酶联免疫吸附试验测定血清苯妥英钠浓度
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中国医科学院学报 2000年第22卷第1期
苏薇 林其燧 宋耀虹
摘 要：目的 建立酶联免疫吸附实验(ELISA)测定苯妥英钠血药浓度的方法。方法 采用碳二亚胺法将化学修饰后的苯妥英钠与人血清白蛋白结合，再与被氧化的辣根过氧化物 酶结合，作为酶标抗原，自制兔抗苯妥英钠多克隆抗体。 结果 抗苯妥英钠IgG稀释倍数1∶200、酶标记抗原1∶100时，标准曲线最理想；该方法的测定灵 敏度为2.87 μg/ml，线性范围2.9～30 μg/ml，批内变异系数3.3%～10.2%，批间变异 系数5.1%～13.2%，回收率90%～96%，其它4种抗癫痫药物(扑痫酮、苯巴比妥、卡马西平 和丙戊酸钠)对测定无干扰，与HPLC方法相关良好，相关系数为0.97。结论 该方法具有良好的准确性、精确性和特异性，灵敏度和测定范围能够满足临床需要，可用于 苯妥英钠的临床治疗药物监测。
关键词：苯妥英钠 酶联免疫吸附试验
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苯妥英钠是一种常用的抗癫痫药物，它对癫痫大发作和局限性发作有较好的疗效，但也是最易引起中毒的抗癫痫药物之一，故需进行药物监测。目前国内多采用荧光偏振免疫分析和液相色谱法测定，但前者试剂昂贵，需专用仪器；后者操作复杂、耗时。本研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清苯妥英钠浓度，试图建立一个更加简便经济的测定方法，以便于临床使用。
材料和方法
材料
主要试剂：人血清白蛋白(HSA)，Sigma产品；1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(ED AC)，Sigma产品；辣根过氧化物酶(HRP，RZ=3.1),Sigma产品；5，5-二苯基-苯妥英-3 - ω-正戊酸(DPHV)，自合成，经核磁共振和质谱鉴定；抗苯妥英钠抗血清(自制)；苯妥英钠 标准(DPH)，Aldrich产品。
仪器：CliniBio 128酶标仪，奥地利产，悦泰公司经销；高效液相色谱系统(HPLC)，Beckma n产品。
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方法
苯妥英钠的间接酶标：(1)苯妥英钠-人血清白蛋白的连接：1 mg DPHV加0.54 ml水，滴加 吡啶数滴至全部溶解，再加入1 mg碳二亚胺(溶液Ⅰ)。10 mg人血清白蛋白溶于0.92 ml水 中，将该蛋白溶液逐滴加入溶液Ⅰ中，室温搅拌2 h，对10 mmol/L PBS透析过夜(溶液Ⅱ );(2)辣根过氧化物酶的氧化：2.5 mg HRP溶于0.5 ml无离子水，加入0.1 mmol/L NaIO 4 0.1 ml，室温搅拌20 min，1 mmol/L醋酸盐缓冲液(pH4.4)透析过夜；(3) 苯妥英钠 的间接酶标：将溶液Ⅱ浓缩至0.6 ml，加0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)0.6 ml，将氧 化好的HRP逐滴加入，室温搅拌2 h，加入NaBH4 4 mg/ml 0.2 ml，置于4℃ 1 h。10 mmol/l PBS缓冲液(pH7.0)透析过夜。过用相同缓冲液平衡的Sephadex G200 (1×35 cm)柱，流速0.5 ml/min。
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抗苯妥英钠IgG的纯化：DEAE纤维素批次纯化[1]，纯化后的IgG加50%甘油，-20℃ 保存。
ELISA方法：(1)包被：兔抗苯妥英钠IgG用50 mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)1∶100稀释后， 包被96孔聚苯乙烯微滴板，每孔100 μl,4℃过夜。洗板3 min,2次；(2)封闭：每孔加入0. 5% BSA-10 mmol/L PBS(pH7.4) 125 μl,37℃ 1 h，洗板3 min,3次；(3) 加样品和酶标 物：加苯妥英钠标准或待测血清及酶标苯妥英钠(0.1% BSA-PBS稀释)，每孔50 μl，振荡 混匀后，37℃ 1 h，洗板3 min,5次；(4)显色：立即加入OPD底物溶液，每孔100 μl，室温20 min，用100 μl 4 mol/L H2SO4终止反应，490 nm比色测定;(5)标准曲线制作： 用正常人血清作为空白血清，配制浓度分别为0、5、10、20、30 μg/ml的标准，和待测血清同时测定，制作标准曲线。
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高效液相色谱(HPLC)方法：见文献[2]。
苯妥英钠治疗浓度和中毒剂量：见文献[3]。
实验方法评价：见文献[4]。
结果
实验条件的选择 棋盘实验确定抗苯妥英钠抗体的包被浓度和标记抗原(DPHV-HSA-HRP)的稀释度，当抗体稀释倍数为1∶200(浓度约为10 μg/ml)、酶标记抗原1∶100稀释时，得到的标准曲线(图1)较理想。
