烧伤创面成纤维细胞周期、羟脯氨酸和胶原比例动态变化
陈新龙 余明星 陈文山 许伟石 陆树良 史济湘
摘 要 目的：探讨深Ⅱ度烧伤创面愈合规律。 方法：通过48只大鼠深Ⅱ度烧伤模型，动态观察烧伤后不同时间点创面成纤维细胞增殖周期、羟脯氨酸(OHP)含量和Ⅰ/Ⅲ型胶原比值变化及病理组织学改变。 结果：伤后10 d真皮细胞s期细胞百分比达高峰，伤后21 d仍显著高于正常对照组。OHP含量伤后逐渐增加，伤后14 d达高峰，伤后21 d仍显著高于正常对照组。伤后Ⅰ/Ⅲ型胶原比值逐渐降低，并显著低于正常对照组，病理切片观察伤后3～10 d明显可见白细胞浸润带，伤后14 d可见上皮细胞自创缘及坏死组织界面爬行生长。 结论：深Ⅱ度烧伤创面伤后3～10 d以炎症反应为主。伤后10～14 d主要表现为成纤维细胞增殖和新生胶原合成，伤后21 d真皮的修复尚未结束。伤后14～21 d主要为表皮细胞增殖和迁移。
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关键词：烧伤 细胞周期 羟脯氨酸 胶原
烧伤创面愈合主要包括炎症反应、细胞增殖、结缔组织形成等过程。创面愈合首先表现为局部炎症反应，炎性细胞引起的炎症反应不仅为清除坏死组织和异物所必需，且同时启动和调控创面修复。其次是细胞增殖，细胞增殖主要为成纤维细胞和表皮细胞的增殖，是烧伤愈合过程关键环节。结缔组织主要成分是成纤维细胞及其形成的胶原蛋白，胶原是细胞外基质的主要组成部分，细胞外基质的加速重建，可为表皮细胞的迁移和增殖提供一个合适的微环境。深Ⅱ度烧伤创面愈合过程中炎症反应、细胞增殖和结缔组织形成时相性变化尚缺乏深入研究。本研究旨在探索深Ⅱ度烧伤创面愈合过程中成纤维细胞增殖周期、羟脯氨酸(OHP)含量和Ⅰ/Ⅲ型胶原比值及上皮化过程动态变化规律。
材料与方法
1.实验动物：清洁级Sprague-Dawley大鼠，体重200～250 g，雌雄不拘，上海必凯-西普尔实验动物有限公司供应，数量48只。
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2.大鼠深Ⅱ度烫伤模型制作:2.5%戊巴比妥钠(30～35 mg /kg)腹腔内注射麻醉后，剪除背部长毛，硫化钡脱毛剂均匀涂于背部，片刻后去除脱毛剂，置室温25 ℃、湿度为50%环境中分笼饲养，自由进食进水。24 h后同样麻醉后将大鼠固定于烫伤板上，背部置于80℃水温中烫6秒，制成10%TBSA深Ⅱ度烧伤模型，经病理证实。伤后立即腹腔内注射乳酸林格氏液5ml进行液体复苏。烧伤创面采用暴露疗法。
3.标本采集时间和方法:伤后3、7、10、14、21 d分别取创面标本，大约3 cm×5 cm，每个时间点各处死8只大鼠，创面组织标本分别置于同位素瓶中，-80℃保存。病理标本固定于40%甲醛标本固定液中。
4.烧伤创面组织真皮细胞增殖周期检测：标本制备采用机械法和胰酶消化法，标本检测采用流式细胞仪测定[1]。
5.烧伤创面OHP含量检测：采用氯胺T氧化法。
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6.烧伤创面中Ⅰ/Ⅲ型胶原比例检测：标本制备采用乙酸-胃蛋白酶法，标本检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA技术)[2]。
7.烧伤创面组织形态学观察：采用Masson三色染色法和HE染色。
8.统计方法:各组间比较采用多因素方差分析及Student′t检验,所有数据均用±s表示，P<0.05为有显著差异水平。
结果
1.烧伤创面组织成纤维细胞增殖周期百分比变化:如表1。正常皮肤组织成纤维细胞周期各期细胞百分比：G0/G1为(82.88±2.34)%；S为(10.32±1.57)%；G2+M为(1.43%±0.65)%。
表1 烧伤后各时间点成纤维细胞增殖周期各期百分比(%,n=8)
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项 目
烧伤后时间(天)
10 d
14 d
21 d
G0/G1期百分比
60.7±1.2*
71.2±2.2*
78.7±1.6△
S期细胞百分比
35.6±2.4*
