氯化镉对脾淋巴细胞DNA链损伤和修复的体外实验研究
氯化镉对脾淋巴细胞DNA链损伤和修复的体外实验研究
林忠宁 董胜璋 蔡颖 董书芸 余贵英 任铁玲
关键词：镉 DNA损伤 DNA修复 分子机制
镉(Cadmium,Cd)具有遗传毒性，1994年被国际癌症研究会(IARC)定为Ⅰ级 致癌物，即人类致癌物。镉的致癌作用与其损伤DNA和影响DNA的修复有关[1]。已 知无机镉(CdCl2)可损害机体的免疫系统，可能是DNA的损伤导致淋巴细胞功能下降。因此 ，应用脾淋巴细胞进行DNA损伤和修复能力的检测，对探讨镉免疫毒性作用的分子生物学机 制具有重要意义。
一、材料和方法
1.实验动物：BALB/C小鼠，体重(20±5)g，二级动物，中山医科大学实验动物中心提供。
, http://www.100md.com
2.脾淋巴细胞DNA链损伤(SSBs)和修复检测：(1)脾淋巴细胞的制备：常规无菌取脾，用磨砂 玻片加Hank's(pH 7.4,4 ℃)研磨，200目筛网过滤，用RPMI1640完全培养基(CM)制 备 淋巴细胞悬液，稀释成每毫升107个淋巴细胞。(2)细胞染毒：分别取106个脾淋巴细胞5 份于硅化的Eppendorf离心管中，置37 ℃恒温电热器加样板上，1管加CM作阴性对照，其余4 管各加入CdCl2，每升含5～1 000 μmol Cd2+，使终浓度分别为0.1、1.0、10.0、 20.0 μmol/L，作为CdCl2染毒组，于旋涡振荡器混匀，置37 ℃恒温水浴振荡器孵育30 m in，取104个细胞检测DNA-SSBs；同样设5管同上染毒60 min后检测。(3)染毒细胞DNA修 复：取上述剩余细胞离心，弃上清液，用CM洗2次，同上37 ℃孵育(修复作用)，于修复30、 60和120 min时分别取104个细胞检测DNA链修复。(4)DNA-SSBs和修复检测：参 照Singh 法[2]，按本实验室建立的单细胞凝胶电泳法(SCGE)检测脾淋巴细胞DNA-SSBs。取 细 胞铺制三层微胶，300 mA碱性(pH 10.3)电泳20 min，溴乙锭染色，荧光显微镜下检测1 00个细胞，记录DNA迁移的“彗星”尾长(μm)，用尾长加权平均长度表示DNA-SSBs 的程度，进行比较和“彗星”形态描述分析。
, 百拇医药
3.统计学分析：用SPSS统计软件包进行方差分析和组间比较。
二、结果
1.染毒后DNA损伤和修复的“彗星”形态学观察：高倍镜下可见，CdCl2染毒作用时正常细 胞少见，损伤细胞的DNA迁移表现为彗星头部核心致密、周边松散，呈刷状缘样；DNA裂解片 段形成的彗星尾，长尾、尾密度高、所占比例大、DNA断裂分级高。修复的早期(30 min)， 染毒30 min组的细胞头部圆形致密、无尾或短尾；染毒60 min组的细胞则表现为头圆、核密 而长尾、低密，出现明显的尾长和密度分离，甚至呈头尾断离现象。修复的中后期(60和120 min)，各组都表现为正常和损伤细胞共存。
2.染毒不同时间DNA-SSBs检测：CdCl2染毒所致DNA-SSBs出现的尾长与对照组相比，染 毒30 min和60 min时，各剂量组尾长显著增加(P<0.05)，尾长与Cd2+浓度呈 明显的剂量-反应关系(P<0.01)。各组尾长在染毒60 min组略高于染毒30 min组，但无 统计学意义(P>0.05)，无时间-效应关系(表1)。
, 百拇医药
3.修复不同时间DNA-SSBs检测：表1可见，修复不同时间(30～120 min)各组细胞的尾长都 显著低于CdCl2染毒组(P<0.05)。
表1 CdCl2染毒对脾淋巴细胞DNA-SSBs和修 复作用的SCGE检测结果(x±s)
染毒时间
(min)
组别
Cd2+浓度
(μmol/L)
染毒后
彗星尾长(μm )
, 百拇医药
不同修复时间彗星尾长(μm)
30 min
60 min
120 min
30
阴性对照组
0.0
13.21±5.76
13.86±6.22
1 2.74±5.36
13.37±5.89
CdCl2染毒组
, 百拇医药
0.1
22.54±8.20*
14.24±6.44
15.48± 6.98
14.13±8.00
1.0
31.09±8.96**
15.68±7.04
18.52±9.76*
16.03±12.49
5.0
, 百拇医药
35.73±10.07**
17.49±7.98
23.90±14.34**
16 .49±11.92
20.0
39.71±10.82**
24.65±8.71*
24.64±16.47**
20.83±12.77*
60
, http://www.100md.com
阴性对照组
0.0
11.45±3.74
12.18±4.77
12.91± 5.51
13.34±5.87
CdCl2染毒组
0.1
