深Ⅱ°烧伤创面愈合过程中EGF/EGFR的表达
刘 毅 陈 璧 胡大海 贾赤宇
摘要 目的：了解人深Ⅱ° 烧/烫伤创面愈合过程中创面内源性EGF及其受体的动态表达，以便为临床合理应用外源性EGF提供依据. 方法：分别于伤后1，3，5，7，10，14及21 d自深Ⅱ° 烧/烫伤住院患者创面取材，同时取正常皮肤做对照. 应用免疫细胞化学和原位杂交技术检测EGF/EGFR及其mRNA的表达. 结果：EGF于伤后1 d～5 d较对照明显降低，伤后7 d恢复至对照水平，伤后10 d显著增加，并于伤后14 d达到高峰值，伤后21 d与对照无明显差别. EGFR于伤后1 d～3 d明显低于对照，伤后5 d开始增加，并于伤后10 d达到最大值，尔后仍以显著高于对照的量持续至伤后21 d. EGFmRNA与EGFRmRNA分别于伤后10 d和伤后7 d～10 d呈强阳性表达，其前后表达则较弱. 结论：伤后早期或后期于创面局部应用外源性EGF也许有助于更有效的促进深Ⅱ°烧/烫伤创面愈合.
关键词：烧伤 烫伤 伤口愈合 表皮生长因子—尿抑胃素 受体 表皮生长因子—尿抑胃素
, 百拇医药
0 引言
EGF作为较早被发现的一种生长因子，由于其具有促进表皮细胞增殖和爬行、促进成纤维细胞增殖和增加胶元合成等独特的生物学作用，自然成为研究创面愈合的对象，并取得了肯定的结论. Brown[1]采用双盲法进行的临床研究显示外源性EGF能够促进Ⅱ° 烧伤创面愈合. 我们采用免疫组织化学与核酸分子原位杂交技术，动态检测了人深Ⅱ° 烧/烫伤创面愈合过程中，创面EGF/EGFR及其mRNA的表达，旨在探讨人深Ⅱ° 烧/烫伤创面愈合过程中，创面内源性EGF的来源、含量变化及其作用方式，以便为临床合理应用外源性EGF提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 取自本科7例伤后24 h内入院的深Ⅱ° 烧/烫伤住院患者，其中男3例，女4例；年龄(21.86±2.67)岁。Mah-EGF McAb(美国Sigma公司)；Mah-EGFR McAb(武汉博士德生物制品公司). hEGF cDNA Probe(军事医学科学院基础研究所馈赠)；hEGFR cDNA Probe(华美生物工程公司).
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1.2 方法 分别于伤后1，3，5，7，10，14和21 d，自左/右上肢外侧用直径0.8 cm的活检器于创面取材. 取材创面局部涂磺胺嘧啶银，烤灯烤干. 取其自身侧胸部正常全厚皮肤标本做对照. 标本用40 mL/L多聚甲醛固定72 h后，石蜡包埋，定向切片，切片厚度5 μm. 检测 ①EGF/EGFR表达：采用免疫细胞化学技术(SABC法)检测；②EGF/EGFR mRNA表达：采用分子原位杂交技术检测；③EGF/EGFR表达：将用树脂胶封载于相同规格的载玻片上的切片，在400倍视野下，利用计算机辅助图像分析系统测定每一切片5个视野内阳性物质的平均灰度值. 每个组织标本观察5个切片；④EGF/EGFRmRNA表达: 光镜下观察，在400倍的条件下测定其相对含量，以所见视野内阳性信号数量为准，分为阴性(-)：视野内无阳性信号；弱阳性(+)：视野内可见10个以下阳性信号；阳性：视野内可见11个～30个阳性信号；强阳性：视野内可见30个以上阳性信号.
数据处理：采用方差分析与t检验进行统计学处理.
