一种异硫氰酸荧光素标记脂多糖的新方法
龚建平 韩本立
摘 要 目的 介绍一种异硫氰酸荧光素(FITC)标记脂多糖(LPS)的新方法。方法 用三乙胺将4 mg LPS双链离解为单链结构后，再用FITC标记LPS，通过分光光度计测定其标记率，并与旧式FITC标记LPS的方法进行比较。同时测定标记后FITC-LPS的生物活性、刺激单核细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的能力及与单核细胞膜的结合能力。结果 新方法FITC标记LPS的标记率为1 mol LPS中FITC占0.980 mol，原方法FITC的标记率为1 mol LPS中FITC占0.025 mol，两者比较差异有显著性(P@0.05)。而FITC-LPS与标准LPS的生物学活性、刺激单核细胞分泌TNF-α的能力及与单核细胞膜的结合能力差异无显著性(P#0.05)。结论 新式FITC标记LPS的方法其标记率高，方法简单，且保存LPS的生物学特性，是实验外科中研究LPS有效的方法。
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关键词：脂多糖 异硫氰酸荧光素 标记方法
本研究旨在探讨一种异硫氢酸荧光素(FITC)标记脂多糖(LPS)的新方法，其标记率高、方法简单，且为非放射性标记，具有较广泛的应用前景，现报道如下。材料与方法
1.实验材料：LPS(O111∶B4)和FITC购于Sigman公司，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒购于华美生物工程公司，鲎试剂盒购于上海医化所。
2.标记方法：旧式FITC标记LPS的方法按Weersink等[1]介绍的方法进行。新式标记法步骤为：将4 mg LPS加入0.5%三乙胺2 ml内0℃搅拌20 min，使LPS双链离解为单链结构。用10 μl 1 mol/L的盐酸将其pH值调节为5，然后加入含5 mg FITC的0.1 mol/L磷酸钠溶液1.5 ml(pH9.5)，并在37 ℃下搅拌孵育3 h，孵育后，在4 ℃下将其混合物与磷酸钠溶液彻底分离、离心后，去上清即得FITC-LPS。将2种方法所得到的FITC-LPS溶液用分光光度计(492 nm)测定FITC的浓度。
, 百拇医药
3.单核细胞的分离方法：参照Medvedey等[2]介绍的方法进行。将分离的单核细胞放入1640培养液中培养12 h，调整细胞浓度为1×109个/L待用。
4.检测指标：(1)FITC-LPS生物活性测定：FITC-LPS用鲎试验微量基质显色法，测定其生物活性并与标准LPS(O111∶B4)相比较。(2)FITC-LPS诱导单核细胞TNF-α释放：不同浓度(0、20、40、60和100 μg)LPS或FITC-LPS与单核细胞(1×109 个/L)共同孵育2 h，取其上清液用ELISA法测TNF-α含量(重复3次测定，结果取其平均值)，具体方法按试剂盒说明书进行。(3)FITC-LPS与单核细胞膜结合能力的测定：采用台盼兰灭活法[2]，主要步骤为：分别在4 ℃和37 ℃条件下，将单核细胞(1×109个/L)与FITC-LPS一起孵育2 h，冲洗，再放入醋酸钠缓冲液内(pH 5.8)，用流式细胞仪(FCM)测定结合有荧光素的10 000细胞的荧光强度；然后将该标本与含有0.02%台盼兰的醋酸钠缓冲液孵育20 s,细胞再用醋酸钠缓冲液冲洗，再次测其荧光强度。结合到细胞表面的FITC-LPS的百分率按以下公式计算：100(A-bgr)/(B-bgr)×100%。其中A是台盼兰染色后的平均荧光强度，B是染色前的平均荧光强度，bgr是对照细胞的背景荧光强度(重复3次测定，结果取其平均值)。
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结 果
1.FITC标记LPS的标记率：旧式方法1 mol LPS溶液中FITC的含量为0.025 mol，即FITC∶LPS的标记比例为1∶40。新式方法1 mol LPS溶液中FITC的含量为0.980 mol，即FITC：LPS的标记比较为1∶1.02，新式方法FITC的标记率显著高于旧式法(P<0.05)。
2.鲎试验法测定结果：FITC-LPS与标准LPS(O111∶B4)生物活性基本一致，两者间相比较差异无显著性(P>0.05)