28.72±12.68**
19.10±10.23*
13.05± 5.64
, http://www.100md.com
14.05±9.11
1.0
33.81±11.49**
23.26±10.72**#
13.76±8.1 7
18.83±14.43
5.0
38.52±13.51**
28.44±14.64**#
16.22±12.82
, 百拇医药
22.65±16.46*
20.0
45.37±14.73**
33.74±15.23**#
23.10±15.11 *
22.09±16.29*
与阴性对照组比较，* P<0.05，** P<0.01；与染毒30 min组比较， # P<0.05
与对照组尾长相比，CdCl2染毒30 min组 的修复，在30 min时无差异(P>0.05)，60 min时在中、高剂量组(5.0～20.0 μm ol/L)尾长增长，而120 min时仅在高剂量组(20.0 μmol/L)有明显增高(P<0.05)。 不同的是，染毒60 min组的修复，30 min时在CdCl2各组都显著增长(P<0.05)，6 0 min和120 min时只在高剂量组的增高有统计学意义(P<0.05)。 等级相关分析结果显示：除在CdCl2染毒60 min钟组修复30 min时，存在尾长与Cd2+ 浓度的明显相关关系外(P<0.05)，其余均未见明显的剂量-反应和时间-效应关 系(P>0.05)。
, http://www.100md.com
三、讨论
1.CdCl2对DNA-SSBs修复的影响：SCGE是在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的 分子生物学毒性评价方法，可较为敏感地检测相对较弱的DNA损伤和修复作用[2] 。本研究中脾淋巴细胞DNA-SSBs的频率和程度与检测彗星尾长相关，以此可反映淋 巴细胞功能染毒30 min起，CdCl2在0.1 μmol/L Cd2+时就导致靶细胞的DNA 损伤，且与Cd2+浓度呈明显的剂量-效应关系；染毒作用时间增加，DNA链损伤略有 加重，但未见时间-效应关系，与体内实验不同[3]。但在DNA链修复中，CdCl2 短时间(30 min)染毒所致的DNA-SSBs可被迅速(<30 min)修复，在去除受试物后DNA的 损伤修 复较快也比较完全；染毒时间的延长(60 min)相应地增加修复时间，但都表现出DNA单链损 伤的可修复性；然而后期修复中，在中、高浓度Cd2+作用组仍可见明显的DNA损伤， 这与形态学观察表现为长DNA断裂片段(出现于头部周边，损伤轻)被修复，而短片段(断裂重 ，见于尾端)难修复，出现的尾长与尾密度分离和正常与损伤细胞共存相符。
, 百拇医药
2.本研究的意义：已有证据表明Cd2+可作用于活细胞DNA[4]；但不同存在形 式(无机或有机镉)对脾淋巴细胞DNA的作用及其修复的观察，以及分析和评价细胞免疫功能 尚少见报道。本研究应用CdCl2研究其对DNA损伤和修复的作用，并在此基础上拟与有机镉 (如Cd-MT复合物)的作用进行比较，为探讨镉接触对免疫系统功能及其分子生物学作用方式 提供实验依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770636)
作者单位：林忠宁(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
董胜璋(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
董书芸(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
, 百拇医药 余贵英(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
任铁玲(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
蔡 颖(汕头市卫生检疫局)
参考文献
[1]International Agency for Research on Cancer(IARC).Cadmium and cad mium compounds.IARC Monograghs,1994,58:119-237.
[2]Singh NP,Stephens RE.Microgel electrophoresis:sensitivity,mechani sm,and DNA electrostretching.Mut Res,1997,383:167-175.
[3]林忠宁，董胜璋，董书芸，等.镉金属硫蛋白诱发小鼠体内淋巴细胞DNA链 断裂与免疫毒性的关系.卫生研究，1998，27(增刊)：47-49.
