http://www.100md.com
4.Akira Y,Takenobu K,Tohru I et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2 stimulate osteoblastic maturation and inhibits myogenic differentiation in vitro.J Cell Biol，1996；113(2):681-687
5.司徒镇强,吴军正主编.细胞培养.西安：世界图书出版公司,1996：114-115
6.谭祖健,李起鸿.BMP及其诱导成骨的分子生物学基础.中华骨科杂志，1996；16(1):9-12
7.Yang LJ,Jin Y.Immunohistochemical observations on bone morphogenetic protein in normal and abnormal conditions.Clin Orthop，1990;257(4):249-256
8.陈富林,毛天球.培养兔骨髓细胞体外成骨能力的实验研究.现代口腔医学杂志，1997；11(增刊)：71-72, http://www.100md.com