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2 结果
2.1 创面EGF表达与半定量分析 伤后1 d～5 d，平均表达量较对照组(0.430±0.009)明显降低(P<0.01)；伤后7 d，其表达量恢复至对照组水平；伤后10 d，表达量较对照组显著增加(P<0.01)，并于伤后14 d达到高峰值(0.496±0.006)；至伤后21 d，表达量与对照组无明显差别. 其阳性表达颗粒主要分布于创面深层真皮内皮肤附属器毛囊、汗腺、皮脂腺上皮细胞以及部分成纤维细胞的细胞浆与细胞表面(Fig 1).
2.2 创面EGFR表达与半定量分析 伤后1 d～3 d，其平均表达量明显低于对照组(0.335±0.010)(P<0.01)；伤后5 d，表达量逐渐增加，至伤后7 d即达到较对照组平均表达量明显增高的水平(0.375±0.012)，并继续增加于伤后10 d达最高值(0.400±0.006)；后保持显著高于对照组表达量的水平直至伤后21 d. 其阳性表达细胞与EGF相同，但它的阳性表达颗粒仅见于细胞表面(Fig 1).
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2.3 创面EGFmRNA表达 正常皮肤和伤后1 d～3 d的创面组织内仅于个别毛囊与汗腺上皮细胞内可见稀疏EGFmRNA阳性表达信号(Fig 2)；伤后5 d此处表达信号稍增强；伤后7 d，尚可见少量成纤维细胞内出现阳性信号(Fig 3)；伤后10 d，表达强度达到强阳性(Fig 4)；尔后强度减弱直至伤后21 d.
2.4 创面EGFRmRNA表达 正常皮肤与伤后1 d的创面组织内EGFRmRNA阳性表达信号仅于个别毛囊与汗腺上皮细胞内，且强度较弱；伤后3 d～5 d表达强度增强，并于伤后7 d～10 d达到强阳性，此时可见成纤维细胞内EGFRmRNA的阳性表达信号；伤后14 d～21 d，其表达强度较前稍减弱.
3 讨论
体内外实验研究表明：在创面修复的不同阶段均有EGF的参与，并最终促进创面愈合[2～4]. 这些成果从细胞分子水平揭示了创面修复微观机制的一个方面，同时也为临床应用EGF促进创面修复提供了理论依据. EGF基因工程产品的问世使临床应用成为现实[5]. 目前的主要问题已不再是EGF在创面治疗中是否有效，而是如何正确与合理的应用问题. 要解决该问题必须首先了解创面内EGF反应和表达的规律性，这将有助于理解创面正常愈合过程的规律，并根据其局部反应和表达的改变，针对其薄弱环节合理应用[6]. 本实验结果显示：伤后5 d内创面局部EGF表达量均明显低于正常对照组(P<0.01)，至伤后7 d增加到对照水平，并继续增加于伤后14 d达到最高值(P<0.01)，后又降低；EGFmRNA于伤后10 d其阳性表达强度为强阳性，在此之前后表达强度均较弱. 由此表明，伤后早期由于创面局部组织损伤严重，炎症反应剧烈，从而影响了组织细胞对烧/烫伤刺激的反应；随着炎症反应的减轻，组织细胞对烧/烫伤刺激反应增强，局部EGFmRNA的高表达使得EGF蛋白合成增多，因而有助于刺激肉芽组织屏障的形成；后期由于痂皮脱落，大量皮岛出现，创面缩小或趋于愈合，组织细胞通过自我调节，降低了EGFmRNA的表达. 据此也提示：应采取措施促进EGFmRNA表达，以增加内源性EGF的合成，可能也有助于促进创面愈合的过程.