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25.1±2.9*
14.9±3.3△
G2+M期百分比
3.7±3.3*
3.7±1.4*
6.4±1.8*
注：与正常对照组比较*P<0.05； △P<0.01 伤后3、7 d深Ⅱ度烧伤创面成纤维细胞数很难达到106/ml，且碎片较多无法检测，故资料缺如。
2.烧伤创面组织OHP含量和Ⅰ/Ⅲ型胶原比例变化：见表2。正常大鼠皮肤OHP含量为：15.8±3.2。正常大鼠皮肤Ⅰ/Ⅲ型胶原比例为：4.785±0.432。
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表2 大鼠烧伤后不同时间创面OHP含量(mg/g)和Ⅰ/Ⅲ型胶原比例
项 目
烧伤后时间(d)
3 d
7 d
10 d
14 d
21 d
羟脯氨酸
17.8±2.3
23.4±4.4*
26.0±2.9△
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30.4±3.5△
28.8±3.0△
Ⅰ/Ⅲ型胶原比例
4.7±0.7
4.0±0.6*
2.9±0.4△
2.8±0.2△
2.6±0.3△
注：与正常对照组比较*P<0.05； △P<0.01 3.病理形态学观察：伤后3 d坏死组织与活组织界面可见白细胞浸润带。伤后7 d和10 d坏死组织开始与活组织分离脱落。伤后14 d明显可见表皮细胞从创缘向创面爬行，匍匐在创面表面。伤后21 d大部分创面已被上皮细胞覆盖。
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讨论
深Ⅱ度烧伤修复的过程包括炎症反应、细胞增殖、结缔组织形成、创面收缩和创面重新塑造。浸入创面组织的炎症细胞不仅具有清除坏死组织和异物的功能，同时分泌各种细胞因子，参与细胞分化和增殖过程。本实验在伤后3、7、10 d病理组织切片上明显可见白细胞浸润带，继之坏死组织与活组织分离脱落，为上皮细胞的增殖和迁移作好准备。
细胞DNA周期分析是从细胞水平了解细胞增殖状态，细胞的增殖反映了细胞的修复情况，DNA的合成是细胞增殖的必要过程，发生DNA复制的S期细胞增多意味着细胞增殖增多。烧伤创面愈合是皮肤细胞活化、增殖、分裂的过程。当细胞增殖、分裂时，G0/G1期细胞就不断进入S期。深Ⅱ度烧伤创面不仅有表皮细胞的破坏，还有大量真皮细胞的破坏。伤后10 d S期细胞百分比达峰值显著高于正常对照组，G0/G1期细胞百分比显著低于正常对照组，表明大量处于G1和G0期的静止细胞进入S期，进行DNA复制。真皮细胞中主要是成纤维细胞，通过测定成纤维细胞增殖周期可反映真皮细胞增殖状况，成纤维细胞主要功能是合成胶原蛋白，成纤维细胞大量增殖为新生胶原合成奠定了基础。
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深Ⅱ度烧伤创面修复包括真皮的修复，修复过程中所形成的结缔组织主要成分是成纤维细胞及其产生的胶原蛋白，胶原是皮肤主要结构蛋白，一直作为创面愈合研究的主要对象。胶原蛋白构成烧伤创面基质，为创面上皮化提供一个支架[3]。了解创面愈合过程中胶原代谢状况可反映创面愈合情况，OHP在胶原中所占比例相当恒定，大约12.5%[4]。
定OHP含量可间接反映胶原的含量。烧伤创面OHP含量升高表明烧伤皮肤组织中胶原合成和积累增加。本研究测得的烧伤创面组织OHP含量变化与杨太美[5]、张远贵[6]等在大鼠深Ⅱ度烧伤创面测得的结果相似。与方勇等[7]在大鼠浅Ⅱ度烧伤创面所测得的OHP含量在伤后3 d达高峰，伤后10 d恢复正常的结果不同，而在本研究创面组织OHP含量伤后14 d达高峰，伤后21 d仍显著高于正常皮肤OHP含量，伤后Ⅰ/Ⅲ型胶原比值逐渐降低，伤后21 d仍显著低于正常对照组，提示深Ⅱ度烧伤伤后21 d胶原合成仍然很活跃，真皮的修复过程尚未终止。正常皮肤中主要以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主，Ⅲ型胶原占总胶原的10%～20%。创伤后，皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量不断变化，皮肤切口伤中，早期以Ⅲ型胶原首先增高，在创面愈合过程中逐渐为较成熟的Ⅰ型胶原所取代，最后Ⅰ型胶原占总胶原的80%～90%。Ⅰ型胶原在成熟组织中，而Ⅲ型胶原是一种新合成的胶原，Ⅰ、Ⅲ型胶原比值降低表示在胶原中新生胶原增加。胶原是细胞外基质的主要组成成分，细胞外基质加速重建，可为表皮细胞的迁移和增殖提供一个合适的微环境。