[4]Littlefield NA,Hass BS,James SJ,et al.Protective effect of magnes ium on DNA strand breaks induced by nickel or cadmium.Cell Biol Toxicol,1994,10: 127-135., 百拇医药
林忠宁 董胜璋 蔡颖 董书芸 余贵英 任铁玲
关键词：镉 DNA损伤 DNA修复 分子机制
镉(Cadmium,Cd)具有遗传毒性，1994年被国际癌症研究会(IARC)定为Ⅰ级 致癌物，即人类致癌物。镉的致癌作用与其损伤DNA和影响DNA的修复有关[1]。已 知无机镉(CdCl2)可损害机体的免疫系统，可能是DNA的损伤导致淋巴细胞功能下降。因此 ，应用脾淋巴细胞进行DNA损伤和修复能力的检测，对探讨镉免疫毒性作用的分子生物学机 制具有重要意义。
一、材料和方法
1.实验动物：BALB/C小鼠，体重(20±5)g，二级动物，中山医科大学实验动物中心提供。
, http://www.100md.com
2.脾淋巴细胞DNA链损伤(SSBs)和修复检测：(1)脾淋巴细胞的制备：常规无菌取脾，用磨砂 玻片加Hank's(pH 7.4,4 ℃)研磨，200目筛网过滤，用RPMI1640完全培养基(CM)制 备 淋巴细胞悬液，稀释成每毫升107个淋巴细胞。(2)细胞染毒：分别取106个脾淋巴细胞5 份于硅化的Eppendorf离心管中，置37 ℃恒温电热器加样板上，1管加CM作阴性对照，其余4 管各加入CdCl2，每升含5～1 000 μmol Cd2+，使终浓度分别为0.1、1.0、10.0、 20.0 μmol/L，作为CdCl2染毒组，于旋涡振荡器混匀，置37 ℃恒温水浴振荡器孵育30 m in，取104个细胞检测DNA-SSBs；同样设5管同上染毒60 min后检测。(3)染毒细胞DNA修 复：取上述剩余细胞离心，弃上清液，用CM洗2次，同上37 ℃孵育(修复作用)，于修复30、 60和120 min时分别取104个细胞检测DNA链修复。(4)DNA-SSBs和修复检测：参 照Singh 法[2]，按本实验室建立的单细胞凝胶电泳法(SCGE)检测脾淋巴细胞DNA-SSBs。取 细 胞铺制三层微胶，300 mA碱性(pH 10.3)电泳20 min，溴乙锭染色，荧光显微镜下检测1 00个细胞，记录DNA迁移的“彗星”尾长(μm)，用尾长加权平均长度表示DNA-SSBs 的程度，进行比较和“彗星”形态描述分析。
, 百拇医药
3.统计学分析：用SPSS统计软件包进行方差分析和组间比较。
二、结果
1.染毒后DNA损伤和修复的“彗星”形态学观察：高倍镜下可见，CdCl2染毒作用时正常细 胞少见，损伤细胞的DNA迁移表现为彗星头部核心致密、周边松散，呈刷状缘样；DNA裂解片 段形成的彗星尾，长尾、尾密度高、所占比例大、DNA断裂分级高。修复的早期(30 min)， 染毒30 min组的细胞头部圆形致密、无尾或短尾；染毒60 min组的细胞则表现为头圆、核密 而长尾、低密，出现明显的尾长和密度分离，甚至呈头尾断离现象。修复的中后期(60和120 min)，各组都表现为正常和损伤细胞共存。
2.染毒不同时间DNA-SSBs检测：CdCl2染毒所致DNA-SSBs出现的尾长与对照组相比，染 毒30 min和60 min时，各剂量组尾长显著增加(P<0.05)，尾长与Cd2+浓度呈 明显的剂量-反应关系(P<0.01)。各组尾长在染毒60 min组略高于染毒30 min组，但无 统计学意义(P>0.05)，无时间-效应关系(表1)。
, 百拇医药
3.修复不同时间DNA-SSBs检测：表1可见，修复不同时间(30～120 min)各组细胞的尾长都 显著低于CdCl2染毒组(P<0.05)。
表1 CdCl2染毒对脾淋巴细胞DNA-SSBs和修 复作用的SCGE检测结果(x±s)
染毒时间
(min)
组别
Cd2+浓度
(μmol/L)
染毒后
彗星尾长(μm )
, 百拇医药
不同修复时间彗星尾长(μm)
30 min
60 min
120 min
30
阴性对照组
0.0
13.21±5.76
13.86±6.22
1 2.74±5.36
13.37±5.89
CdCl2染毒组
, 百拇医药
0.1
22.54±8.20*
14.24±6.44
15.48± 6.98
14.13±8.00
1.0
31.09±8.96**
15.68±7.04
18.52±9.76*
16.03±12.49
5.0
, 百拇医药
35.73±10.07**
17.49±7.98
23.90±14.34**
16 .49±11.92
20.0
39.71±10.82**
24.65±8.71*
24.64±16.47**
20.83±12.77*
60
, http://www.100md.com
阴性对照组
0.0
11.45±3.74
12.18±4.77
12.91± 5.51
13.34±5.87
CdCl2染毒组
0.1
28.72±12.68**