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图 1 创面EGF/EGFR的表达与半定量分析
Fig 1 One-half quantitative analysis of EGF/EGFR in second deep degree burn during wound healing
EGF只有与其靶细胞膜表面的EGFR结合才能发挥其生物学作用，EGFR是多细胞生物中介导EGF发挥其生物学效应的关键成分，它具有可饱和性. 本实验有关EGFR的检测结果显示：伤后1 d EGFR表达量显著低于正常对照组(P<0.01)，伤后3 d～5 d逐渐增加，伤后7 d其表达量即开始明显高于对照组直至伤后21 d，其中伤后10 d达到最高值；其mRNA表达强度于伤后3 d起即高于正常对照及伤后1 d者，其中伤后7 d～10 d达到强阳性；与EGF相比，其出现表达增强及高峰值的时间均较早，且持续时间长. 说明在伤后早期EGFR对促进EGF的表达具有一定的调控作用，此时配合应用外源性EGF也许有助于启动创面修复，促进创面愈合. 愈合后期创面表面有大量皮岛分布，创面再上皮化尚未完成，EGFR的表达仍高于对照，但EGF的表达却减弱，提示此时若及时应用外源性EGF可能更能有效的促进创面愈合，加速创面完成再上皮化. 同时，根据EGF/EGFR及其mRNA阳性表达的一致性，还表明了内源性EGF在创面局部以自分泌与旁分泌方式作用于其靶细胞.
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图 2 伤后3 d 创面EGFmRNA表达
图 3 伤后7 d创面EGFmRNA表达
图 4 伤后10 d创面EGFmRNA表达
作者简介：刘 毅，男，1964-02-29生，江苏盐城人，汉族. 1986年西安医科大学毕业，博士，现在兰州军区总院烧伤整形科工作，发表论文11篇. Tel:(0931)2322095
作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科，陕西 西安 710033
参考文献
1 Brown GL. Enhancement of wound healing by topical treatment with epidermal growth factor. N Engl J Med,1989;321(5):76-79
, http://www.100md.com
2 Cromack DT. Current concept in wound healing:growth factor and macrophage interaction. J Trauma,1990;30(12Suppl):129-135
3 Latto M. Effect of epidermal growth factor on experimental granulation tissue. J Surg Res,1986;41(3):252-256
4 Hom DB. Growth factor in wound healing. Otolaryngol Clin Nor Am,1995;28:933-953
5 薛沿宁,王会信. 生长因子与软组织创伤愈合(综述). 国外医学创伤与外科基本问题分D册，1992;13:15-17
6 段红杰编译. 生长因子在伤口中的作用. 国外医学创伤与外科基本分册,1997;18(5):228-230, http://www.100md.com
摘要 目的：了解人深Ⅱ° 烧/烫伤创面愈合过程中创面内源性EGF及其受体的动态表达，以便为临床合理应用外源性EGF提供依据. 方法：分别于伤后1，3，5，7，10，14及21 d自深Ⅱ° 烧/烫伤住院患者创面取材，同时取正常皮肤做对照. 应用免疫细胞化学和原位杂交技术检测EGF/EGFR及其mRNA的表达. 结果：EGF于伤后1 d～5 d较对照明显降低，伤后7 d恢复至对照水平，伤后10 d显著增加，并于伤后14 d达到高峰值，伤后21 d与对照无明显差别. EGFR于伤后1 d～3 d明显低于对照，伤后5 d开始增加，并于伤后10 d达到最大值，尔后仍以显著高于对照的量持续至伤后21 d. EGFmRNA与EGFRmRNA分别于伤后10 d和伤后7 d～10 d呈强阳性表达，其前后表达则较弱. 结论：伤后早期或后期于创面局部应用外源性EGF也许有助于更有效的促进深Ⅱ°烧/烫伤创面愈合.
关键词：烧伤 烫伤 伤口愈合 表皮生长因子—尿抑胃素 受体 表皮生长因子—尿抑胃素
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0 引言
EGF作为较早被发现的一种生长因子，由于其具有促进表皮细胞增殖和爬行、促进成纤维细胞增殖和增加胶元合成等独特的生物学作用，自然成为研究创面愈合的对象，并取得了肯定的结论. Brown[1]采用双盲法进行的临床研究显示外源性EGF能够促进Ⅱ° 烧伤创面愈合. 我们采用免疫组织化学与核酸分子原位杂交技术，动态检测了人深Ⅱ° 烧/烫伤创面愈合过程中，创面EGF/EGFR及其mRNA的表达，旨在探讨人深Ⅱ° 烧/烫伤创面愈合过程中，创面内源性EGF的来源、含量变化及其作用方式，以便为临床合理应用外源性EGF提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 取自本科7例伤后24 h内入院的深Ⅱ° 烧/烫伤住院患者，其中男3例，女4例；年龄(21.86±2.67)岁。Mah-EGF McAb(美国Sigma公司)；Mah-EGFR McAb(武汉博士德生物制品公司). hEGF cDNA Probe(军事医学科学院基础研究所馈赠)；hEGFR cDNA Probe(华美生物工程公司).