图 1 苯妥英钠测定标准曲线
Fig 1 Standard curve for phenytoin assay
实验检出限 测定20份无苯妥英钠的健康人血清，测定均值(X)为0.53 μg/ml，标准差(s )为0.78 μg/ml，X+3s为最低检出限，则测定灵敏度为2.87 μg/ml。
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测定的线性范围 苯妥英钠浓度达30 μg/ml以上时，标准曲线偏离直线，故线性范围为2.9～30 μg/ml。
方法的精确性 取3份苯妥英钠浓度不同的血清，分别进行测定，结果批内重复性CV值为3.3%～10.2 %，批间重复性CV值为5.1%～13.2%。
方法的准确性 在含有一定量苯妥英钠的血清中，加入已知量的苯妥英钠，将实测值与理论值比较，苯妥英 钠浓度为3.0、10.0、20 μg/ml时回收率分别为90%、92%、96%。
干扰实验 在4份空白血清中分别加入高浓度的扑痫酮、苯巴比妥、卡马西平和丙戊酸钠，用ELISA法分 别测定苯妥英钠含量，测定平均值为0～0.01 μg/ml，按照最大交叉反应率=空白测定 值/检测低限值×100%计算，这几种药物对苯妥英钠测定的交叉反应率均小于0.3%。
与HPLC方法的相关性 取20份患者标本，同时用ELISA方法和HPLC方法进行测定，结果两种方法的相关性良好， r=0.97(图2)。
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图 2 ELISA法和HPLC法测定血清苯妥英钠的相关 性
Fig 2 Correlation between serum phenytoin values estimated by ELISA and HPLC
讨论
目前，测定苯妥英钠(DPH)的方法与测定其它小分子药物的方法一样，除采用色谱分析外，荧光偏振免疫分析、均相酶免疫分析由于有进口的商品化试剂盒，已成为某些大医院的主要方法；但由于其试剂和仪器成本较高，不少医院没有条件开展该项目的测定。笔者尝试采用酶联免疫吸附试验测定苯妥英钠，由于辣根过氧化物酶与其它均相酶相比价廉且不易失活，且测定仅需一台普通的酶标仪，故是较为经济、灵活的测定方法。
苯妥英钠(DPH)分子上没有可以和其它大分子连接的活性基团，本实验先将其进行化学修饰，接上一个羧基(DPHV)，使其具有化学活性。但采用碳二亚胺法直接将DPHV与HRP连接，标记效果很差，原因可能是HRP分子上只有1，2个氨基，与DPHV结合率低的缘故。为了提高标记效果，将DPHV先与人血清白蛋白(HSA)通过碳二亚胺法连接(DPHV-HSA)，然后将HRP用过碘酸氧化法氧化后与DPHV-HSA连接，通过含有多个氨基的HSA的桥梁作用，使标记的效果有了很大的提高。
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抗血清的质量是免疫测定的重要因素。据报道经化学修饰的苯妥英钠分子与牛血清白蛋白按27∶1结合比制备的抗原，其免疫动物产生抗体的效价和特异性最高[5]。笔者曾采用不同的抗血清，其效价相同，而用于测定时，结果却有很大差异，说明不同抗血清的亲和性差异很大。
本研究证实，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清苯妥英钠浓度，简便易行，不需特殊仪器，全部实验可在2h内完成，特别适合中小医院使用。
作者简介：苏薇 Corresponding author Tel:010-65295427,Fax:010-65295413,E-mail:su wei@csc.pumch.ac.cn
作者单位：苏薇(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院检验科，北京 100730)
林其燧(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院检验科，北京 100730)
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宋耀虹(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院检验科，北京 100730)
参考文献：
[1] 李成文编著.现代免疫化学技术.上海：上海科学技术出版社，1992.195 -197
[2] 费亚新，林其燧，阮清云，等.同时测定四种抗癫痫药血浓度的高效液相色谱法. 中国医学科学院学报，1988，10(6)：462-462
[3] 吴莱文主编.治疗药物监测.北京：人民卫生出版社，1989. 187-214
[4] 叶应妩，李建斋，王玉琛主编.临床实验诊断学(上).北京：人民卫生出版社，198 9.311-339
[5] Paxton JW,Rowell FJ,Ratcliffe JG.Production and characterization of antis era to diphenylhydantoin suitable for radioimmunoassay.J Immunol Methods,1976,10:317 -327, 百拇医药
