眼镜王蛇伤抗蛇毒血清治疗的实验研究
余清声 黄劭 朱柳 林振桃 钟满森 管锦霞
摘 要 目的：探讨用抗眼镜蛇毒与抗银环蛇毒血清配伍治疗眼镜王蛇伤的治疗方案。方法：改良雷克健氏法分离纯化眼镜王蛇毒；微量免疫电泳分析5种国产抗蛇毒血清与眼镜王蛇毒组分的共同抗原性；对2种同科属及1种非同科属的抗蛇毒血清进行同科属及非同科属血清配对动物体内保护实验；用孙氏综合法进行LD50实验。结果：眼镜蛇毒LD50为(0.360±0.045)mg/kg。微量免疫电泳证实，抗眼镜蛇毒血清和抗银环蛇毒血清分别与眼镜王蛇毒在Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅱ及Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ组分有沉淀线。用抗眼镜蛇毒与抗银环蛇毒血清配伍治疗眼镜王蛇伤在各用0.1 ml的小剂量下即可达到100%的保护率，优于单用一种抗蛇毒血清以及与其它抗蛇毒血清配伍。中毒程度越深，所需2种抗蛇毒血清的量就越大。结论：用抗眼镜蛇毒与抗银环蛇毒血清配伍可协同治疗眼镜王蛇伤，优于用其它抗蛇毒血清配伍治疗眼镜王蛇伤的治疗方案。
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关键词：抗眼镜蛇毒血清 抗银环蛇毒血清 眼镜王蛇咬伤 治疗
眼镜王蛇毒素以神经毒为主，兼有心脏毒、出血毒的混合毒，毒性大，发病急、病死率高[1]。在目前没有抗眼镜王蛇毒血清可供临床使用的情况下，如何降低眼镜王蛇伤患者的病死率，是蛇伤急救关心的问题[2]。本研究采用抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍治疗眼镜王蛇伤。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料：真空冷冻干燥眼镜王蛇毒粉末，由本研究所提供；精制抗眼镜蛇、银环蛇、蝮蛇、蝰蛇、五步蛇蛇毒血清均由卫生部上海生物制品研究所提供；琼脂糖凝胶为Promega产品；水平电泳仪为北京六一仪器厂生产；健康ICR系纯种小白鼠由广州医学院动物中心提供。
1.2 实验方法：
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1.2.1 眼镜王蛇毒的LD50：按文献[3]方法选用ICR小白鼠70只，平均体重(20±2)g，雌雄各半，随机分组，每组10只，按0.1 ml/10 g腹腔注射眼镜王蛇毒液，观察48小时，记录小白鼠死亡数。
1.2.2 微量免疫电泳反应：按文献[4]方法改良。把眼镜王蛇毒分离纯化成17个组分，各组分用Tri′s盐酸缓冲液，配制成1 %琼脂糖凝胶，温化后倒入平置的洁净玻璃板上，趁热植入毛细管，室温冷却后打孔，在低电压下各孔加入5 mg/ml蛇毒组分液15 μl，调整电压于105、95和85 V，分段电泳各1小时后断开电源，取出毛细管，在槽中加入未稀释的抗蛇毒血清，观察结果。
1.2.3 3种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒的中和作用：
1.2.3.1 3种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒的体内保护作用：选用上述品系小白鼠96只，平均体重(20±2)g，随机分组，每组6只。实验组按10.8 μg/10 g(3LD50)腹腔注射蛇毒液，对照组注射同体积生理盐水，10分钟后，实验组分别用不同剂量未稀释的抗眼镜蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗蝰蛇毒血清以及这3种抗蛇毒血清中两两配伍进行救治，观察72小时，记录每组小鼠存活数。
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1.2.3.2 抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清不同时间给药对眼镜王蛇毒(3LD50)中毒的体内保护作用影响：选用上述品系小白鼠42只，平均体重(20±2)g，随机分组，每组6只。实验组按10.8 μg/10 g(3LD50)腹腔注射蛇毒液，对照组注射同体积生理盐水，在不同时间内实验组分别用未稀释的抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍各0.20 ml，观察72小时，记录每组小鼠存活数。
1.2.3.3 对不同中毒状况抗眼镜蛇及抗银环蛇毒血清用量比较：小白鼠36只，平均体重(20±2)g，随机分组，每组6只。实验组分别按7.2 μg/10 g(2LD50)、10.8 μg/10 g(3 LD50)腹腔注射蛇毒液，对照组注射同体积生理盐水，在同时间内实验组分别用未稀释的抗眼镜蛇毒血清0.40 ml、抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍各0.05 ml和各0.10 ml，观察72小时，记录每组小鼠存活数。
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2 结 果
2.1 眼镜王蛇毒LD50：按文献[3]方法，求得LD50=(0.360±0.045)mg/kg。