19.10±10.23*
13.05± 5.64
, http://www.100md.com
14.05±9.11
1.0
33.81±11.49**
23.26±10.72**#
13.76±8.1 7
18.83±14.43
5.0
38.52±13.51**
28.44±14.64**#
16.22±12.82
, 百拇医药
22.65±16.46*
20.0
45.37±14.73**
33.74±15.23**#
23.10±15.11 *
22.09±16.29*
与阴性对照组比较，* P<0.05，** P<0.01；与染毒30 min组比较， # P<0.05
与对照组尾长相比，CdCl2染毒30 min组 的修复，在30 min时无差异(P>0.05)，60 min时在中、高剂量组(5.0～20.0 μm ol/L)尾长增长，而120 min时仅在高剂量组(20.0 μmol/L)有明显增高(P<0.05)。 不同的是，染毒60 min组的修复，30 min时在CdCl2各组都显著增长(P<0.05)，6 0 min和120 min时只在高剂量组的增高有统计学意义(P<0.05)。 等级相关分析结果显示：除在CdCl2染毒60 min钟组修复30 min时，存在尾长与Cd2+ 浓度的明显相关关系外(P<0.05)，其余均未见明显的剂量-反应和时间-效应关 系(P>0.05)。
, http://www.100md.com
三、讨论
1.CdCl2对DNA-SSBs修复的影响：SCGE是在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的 分子生物学毒性评价方法，可较为敏感地检测相对较弱的DNA损伤和修复作用[2] 。本研究中脾淋巴细胞DNA-SSBs的频率和程度与检测彗星尾长相关，以此可反映淋 巴细胞功能染毒30 min起，CdCl2在0.1 μmol/L Cd2+时就导致靶细胞的DNA 损伤，且与Cd2+浓度呈明显的剂量-效应关系；染毒作用时间增加，DNA链损伤略有 加重，但未见时间-效应关系，与体内实验不同[3]。但在DNA链修复中，CdCl2 短时间(30 min)染毒所致的DNA-SSBs可被迅速(<30 min)修复，在去除受试物后DNA的 损伤修 复较快也比较完全；染毒时间的延长(60 min)相应地增加修复时间，但都表现出DNA单链损 伤的可修复性；然而后期修复中，在中、高浓度Cd2+作用组仍可见明显的DNA损伤， 这与形态学观察表现为长DNA断裂片段(出现于头部周边，损伤轻)被修复，而短片段(断裂重 ，见于尾端)难修复，出现的尾长与尾密度分离和正常与损伤细胞共存相符。
, 百拇医药
2.本研究的意义：已有证据表明Cd2+可作用于活细胞DNA[4]；但不同存在形 式(无机或有机镉)对脾淋巴细胞DNA的作用及其修复的观察，以及分析和评价细胞免疫功能 尚少见报道。本研究应用CdCl2研究其对DNA损伤和修复的作用，并在此基础上拟与有机镉 (如Cd-MT复合物)的作用进行比较，为探讨镉接触对免疫系统功能及其分子生物学作用方式 提供实验依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770636)
作者单位：林忠宁(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
董胜璋(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
董书芸(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
, 百拇医药 余贵英(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
任铁玲(510089 广州，中山医科大学公共卫生学院)
蔡 颖(汕头市卫生检疫局)
参考文献
[1]International Agency for Research on Cancer(IARC).Cadmium and cad mium compounds.IARC Monograghs,1994,58:119-237.
[2]Singh NP,Stephens RE.Microgel electrophoresis:sensitivity,mechani sm,and DNA electrostretching.Mut Res,1997,383:167-175.
[3]林忠宁，董胜璋，董书芸，等.镉金属硫蛋白诱发小鼠体内淋巴细胞DNA链 断裂与免疫毒性的关系.卫生研究，1998，27(增刊)：47-49.
[4]Littlefield NA,Hass BS,James SJ,et al.Protective effect of magnes ium on DNA strand breaks induced by nickel or cadmium.Cell Biol Toxicol,1994,10: 127-135., 百拇医药