摘 要：目的 建立酶联免疫吸附实验(ELISA)测定苯妥英钠血药浓度的方法。方法 采用碳二亚胺法将化学修饰后的苯妥英钠与人血清白蛋白结合，再与被氧化的辣根过氧化物 酶结合，作为酶标抗原，自制兔抗苯妥英钠多克隆抗体。 结果 抗苯妥英钠IgG稀释倍数1∶200、酶标记抗原1∶100时，标准曲线最理想；该方法的测定灵 敏度为2.87 μg/ml，线性范围2.9～30 μg/ml，批内变异系数3.3%～10.2%，批间变异 系数5.1%～13.2%，回收率90%～96%，其它4种抗癫痫药物(扑痫酮、苯巴比妥、卡马西平 和丙戊酸钠)对测定无干扰，与HPLC方法相关良好，相关系数为0.97。结论 该方法具有良好的准确性、精确性和特异性，灵敏度和测定范围能够满足临床需要，可用于 苯妥英钠的临床治疗药物监测。
关键词：苯妥英钠 酶联免疫吸附试验
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苯妥英钠是一种常用的抗癫痫药物，它对癫痫大发作和局限性发作有较好的疗效，但也是最易引起中毒的抗癫痫药物之一，故需进行药物监测。目前国内多采用荧光偏振免疫分析和液相色谱法测定，但前者试剂昂贵，需专用仪器；后者操作复杂、耗时。本研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清苯妥英钠浓度，试图建立一个更加简便经济的测定方法，以便于临床使用。
材料和方法
材料
主要试剂：人血清白蛋白(HSA)，Sigma产品；1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(ED AC)，Sigma产品；辣根过氧化物酶(HRP，RZ=3.1),Sigma产品；5，5-二苯基-苯妥英-3 - ω-正戊酸(DPHV)，自合成，经核磁共振和质谱鉴定；抗苯妥英钠抗血清(自制)；苯妥英钠 标准(DPH)，Aldrich产品。
仪器：CliniBio 128酶标仪，奥地利产，悦泰公司经销；高效液相色谱系统(HPLC)，Beckma n产品。
, 百拇医药
方法
苯妥英钠的间接酶标：(1)苯妥英钠-人血清白蛋白的连接：1 mg DPHV加0.54 ml水，滴加 吡啶数滴至全部溶解，再加入1 mg碳二亚胺(溶液Ⅰ)。10 mg人血清白蛋白溶于0.92 ml水 中，将该蛋白溶液逐滴加入溶液Ⅰ中，室温搅拌2 h，对10 mmol/L PBS透析过夜(溶液Ⅱ );(2)辣根过氧化物酶的氧化：2.5 mg HRP溶于0.5 ml无离子水，加入0.1 mmol/L NaIO 4 0.1 ml，室温搅拌20 min，1 mmol/L醋酸盐缓冲液(pH4.4)透析过夜；(3) 苯妥英钠 的间接酶标：将溶液Ⅱ浓缩至0.6 ml，加0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)0.6 ml，将氧 化好的HRP逐滴加入，室温搅拌2 h，加入NaBH4 4 mg/ml 0.2 ml，置于4℃ 1 h。10 mmol/l PBS缓冲液(pH7.0)透析过夜。过用相同缓冲液平衡的Sephadex G200 (1×35 cm)柱，流速0.5 ml/min。
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抗苯妥英钠IgG的纯化：DEAE纤维素批次纯化[1]，纯化后的IgG加50%甘油，-20℃ 保存。
ELISA方法：(1)包被：兔抗苯妥英钠IgG用50 mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)1∶100稀释后， 包被96孔聚苯乙烯微滴板，每孔100 μl,4℃过夜。洗板3 min,2次；(2)封闭：每孔加入0. 5% BSA-10 mmol/L PBS(pH7.4) 125 μl,37℃ 1 h，洗板3 min,3次；(3) 加样品和酶标 物：加苯妥英钠标准或待测血清及酶标苯妥英钠(0.1% BSA-PBS稀释)，每孔50 μl，振荡 混匀后，37℃ 1 h，洗板3 min,5次；(4)显色：立即加入OPD底物溶液，每孔100 μl，室温20 min，用100 μl 4 mol/L H2SO4终止反应，490 nm比色测定;(5)标准曲线制作： 用正常人血清作为空白血清，配制浓度分别为0、5、10、20、30 μg/ml的标准，和待测血清同时测定，制作标准曲线。
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高效液相色谱(HPLC)方法：见文献[2]。
苯妥英钠治疗浓度和中毒剂量：见文献[3]。
实验方法评价：见文献[4]。
结果
实验条件的选择 棋盘实验确定抗苯妥英钠抗体的包被浓度和标记抗原(DPHV-HSA-HRP)的稀释度，当抗体稀释倍数为1∶200(浓度约为10 μg/ml)、酶标记抗原1∶100稀释时，得到的标准曲线(图1)较理想。
图 1 苯妥英钠测定标准曲线