2.2 微量免疫电泳反应：眼镜王蛇毒分离出17个组分，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅹ Ⅱ具有酶活性；Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅲ具有神经毒活性，而Ⅹ Ⅳ、Ⅹ Ⅴ、Ⅹ Ⅵ、Ⅹ Ⅴ Ⅱ有局部出血效应。以各组分为抗原，国产5种抗蛇毒血清为抗体，其免疫电泳结果见表1。
表1 5种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒组分微量免疫电泳沉淀线比较条
抗蛇毒血清
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
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Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
Ⅶ
Ⅷ
Ⅸ
Ⅹ
Ⅺ
Ⅻ
ⅩⅢ
ⅩⅣ
ⅩⅤ
ⅩⅥ
ⅩⅦ
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抗眼镜蛇毒血清
4
2
1
1
1
1
1
1
抗银环蛇毒血清
1
1
1
1
, 百拇医药
抗蝰蛇毒血清
1
1
1
1
1
抗五步蛇毒血清
1
1
1
1
1
抗蝮蛇毒血清
1
, 百拇医药
1
1
2.3 3种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒的中和作用：
2.3.1 3种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒体内保护作用见表2。单用抗眼镜蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗蝰蛇毒血清均需用极大剂量才对3LD50眼镜王蛇毒中毒有较好保护作用；3种抗蛇毒血清在两两配伍中，抗眼镜蛇毒血清和抗银环蛇毒血清配伍各只用0.1 ml就能达到100%的保护，其它的两两组合均未能达到此效果。
表2 3种抗蛇毒血清对3LD50眼镜王蛇毒的体内保护作用
组别
用量
(ml/20 g)
, 百拇医药
存活数/
动物数
保护率
(%)
对照组(生理盐水)
0.40
0/6
0
抗眼镜蛇毒血清
0.10
0/6
0
抗眼镜蛇毒血清
, 百拇医药
0.20
1/6
16.7
抗眼镜蛇毒血清
0.30
3/6
50.0
抗眼镜蛇毒血清
0.40
6/6
100.0
抗银环蛇毒血清
0.20
, 百拇医药
0/6
0
抗银环蛇毒血清
0.40
5/6
86.6
抗蝰蛇毒血清
0.20
0/6
0
抗蝰蛇毒血清
0.40
3/6
, 百拇医药
50.0
抗眼镜蛇毒血清+抗银环蛇毒血清
0.20
6/6
100.0
抗眼镜蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.20
1/6
16.7
抗眼镜蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.40
6/6
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100.0
抗银环蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.05
1/6
16.7
抗银环蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.10
4/6
66.7
抗银环蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.20
5/6
, 百拇医药
83.3
抗银环蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.40
6/6
100.0
2.3.2 抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清不同时间给药对3LD50眼镜王蛇毒中毒时体内保护作用的影响见表3。对于3LD50眼镜王蛇毒中毒的小白鼠，给予眼镜王蛇毒后，于10分钟内注射抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清各0.20 ml，均有100%的保护率；随着给药时间倍数延长，其保护率相应下降，呈时间依赖性。
表3 抗眼镜蛇毒血清和抗银环蛇毒血清配伍不同时间给药
对3LD50眼镜王蛇毒中毒体内保护作用的影响
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组别
存活数/动物数
保护率(%)
对照组(生理盐水0.40 ml)
0/6
0
注毒后时间(min) 0
6/6
100.0
5
6/6
100.0
10
, 百拇医药
6/6
100.0
20
5/6
83.3
30
4/6
66.7
40
1/6
16.7