3.单核细胞分泌TNF-α量变化：分别将不同浓度FITC-LPS和LPS与单核细胞一起孵育2 h，观测其分泌TNF-α的情况，发现2种LPS刺激单核细胞分泌TNF-α的量相比较，差异无显著性(P>0.05)。
4.FITC-LPS与单核细胞膜的结合能力：在4℃时，FITC-LPS与单核细胞膜的结合能力为47%，LPS与单核细胞膜的结合能力为50%；在37℃，FITC-LPS与单核细胞膜的结合能力为86%，LPS与单核细胞膜的结合能力为93%。各时相点比较差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
讨 论
LPS是研究感染的重要材料之一，LPS与细胞表面的结合是观察细胞激活及激活后信号传导的关键步骤[3]。本实验中介绍的FITC标记LPS的方法，其基本原理是先将LPS转化成单链状态，在此基础上再用FITC进行标记，其标记率高(1/1.02)、方法简单，且为非放射性标记，结合FCM的应用，是实验外科中研究LPS的一种比较有效的方法，具有较广泛的应用前景。
为了观察用FITC标记后的LPS的生物学特性及与细胞结合能力有无变化，我们用FITC-LPS刺激单核细胞观测其分泌TNF-α的能力，发现在FITC-LPS刺激下，单核细胞分泌TNF-α的量与天然LPS刺激下分泌的量基本一致，说明FITC标记后的LPS仍保留刺激单核细胞分泌细胞因子的生物活性，这与文献报道不一致，其差异有待进一步分析[4]。标记后的LPS与单核细胞在0 ℃和37 ℃时与单核细胞膜的结合率分别为47%和86%，与标准LPS的结合力一致，说明标记FITC后并未影响LPS与细胞膜的结合能力。
, 百拇医药
FITC结合到LPS分子上的确切机理仍不十分清楚，根据有关LPS生物活性区的研究发现，LPS由多糖部分和脂质部分构成，前者是LPS的主要生物学活性成分，后者的主要成分为脂质IVa，它不参与LPS诱导细胞合成和分泌肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-1和白细胞介素(IL)-6等炎性介质，所以FITC可能是与LPS的脂质部分即IVa结合[5]。通过对IVa或LPS的去酰基不引起对CD14依赖的结合抑制，表明FITC与LPS的结合和LPS对细胞的刺激是两个独立的过程。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970719)
作者单位：龚建平(400038重庆，第三军医大学西南医院肝胆外科中心)
韩本立(400038重庆，第三军医大学西南医院肝胆外科中心)
参考文献
, 百拇医药
[1]Weersink AL,Kessel KP,Torensma R, et al. Binding of rough lipo-polysaccharides (LPS) to human leukocytes. J Immunol, 1990,145:318-324.
[2]Medvedey AE, Flo T,Ingalls RR,et al.Involvement of CD14 and complement receptors CR3 and CR4 in nuclear factor-kB activation and TNF production induced by lipopolysaccharide and group B streptococcal cell walls.J Immunol,1998,160:4 535-4 542.
[3]Bellezzo JM,Britton RS,Bacon BR,et al. LPS-mediated NF-kB activation in rat kupffer cells can be induced independently of CD14.Am J Physiol,1996,270:956-961.
, http://www.100md.com
[4]Troelstra A, Szalmas PA,Miltenburg LA, et al. Saturable CD14-dependent binding of flurescein-labeled lipopolysaccharide to human monocytes.Infection Immunty,1997,65:2 272-2 277.