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1.2 方法 分别于伤后1，3，5，7，10，14和21 d，自左/右上肢外侧用直径0.8 cm的活检器于创面取材. 取材创面局部涂磺胺嘧啶银，烤灯烤干. 取其自身侧胸部正常全厚皮肤标本做对照. 标本用40 mL/L多聚甲醛固定72 h后，石蜡包埋，定向切片，切片厚度5 μm. 检测 ①EGF/EGFR表达：采用免疫细胞化学技术(SABC法)检测；②EGF/EGFR mRNA表达：采用分子原位杂交技术检测；③EGF/EGFR表达：将用树脂胶封载于相同规格的载玻片上的切片，在400倍视野下，利用计算机辅助图像分析系统测定每一切片5个视野内阳性物质的平均灰度值. 每个组织标本观察5个切片；④EGF/EGFRmRNA表达: 光镜下观察，在400倍的条件下测定其相对含量，以所见视野内阳性信号数量为准，分为阴性(-)：视野内无阳性信号；弱阳性(+)：视野内可见10个以下阳性信号；阳性：视野内可见11个～30个阳性信号；强阳性：视野内可见30个以上阳性信号.
数据处理：采用方差分析与t检验进行统计学处理.
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2 结果
2.1 创面EGF表达与半定量分析 伤后1 d～5 d，平均表达量较对照组(0.430±0.009)明显降低(P<0.01)；伤后7 d，其表达量恢复至对照组水平；伤后10 d，表达量较对照组显著增加(P<0.01)，并于伤后14 d达到高峰值(0.496±0.006)；至伤后21 d，表达量与对照组无明显差别. 其阳性表达颗粒主要分布于创面深层真皮内皮肤附属器毛囊、汗腺、皮脂腺上皮细胞以及部分成纤维细胞的细胞浆与细胞表面(Fig 1).
2.2 创面EGFR表达与半定量分析 伤后1 d～3 d，其平均表达量明显低于对照组(0.335±0.010)(P<0.01)；伤后5 d，表达量逐渐增加，至伤后7 d即达到较对照组平均表达量明显增高的水平(0.375±0.012)，并继续增加于伤后10 d达最高值(0.400±0.006)；后保持显著高于对照组表达量的水平直至伤后21 d. 其阳性表达细胞与EGF相同，但它的阳性表达颗粒仅见于细胞表面(Fig 1).
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2.3 创面EGFmRNA表达 正常皮肤和伤后1 d～3 d的创面组织内仅于个别毛囊与汗腺上皮细胞内可见稀疏EGFmRNA阳性表达信号(Fig 2)；伤后5 d此处表达信号稍增强；伤后7 d，尚可见少量成纤维细胞内出现阳性信号(Fig 3)；伤后10 d，表达强度达到强阳性(Fig 4)；尔后强度减弱直至伤后21 d.
2.4 创面EGFRmRNA表达 正常皮肤与伤后1 d的创面组织内EGFRmRNA阳性表达信号仅于个别毛囊与汗腺上皮细胞内，且强度较弱；伤后3 d～5 d表达强度增强，并于伤后7 d～10 d达到强阳性，此时可见成纤维细胞内EGFRmRNA的阳性表达信号；伤后14 d～21 d，其表达强度较前稍减弱.