2.3.3 对不同中毒状况抗眼镜蛇毒血清+抗银环蛇毒血清用量比较：对于不同状态(2LD50、3LD50)的眼镜王蛇毒中毒小白鼠，单用抗眼镜蛇毒血清，需0.40 ml才有100%的保护率。在2LD50中毒状态下，用抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍，各自的剂量只需0.05 ml就可达到100%的保护率，是单用抗眼镜蛇毒血清疗效的8倍。但随着中毒状态从2LD50发展为3LD50时，抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍的量要增大到0.10 ml，仅是单用抗眼镜蛇毒血清疗效的4倍。中毒程度越重，抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍的量就越大。3 讨 论
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蛇毒具有能同相应的蛇毒抗体发生反应的特性，如眼镜蛇毒只能同抗眼镜蛇毒血清发生免疫反应，不能同抗蝮蛇、五步蛇毒血清发生反应。蛇毒抗原的特异性是由蛇毒抗原决定簇所决定的，而且同科属(亚种)具有种属(亚种)的特异性。但是，蛇毒的毒性基团与抗原决定簇并非相同[1]，本研究也证明了这一点。眼镜王蛇与眼镜蛇、银环蛇同属眼镜蛇科，其致死成分主要是神经毒。有研究表明眼镜王蛇与眼镜蛇存在免疫沉淀线[5，6]。有用抗眼镜蛇毒血清或抗银环蛇毒血清治疗眼镜王蛇伤的报道[2，5]，但广东蛇伤防治研究网络在临床单用抗眼镜蛇毒血清治疗眼镜王蛇伤却未取得好的治疗效果。
眼镜蛇科的神经毒按其作用方式可分为突触前神经毒及突触后神经毒，眼镜蛇毒的神经毒是突触后神经毒，其肽链有长短之分[7]；而银环蛇毒中的神经毒可分为突触前神经毒(β-bungarotoxin)及突触后神经毒(α-bungarotoxin)，对神经肌肉接头起双重抑制作用[8]。眼镜王蛇毒中的神经毒含Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅱ7个不同组分，这些与眼镜蛇毒和银环蛇毒都有相似之处[8]，给治疗带来了困难。
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在微量免疫电泳反应上，本研究证实，抗眼镜蛇毒血清对眼镜王蛇毒的组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅱ都有免疫电泳沉淀线，表明眼镜蛇毒与眼镜王蛇毒具有相当数量的共同抗原性，尤其是眼镜蛇毒的神经毒活性组分与眼镜王蛇的神经毒活性组分的共同抗原性更高；而抗银环蛇毒血清对眼镜王蛇毒的Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ有免疫电泳沉淀线，表明眼镜王蛇毒与银环蛇毒也有共同抗原性。蛇毒是蛋白混合物，除毒蛋白外，还含有许多酶，它们所具有的复杂而奇特的生理和药理活性，与蛇伤时造成机体溶血、出血、肌肉坏死、休克等病理现象密切相关。如乙酰胆碱酯酶、磷脂酶A2等在眼镜蛇科的蛇毒中含量很高[9]；而蝰蛇科的蛇毒中富含蛋白水解酶、氨基酸酯酶；眼镜王蛇毒也含有蛋白水解酶和氨基酸酯酶，但活力较低[10]。由于这些酶的同源性，所以眼镜王蛇毒的组分在微量免疫电泳反应上表现为Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅱ各组分与5种抗蛇毒血清在不同程度上都有沉淀线出现。可以说，眼镜王蛇毒在神经毒以及蛇毒酶上与同科属的眼镜蛇、银环蛇的同源性比蝮蛇科强。
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在抗眼镜蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗蝰蛇毒血清3种血清对眼镜王蛇毒中毒(2LD50)的保护实验中，单用其中一种血清的保护效果都不佳，而抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍时，其疗效是单用抗眼镜蛇毒血清的8倍，有明显的协同作用。随着眼镜王蛇毒中毒程度到3LD50，抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清的用量相应增多，但仍然有协同作用。这一结果提示，临床用药应随中毒症状的加深而增加。至于抗眼镜蛇毒血清与抗蝰蛇毒血清配伍，抗银环蛇毒血清与抗蝰蛇毒血清配伍均只是相加的作用。保护实验的结果与微量免疫电泳结果一致。
抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍时，对眼镜王蛇毒(3LD50)中毒的体内保护，在中毒后10分钟，随给药时间倍数延长，保护率相应下降，呈时间依赖性。提示蛇伤后越早抢救，疗效越好。
基金项目：广州市科委重点科研基金资助项目(94-Z-28)
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作者简介：余清声(1947-)，男(汉族)，广东饶平人，副教授，硕士生导师。已完成国家、广东省自然科学基金及广州市科委项目10余项。获教育部、省科技进步二等奖各1项，省自然科学三等奖1项，省医药卫生、市自然科学奖5项，发表论文30多篇。现任中国中西医结合学会蛇伤急救学组副主任委员，中国毒理学会生物毒素毒理专业委员会副主任委员.