Fig 1 Standard curve for phenytoin assay
实验检出限 测定20份无苯妥英钠的健康人血清，测定均值(X)为0.53 μg/ml，标准差(s )为0.78 μg/ml，X+3s为最低检出限，则测定灵敏度为2.87 μg/ml。
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测定的线性范围 苯妥英钠浓度达30 μg/ml以上时，标准曲线偏离直线，故线性范围为2.9～30 μg/ml。
方法的精确性 取3份苯妥英钠浓度不同的血清，分别进行测定，结果批内重复性CV值为3.3%～10.2 %，批间重复性CV值为5.1%～13.2%。
方法的准确性 在含有一定量苯妥英钠的血清中，加入已知量的苯妥英钠，将实测值与理论值比较，苯妥英 钠浓度为3.0、10.0、20 μg/ml时回收率分别为90%、92%、96%。
干扰实验 在4份空白血清中分别加入高浓度的扑痫酮、苯巴比妥、卡马西平和丙戊酸钠，用ELISA法分 别测定苯妥英钠含量，测定平均值为0～0.01 μg/ml，按照最大交叉反应率=空白测定 值/检测低限值×100%计算，这几种药物对苯妥英钠测定的交叉反应率均小于0.3%。
与HPLC方法的相关性 取20份患者标本，同时用ELISA方法和HPLC方法进行测定，结果两种方法的相关性良好， r=0.97(图2)。
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图 2 ELISA法和HPLC法测定血清苯妥英钠的相关 性
Fig 2 Correlation between serum phenytoin values estimated by ELISA and HPLC
讨论
目前，测定苯妥英钠(DPH)的方法与测定其它小分子药物的方法一样，除采用色谱分析外，荧光偏振免疫分析、均相酶免疫分析由于有进口的商品化试剂盒，已成为某些大医院的主要方法；但由于其试剂和仪器成本较高，不少医院没有条件开展该项目的测定。笔者尝试采用酶联免疫吸附试验测定苯妥英钠，由于辣根过氧化物酶与其它均相酶相比价廉且不易失活，且测定仅需一台普通的酶标仪，故是较为经济、灵活的测定方法。
苯妥英钠(DPH)分子上没有可以和其它大分子连接的活性基团，本实验先将其进行化学修饰，接上一个羧基(DPHV)，使其具有化学活性。但采用碳二亚胺法直接将DPHV与HRP连接，标记效果很差，原因可能是HRP分子上只有1，2个氨基，与DPHV结合率低的缘故。为了提高标记效果，将DPHV先与人血清白蛋白(HSA)通过碳二亚胺法连接(DPHV-HSA)，然后将HRP用过碘酸氧化法氧化后与DPHV-HSA连接，通过含有多个氨基的HSA的桥梁作用，使标记的效果有了很大的提高。
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抗血清的质量是免疫测定的重要因素。据报道经化学修饰的苯妥英钠分子与牛血清白蛋白按27∶1结合比制备的抗原，其免疫动物产生抗体的效价和特异性最高[5]。笔者曾采用不同的抗血清，其效价相同，而用于测定时，结果却有很大差异，说明不同抗血清的亲和性差异很大。
本研究证实，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清苯妥英钠浓度，简便易行，不需特殊仪器，全部实验可在2h内完成，特别适合中小医院使用。
作者简介：苏薇 Corresponding author Tel:010-65295427,Fax:010-65295413,E-mail:su wei@csc.pumch.ac.cn
作者单位：苏薇(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院检验科，北京 100730)
林其燧(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院检验科，北京 100730)
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宋耀虹(中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院检验科，北京 100730)
参考文献：
[1] 李成文编著.现代免疫化学技术.上海：上海科学技术出版社，1992.195 -197
[2] 费亚新，林其燧，阮清云，等.同时测定四种抗癫痫药血浓度的高效液相色谱法. 中国医学科学院学报，1988，10(6)：462-462
[3] 吴莱文主编.治疗药物监测.北京：人民卫生出版社，1989. 187-214
[4] 叶应妩，李建斋，王玉琛主编.临床实验诊断学(上).北京：人民卫生出版社，198 9.311-339
[5] Paxton JW,Rowell FJ,Ratcliffe JG.Production and characterization of antis era to diphenylhydantoin suitable for radioimmunoassay.J Immunol Methods,1976,10:317 -327, 百拇医药