3 讨论
体内外实验研究表明：在创面修复的不同阶段均有EGF的参与，并最终促进创面愈合[2～4]. 这些成果从细胞分子水平揭示了创面修复微观机制的一个方面，同时也为临床应用EGF促进创面修复提供了理论依据. EGF基因工程产品的问世使临床应用成为现实[5]. 目前的主要问题已不再是EGF在创面治疗中是否有效，而是如何正确与合理的应用问题. 要解决该问题必须首先了解创面内EGF反应和表达的规律性，这将有助于理解创面正常愈合过程的规律，并根据其局部反应和表达的改变，针对其薄弱环节合理应用[6]. 本实验结果显示：伤后5 d内创面局部EGF表达量均明显低于正常对照组(P<0.01)，至伤后7 d增加到对照水平，并继续增加于伤后14 d达到最高值(P<0.01)，后又降低；EGFmRNA于伤后10 d其阳性表达强度为强阳性，在此之前后表达强度均较弱. 由此表明，伤后早期由于创面局部组织损伤严重，炎症反应剧烈，从而影响了组织细胞对烧/烫伤刺激的反应；随着炎症反应的减轻，组织细胞对烧/烫伤刺激反应增强，局部EGFmRNA的高表达使得EGF蛋白合成增多，因而有助于刺激肉芽组织屏障的形成；后期由于痂皮脱落，大量皮岛出现，创面缩小或趋于愈合，组织细胞通过自我调节，降低了EGFmRNA的表达. 据此也提示：应采取措施促进EGFmRNA表达，以增加内源性EGF的合成，可能也有助于促进创面愈合的过程.
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图 1 创面EGF/EGFR的表达与半定量分析
Fig 1 One-half quantitative analysis of EGF/EGFR in second deep degree burn during wound healing
EGF只有与其靶细胞膜表面的EGFR结合才能发挥其生物学作用，EGFR是多细胞生物中介导EGF发挥其生物学效应的关键成分，它具有可饱和性. 本实验有关EGFR的检测结果显示：伤后1 d EGFR表达量显著低于正常对照组(P<0.01)，伤后3 d～5 d逐渐增加，伤后7 d其表达量即开始明显高于对照组直至伤后21 d，其中伤后10 d达到最高值；其mRNA表达强度于伤后3 d起即高于正常对照及伤后1 d者，其中伤后7 d～10 d达到强阳性；与EGF相比，其出现表达增强及高峰值的时间均较早，且持续时间长. 说明在伤后早期EGFR对促进EGF的表达具有一定的调控作用，此时配合应用外源性EGF也许有助于启动创面修复，促进创面愈合. 愈合后期创面表面有大量皮岛分布，创面再上皮化尚未完成，EGFR的表达仍高于对照，但EGF的表达却减弱，提示此时若及时应用外源性EGF可能更能有效的促进创面愈合，加速创面完成再上皮化. 同时，根据EGF/EGFR及其mRNA阳性表达的一致性，还表明了内源性EGF在创面局部以自分泌与旁分泌方式作用于其靶细胞.
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图 2 伤后3 d 创面EGFmRNA表达
图 3 伤后7 d创面EGFmRNA表达
图 4 伤后10 d创面EGFmRNA表达
作者简介：刘 毅，男，1964-02-29生，江苏盐城人，汉族. 1986年西安医科大学毕业，博士，现在兰州军区总院烧伤整形科工作，发表论文11篇. Tel:(0931)2322095
作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科，陕西 西安 710033
参考文献
1 Brown GL. Enhancement of wound healing by topical treatment with epidermal growth factor. N Engl J Med,1989;321(5):76-79
, http://www.100md.com
2 Cromack DT. Current concept in wound healing:growth factor and macrophage interaction. J Trauma,1990;30(12Suppl):129-135
3 Latto M. Effect of epidermal growth factor on experimental granulation tissue. J Surg Res,1986;41(3):252-256
4 Hom DB. Growth factor in wound healing. Otolaryngol Clin Nor Am,1995;28:933-953
5 薛沿宁,王会信. 生长因子与软组织创伤愈合(综述). 国外医学创伤与外科基本问题分D册，1992;13:15-17
6 段红杰编译. 生长因子在伤口中的作用. 国外医学创伤与外科基本分册,1997;18(5):228-230, http://www.100md.com