作者单位：余清声(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
黄 劭(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
朱 柳(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
林振桃(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
钟满森(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
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管锦霞(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
参考文献
[1]覃公平主编.中国毒蛇学.第1版.南宁：广西科学技术出版社，1995.776-780.
[2]李其斌，黄嫣娇，方饶墀，等.抢救眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)咬伤中毒12例临床报告.蛇志，1993，5(2)：25-28.
[3]孙瑞元.定量药理学.第1版.北京：人民卫生出版社，1986.154-169.
[4]雷克健，胡纫秋，王锦兰.眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)毒中L氨基酸的分离纯化和理化性质的研究.动物学研究，1981，2(4增刊)：43-50.
[5]蒋克贤.抗蛇毒血清治疗蛇伤新进展.见：陈远聪，袁士龙主编.毒素的研究和利用.中国生物化学会专题讨论会文集(4).第1版.北京：科学出版社，1988，96-104.
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[6]符民桂，植飞，管锦霞，等.五种抗蛇毒血清对眼镜王蛇的中和作用.广州医学院学报，1995，23(4)：1-4.
[7]Lee C Y,Chang S L,Kau S T,et al.Chromatographic separation of the venom of Bungarus multicinctus and characterization of its components.Chromatography,1972,72(1):71-82.
[8]黄敏州，王晴川，刘广芬.福建眼镜王蛇毒柱层析分离及生化药理特性.中国药理学与毒理学杂志，1990，4(2)：127-130.
[9]林南琴，张辉时，慕见凤，等.广西眼镜王蛇毒神经毒素的一级结构.生物化学与生物物理学报，1984，16(6)：592-596.
[10]吴兴陆，陈远聪.我国十种蛇毒磷酯A的活力比较.动物学研究，1981，2(4增刊)：24-28., 百拇医药
摘 要 目的：探讨用抗眼镜蛇毒与抗银环蛇毒血清配伍治疗眼镜王蛇伤的治疗方案。方法：改良雷克健氏法分离纯化眼镜王蛇毒；微量免疫电泳分析5种国产抗蛇毒血清与眼镜王蛇毒组分的共同抗原性；对2种同科属及1种非同科属的抗蛇毒血清进行同科属及非同科属血清配对动物体内保护实验；用孙氏综合法进行LD50实验。结果：眼镜蛇毒LD50为(0.360±0.045)mg/kg。微量免疫电泳证实，抗眼镜蛇毒血清和抗银环蛇毒血清分别与眼镜王蛇毒在Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅱ及Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ组分有沉淀线。用抗眼镜蛇毒与抗银环蛇毒血清配伍治疗眼镜王蛇伤在各用0.1 ml的小剂量下即可达到100%的保护率，优于单用一种抗蛇毒血清以及与其它抗蛇毒血清配伍。中毒程度越深，所需2种抗蛇毒血清的量就越大。结论：用抗眼镜蛇毒与抗银环蛇毒血清配伍可协同治疗眼镜王蛇伤，优于用其它抗蛇毒血清配伍治疗眼镜王蛇伤的治疗方案。
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关键词：抗眼镜蛇毒血清 抗银环蛇毒血清 眼镜王蛇咬伤 治疗
眼镜王蛇毒素以神经毒为主，兼有心脏毒、出血毒的混合毒，毒性大，发病急、病死率高[1]。在目前没有抗眼镜王蛇毒血清可供临床使用的情况下，如何降低眼镜王蛇伤患者的病死率，是蛇伤急救关心的问题[2]。本研究采用抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍治疗眼镜王蛇伤。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料：真空冷冻干燥眼镜王蛇毒粉末，由本研究所提供；精制抗眼镜蛇、银环蛇、蝮蛇、蝰蛇、五步蛇蛇毒血清均由卫生部上海生物制品研究所提供；琼脂糖凝胶为Promega产品；水平电泳仪为北京六一仪器厂生产；健康ICR系纯种小白鼠由广州医学院动物中心提供。
1.2 实验方法：
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1.2.1 眼镜王蛇毒的LD50：按文献[3]方法选用ICR小白鼠70只，平均体重(20±2)g，雌雄各半，随机分组，每组10只，按0.1 ml/10 g腹腔注射眼镜王蛇毒液，观察48小时，记录小白鼠死亡数。