[5]Netea MG,Kullberg BJ,Meer WM.Lipopolysaccharide-induced production of tumour mecrosis factor and interleukin-1 is differentially regulated at the receptor level:the role of CD14-depenent and CD14-independent pathways.Immunology,1998,94:340-344., http://www.100md.com
摘 要 目的 介绍一种异硫氰酸荧光素(FITC)标记脂多糖(LPS)的新方法。方法 用三乙胺将4 mg LPS双链离解为单链结构后，再用FITC标记LPS，通过分光光度计测定其标记率，并与旧式FITC标记LPS的方法进行比较。同时测定标记后FITC-LPS的生物活性、刺激单核细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的能力及与单核细胞膜的结合能力。结果 新方法FITC标记LPS的标记率为1 mol LPS中FITC占0.980 mol，原方法FITC的标记率为1 mol LPS中FITC占0.025 mol，两者比较差异有显著性(P@0.05)。而FITC-LPS与标准LPS的生物学活性、刺激单核细胞分泌TNF-α的能力及与单核细胞膜的结合能力差异无显著性(P#0.05)。结论 新式FITC标记LPS的方法其标记率高，方法简单，且保存LPS的生物学特性，是实验外科中研究LPS有效的方法。
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关键词：脂多糖 异硫氰酸荧光素 标记方法
本研究旨在探讨一种异硫氢酸荧光素(FITC)标记脂多糖(LPS)的新方法，其标记率高、方法简单，且为非放射性标记，具有较广泛的应用前景，现报道如下。材料与方法
1.实验材料：LPS(O111∶B4)和FITC购于Sigman公司，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒购于华美生物工程公司，鲎试剂盒购于上海医化所。
2.标记方法：旧式FITC标记LPS的方法按Weersink等[1]介绍的方法进行。新式标记法步骤为：将4 mg LPS加入0.5%三乙胺2 ml内0℃搅拌20 min，使LPS双链离解为单链结构。用10 μl 1 mol/L的盐酸将其pH值调节为5，然后加入含5 mg FITC的0.1 mol/L磷酸钠溶液1.5 ml(pH9.5)，并在37 ℃下搅拌孵育3 h，孵育后，在4 ℃下将其混合物与磷酸钠溶液彻底分离、离心后，去上清即得FITC-LPS。将2种方法所得到的FITC-LPS溶液用分光光度计(492 nm)测定FITC的浓度。
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3.单核细胞的分离方法：参照Medvedey等[2]介绍的方法进行。将分离的单核细胞放入1640培养液中培养12 h，调整细胞浓度为1×109个/L待用。
4.检测指标：(1)FITC-LPS生物活性测定：FITC-LPS用鲎试验微量基质显色法，测定其生物活性并与标准LPS(O111∶B4)相比较。(2)FITC-LPS诱导单核细胞TNF-α释放：不同浓度(0、20、40、60和100 μg)LPS或FITC-LPS与单核细胞(1×109 个/L)共同孵育2 h，取其上清液用ELISA法测TNF-α含量(重复3次测定，结果取其平均值)，具体方法按试剂盒说明书进行。(3)FITC-LPS与单核细胞膜结合能力的测定：采用台盼兰灭活法[2]，主要步骤为：分别在4 ℃和37 ℃条件下，将单核细胞(1×109个/L)与FITC-LPS一起孵育2 h，冲洗，再放入醋酸钠缓冲液内(pH 5.8)，用流式细胞仪(FCM)测定结合有荧光素的10 000细胞的荧光强度；然后将该标本与含有0.02%台盼兰的醋酸钠缓冲液孵育20 s,细胞再用醋酸钠缓冲液冲洗，再次测其荧光强度。结合到细胞表面的FITC-LPS的百分率按以下公式计算：100(A-bgr)/(B-bgr)×100%。其中A是台盼兰染色后的平均荧光强度，B是染色前的平均荧光强度，bgr是对照细胞的背景荧光强度(重复3次测定，结果取其平均值)。
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结 果
1.FITC标记LPS的标记率：旧式方法1 mol LPS溶液中FITC的含量为0.025 mol，即FITC∶LPS的标记比例为1∶40。新式方法1 mol LPS溶液中FITC的含量为0.980 mol，即FITC：LPS的标记比较为1∶1.02，新式方法FITC的标记率显著高于旧式法(P<0.05)。
2.鲎试验法测定结果：FITC-LPS与标准LPS(O111∶B4)生物活性基本一致，两者间相比较差异无显著性(P>0.05)