1.2.2 微量免疫电泳反应：按文献[4]方法改良。把眼镜王蛇毒分离纯化成17个组分，各组分用Tri′s盐酸缓冲液，配制成1 %琼脂糖凝胶，温化后倒入平置的洁净玻璃板上，趁热植入毛细管，室温冷却后打孔，在低电压下各孔加入5 mg/ml蛇毒组分液15 μl，调整电压于105、95和85 V，分段电泳各1小时后断开电源，取出毛细管，在槽中加入未稀释的抗蛇毒血清，观察结果。
1.2.3 3种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒的中和作用：
1.2.3.1 3种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒的体内保护作用：选用上述品系小白鼠96只，平均体重(20±2)g，随机分组，每组6只。实验组按10.8 μg/10 g(3LD50)腹腔注射蛇毒液，对照组注射同体积生理盐水，10分钟后，实验组分别用不同剂量未稀释的抗眼镜蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗蝰蛇毒血清以及这3种抗蛇毒血清中两两配伍进行救治，观察72小时，记录每组小鼠存活数。
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1.2.3.2 抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清不同时间给药对眼镜王蛇毒(3LD50)中毒的体内保护作用影响：选用上述品系小白鼠42只，平均体重(20±2)g，随机分组，每组6只。实验组按10.8 μg/10 g(3LD50)腹腔注射蛇毒液，对照组注射同体积生理盐水，在不同时间内实验组分别用未稀释的抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍各0.20 ml，观察72小时，记录每组小鼠存活数。
1.2.3.3 对不同中毒状况抗眼镜蛇及抗银环蛇毒血清用量比较：小白鼠36只，平均体重(20±2)g，随机分组，每组6只。实验组分别按7.2 μg/10 g(2LD50)、10.8 μg/10 g(3 LD50)腹腔注射蛇毒液，对照组注射同体积生理盐水，在同时间内实验组分别用未稀释的抗眼镜蛇毒血清0.40 ml、抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍各0.05 ml和各0.10 ml，观察72小时，记录每组小鼠存活数。
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2 结 果
2.1 眼镜王蛇毒LD50：按文献[3]方法，求得LD50=(0.360±0.045)mg/kg。
2.2 微量免疫电泳反应：眼镜王蛇毒分离出17个组分，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅹ Ⅱ具有酶活性；Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅲ具有神经毒活性，而Ⅹ Ⅳ、Ⅹ Ⅴ、Ⅹ Ⅵ、Ⅹ Ⅴ Ⅱ有局部出血效应。以各组分为抗原，国产5种抗蛇毒血清为抗体，其免疫电泳结果见表1。
表1 5种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒组分微量免疫电泳沉淀线比较条
抗蛇毒血清
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
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Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
Ⅶ
Ⅷ
Ⅸ
Ⅹ
Ⅺ
Ⅻ
ⅩⅢ
ⅩⅣ
ⅩⅤ
ⅩⅥ
ⅩⅦ
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抗眼镜蛇毒血清
4
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抗银环蛇毒血清
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抗蝰蛇毒血清
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抗五步蛇毒血清
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抗蝮蛇毒血清
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2.3 3种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒的中和作用：
2.3.1 3种抗蛇毒血清对眼镜王蛇毒体内保护作用见表2。单用抗眼镜蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗蝰蛇毒血清均需用极大剂量才对3LD50眼镜王蛇毒中毒有较好保护作用；3种抗蛇毒血清在两两配伍中，抗眼镜蛇毒血清和抗银环蛇毒血清配伍各只用0.1 ml就能达到100%的保护，其它的两两组合均未能达到此效果。
表2 3种抗蛇毒血清对3LD50眼镜王蛇毒的体内保护作用
组别
用量
(ml/20 g)
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存活数/
动物数
保护率
(%)
对照组(生理盐水)
0.40
0/6
0
抗眼镜蛇毒血清
0.10
0/6
0
抗眼镜蛇毒血清
, 百拇医药
0.20
1/6
16.7
抗眼镜蛇毒血清
0.30
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抗眼镜蛇毒血清
0.40
6/6
100.0
抗银环蛇毒血清
0.20
, 百拇医药
0/6
0
抗银环蛇毒血清
0.40
5/6
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抗蝰蛇毒血清
0.20
0/6
0
抗蝰蛇毒血清
0.40
3/6
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抗眼镜蛇毒血清+抗银环蛇毒血清
0.20
6/6
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抗眼镜蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.20
1/6
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抗眼镜蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.40
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抗银环蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.05
1/6
16.7
抗银环蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.10
4/6
66.7
抗银环蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.20
5/6
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83.3
抗银环蛇毒血清+抗蝰蛇毒血清
0.40
6/6
100.0
2.3.2 抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清不同时间给药对3LD50眼镜王蛇毒中毒时体内保护作用的影响见表3。对于3LD50眼镜王蛇毒中毒的小白鼠，给予眼镜王蛇毒后，于10分钟内注射抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清各0.20 ml，均有100%的保护率；随着给药时间倍数延长，其保护率相应下降，呈时间依赖性。
表3 抗眼镜蛇毒血清和抗银环蛇毒血清配伍不同时间给药
对3LD50眼镜王蛇毒中毒体内保护作用的影响
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组别
存活数/动物数
保护率(%)
对照组(生理盐水0.40 ml)
0/6
0
注毒后时间(min) 0
6/6
100.0
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6/6
100.0
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83.3
30
4/6
66.7
40
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2.3.3 对不同中毒状况抗眼镜蛇毒血清+抗银环蛇毒血清用量比较：对于不同状态(2LD50、3LD50)的眼镜王蛇毒中毒小白鼠，单用抗眼镜蛇毒血清，需0.40 ml才有100%的保护率。在2LD50中毒状态下，用抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍，各自的剂量只需0.05 ml就可达到100%的保护率，是单用抗眼镜蛇毒血清疗效的8倍。但随着中毒状态从2LD50发展为3LD50时，抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍的量要增大到0.10 ml，仅是单用抗眼镜蛇毒血清疗效的4倍。中毒程度越重，抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍的量就越大。3 讨 论
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蛇毒具有能同相应的蛇毒抗体发生反应的特性，如眼镜蛇毒只能同抗眼镜蛇毒血清发生免疫反应，不能同抗蝮蛇、五步蛇毒血清发生反应。蛇毒抗原的特异性是由蛇毒抗原决定簇所决定的，而且同科属(亚种)具有种属(亚种)的特异性。但是，蛇毒的毒性基团与抗原决定簇并非相同[1]，本研究也证明了这一点。眼镜王蛇与眼镜蛇、银环蛇同属眼镜蛇科，其致死成分主要是神经毒。有研究表明眼镜王蛇与眼镜蛇存在免疫沉淀线[5，6]。有用抗眼镜蛇毒血清或抗银环蛇毒血清治疗眼镜王蛇伤的报道[2，5]，但广东蛇伤防治研究网络在临床单用抗眼镜蛇毒血清治疗眼镜王蛇伤却未取得好的治疗效果。