3.单核细胞分泌TNF-α量变化：分别将不同浓度FITC-LPS和LPS与单核细胞一起孵育2 h，观测其分泌TNF-α的情况，发现2种LPS刺激单核细胞分泌TNF-α的量相比较，差异无显著性(P>0.05)。
4.FITC-LPS与单核细胞膜的结合能力：在4℃时，FITC-LPS与单核细胞膜的结合能力为47%，LPS与单核细胞膜的结合能力为50%；在37℃，FITC-LPS与单核细胞膜的结合能力为86%，LPS与单核细胞膜的结合能力为93%。各时相点比较差异无显著性(P>0.05)。
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讨 论
LPS是研究感染的重要材料之一，LPS与细胞表面的结合是观察细胞激活及激活后信号传导的关键步骤[3]。本实验中介绍的FITC标记LPS的方法，其基本原理是先将LPS转化成单链状态，在此基础上再用FITC进行标记，其标记率高(1/1.02)、方法简单，且为非放射性标记，结合FCM的应用，是实验外科中研究LPS的一种比较有效的方法，具有较广泛的应用前景。
为了观察用FITC标记后的LPS的生物学特性及与细胞结合能力有无变化，我们用FITC-LPS刺激单核细胞观测其分泌TNF-α的能力，发现在FITC-LPS刺激下，单核细胞分泌TNF-α的量与天然LPS刺激下分泌的量基本一致，说明FITC标记后的LPS仍保留刺激单核细胞分泌细胞因子的生物活性，这与文献报道不一致，其差异有待进一步分析[4]。标记后的LPS与单核细胞在0 ℃和37 ℃时与单核细胞膜的结合率分别为47%和86%，与标准LPS的结合力一致，说明标记FITC后并未影响LPS与细胞膜的结合能力。
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FITC结合到LPS分子上的确切机理仍不十分清楚，根据有关LPS生物活性区的研究发现，LPS由多糖部分和脂质部分构成，前者是LPS的主要生物学活性成分，后者的主要成分为脂质IVa，它不参与LPS诱导细胞合成和分泌肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-1和白细胞介素(IL)-6等炎性介质，所以FITC可能是与LPS的脂质部分即IVa结合[5]。通过对IVa或LPS的去酰基不引起对CD14依赖的结合抑制，表明FITC与LPS的结合和LPS对细胞的刺激是两个独立的过程。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970719)
作者单位：龚建平(400038重庆，第三军医大学西南医院肝胆外科中心)
韩本立(400038重庆，第三军医大学西南医院肝胆外科中心)
参考文献
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[1]Weersink AL,Kessel KP,Torensma R, et al. Binding of rough lipo-polysaccharides (LPS) to human leukocytes. J Immunol, 1990,145:318-324.
[2]Medvedey AE, Flo T,Ingalls RR,et al.Involvement of CD14 and complement receptors CR3 and CR4 in nuclear factor-kB activation and TNF production induced by lipopolysaccharide and group B streptococcal cell walls.J Immunol,1998,160:4 535-4 542.
[3]Bellezzo JM,Britton RS,Bacon BR,et al. LPS-mediated NF-kB activation in rat kupffer cells can be induced independently of CD14.Am J Physiol,1996,270:956-961.
, http://www.100md.com
[4]Troelstra A, Szalmas PA,Miltenburg LA, et al. Saturable CD14-dependent binding of flurescein-labeled lipopolysaccharide to human monocytes.Infection Immunty,1997,65:2 272-2 277.
[5]Netea MG,Kullberg BJ,Meer WM.Lipopolysaccharide-induced production of tumour mecrosis factor and interleukin-1 is differentially regulated at the receptor level:the role of CD14-depenent and CD14-independent pathways.Immunology,1998,94:340-344., http://www.100md.com