眼镜蛇科的神经毒按其作用方式可分为突触前神经毒及突触后神经毒，眼镜蛇毒的神经毒是突触后神经毒，其肽链有长短之分[7]；而银环蛇毒中的神经毒可分为突触前神经毒(β-bungarotoxin)及突触后神经毒(α-bungarotoxin)，对神经肌肉接头起双重抑制作用[8]。眼镜王蛇毒中的神经毒含Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅱ7个不同组分，这些与眼镜蛇毒和银环蛇毒都有相似之处[8]，给治疗带来了困难。
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在微量免疫电泳反应上，本研究证实，抗眼镜蛇毒血清对眼镜王蛇毒的组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅱ都有免疫电泳沉淀线，表明眼镜蛇毒与眼镜王蛇毒具有相当数量的共同抗原性，尤其是眼镜蛇毒的神经毒活性组分与眼镜王蛇的神经毒活性组分的共同抗原性更高；而抗银环蛇毒血清对眼镜王蛇毒的Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ有免疫电泳沉淀线，表明眼镜王蛇毒与银环蛇毒也有共同抗原性。蛇毒是蛋白混合物，除毒蛋白外，还含有许多酶，它们所具有的复杂而奇特的生理和药理活性，与蛇伤时造成机体溶血、出血、肌肉坏死、休克等病理现象密切相关。如乙酰胆碱酯酶、磷脂酶A2等在眼镜蛇科的蛇毒中含量很高[9]；而蝰蛇科的蛇毒中富含蛋白水解酶、氨基酸酯酶；眼镜王蛇毒也含有蛋白水解酶和氨基酸酯酶，但活力较低[10]。由于这些酶的同源性，所以眼镜王蛇毒的组分在微量免疫电泳反应上表现为Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅹ Ⅰ、Ⅹ Ⅱ各组分与5种抗蛇毒血清在不同程度上都有沉淀线出现。可以说，眼镜王蛇毒在神经毒以及蛇毒酶上与同科属的眼镜蛇、银环蛇的同源性比蝮蛇科强。
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在抗眼镜蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗蝰蛇毒血清3种血清对眼镜王蛇毒中毒(2LD50)的保护实验中，单用其中一种血清的保护效果都不佳，而抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍时，其疗效是单用抗眼镜蛇毒血清的8倍，有明显的协同作用。随着眼镜王蛇毒中毒程度到3LD50，抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清的用量相应增多，但仍然有协同作用。这一结果提示，临床用药应随中毒症状的加深而增加。至于抗眼镜蛇毒血清与抗蝰蛇毒血清配伍，抗银环蛇毒血清与抗蝰蛇毒血清配伍均只是相加的作用。保护实验的结果与微量免疫电泳结果一致。
抗眼镜蛇毒血清与抗银环蛇毒血清配伍时，对眼镜王蛇毒(3LD50)中毒的体内保护，在中毒后10分钟，随给药时间倍数延长，保护率相应下降，呈时间依赖性。提示蛇伤后越早抢救，疗效越好。
基金项目：广州市科委重点科研基金资助项目(94-Z-28)
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作者简介：余清声(1947-)，男(汉族)，广东饶平人，副教授，硕士生导师。已完成国家、广东省自然科学基金及广州市科委项目10余项。获教育部、省科技进步二等奖各1项，省自然科学三等奖1项，省医药卫生、市自然科学奖5项，发表论文30多篇。现任中国中西医结合学会蛇伤急救学组副主任委员，中国毒理学会生物毒素毒理专业委员会副主任委员.
作者单位：余清声(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
黄 劭(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
朱 柳(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
林振桃(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
钟满森(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
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管锦霞(广州蛇毒研究所，广东 广州 510182)
参考文献
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[7]Lee C Y,Chang S L,Kau S T,et al.Chromatographic separation of the venom of Bungarus multicinctus and characterization of its components.Chromatography,1972,72(1):71-82.
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