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烧伤创面修复以创面完全上皮化作为创面愈合的终点，因此表皮细胞分化、增殖和迁移是烧伤创面愈合过程中最重要的环节。本实验在病理切片中观察到伤后14 d至21 d深Ⅱ度烧伤创面表皮细胞增殖和迁移最活跃，这与浅Ⅱ度烧伤创面不同[8]。
综上所述，深Ⅱ度烧伤创面愈合过程有其特殊的规律。伤后3～10 d炎症反应明显。伤后10～14 d主要表现为成纤维细胞增殖。伤后14 d胶原代谢最活跃，新生胶原合成最多，持续到伤后21 d。伤后14～21 d表皮细胞增殖和迁移最活跃。
作者单位：陈新龙 441003 襄樊，解放军第四七七医院
余明星 441003 襄樊，解放军第四七七医院
陈文山 441003 襄樊，解放军第四七七医院
许伟石 上海市烧伤研究所
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陆树良 上海市烧伤研究所
史济湘 上海市烧伤研究所
参考文献
[1]宋平根，李素文.流式细胞术的原理和应用.第1版.北京：北京师范大学出版社，1992.
[2]李玉瑞.细胞外间质的生物化学及研究方法. 第1版.北京：人民卫生出版社, 1988.172-232.
[3]Lidblad WJ, Kormos AI. Collagen: a multifunctional family of protains. J Reconstr Microsurg,1991,7:37-43.
[4]Edwards GA, Orien WD. Modified assay for determination of OHP in a tissue hydrolyzate. Clin Chim Acta, 1980,104:161-167.
[5]杨太美，冯世杰. 大鼠深Ⅱ度烧伤皮肤胶原变化的观察.上海第二医科大学学报，1997,17增刊：91-92.
[6]张远贵，许伟石，史济湘.类肝素对大鼠Ⅱ度烫伤创面愈合的影响.中华整形烧伤外科杂志，1998,14：15-17.
[7]方勇，陈玉林，胡云风,等.烧伤创面OHP含量动态变化的实验研究.中华整形烧伤外科杂志，1996,12:48-50.
[8]姚敏，王文奎，密磊,等.大鼠浅Ⅱ烫伤创面表皮细胞周期分析.上海第二医科大学学报，1997,17增刊:88-90., 百拇医药
摘 要 目的：探讨深Ⅱ度烧伤创面愈合规律。 方法：通过48只大鼠深Ⅱ度烧伤模型，动态观察烧伤后不同时间点创面成纤维细胞增殖周期、羟脯氨酸(OHP)含量和Ⅰ/Ⅲ型胶原比值变化及病理组织学改变。 结果：伤后10 d真皮细胞s期细胞百分比达高峰，伤后21 d仍显著高于正常对照组。OHP含量伤后逐渐增加，伤后14 d达高峰，伤后21 d仍显著高于正常对照组。伤后Ⅰ/Ⅲ型胶原比值逐渐降低，并显著低于正常对照组，病理切片观察伤后3～10 d明显可见白细胞浸润带，伤后14 d可见上皮细胞自创缘及坏死组织界面爬行生长。 结论：深Ⅱ度烧伤创面伤后3～10 d以炎症反应为主。伤后10～14 d主要表现为成纤维细胞增殖和新生胶原合成，伤后21 d真皮的修复尚未结束。伤后14～21 d主要为表皮细胞增殖和迁移。
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关键词：烧伤 细胞周期 羟脯氨酸 胶原
烧伤创面愈合主要包括炎症反应、细胞增殖、结缔组织形成等过程。创面愈合首先表现为局部炎症反应，炎性细胞引起的炎症反应不仅为清除坏死组织和异物所必需，且同时启动和调控创面修复。其次是细胞增殖，细胞增殖主要为成纤维细胞和表皮细胞的增殖，是烧伤愈合过程关键环节。结缔组织主要成分是成纤维细胞及其形成的胶原蛋白，胶原是细胞外基质的主要组成部分，细胞外基质的加速重建，可为表皮细胞的迁移和增殖提供一个合适的微环境。深Ⅱ度烧伤创面愈合过程中炎症反应、细胞增殖和结缔组织形成时相性变化尚缺乏深入研究。本研究旨在探索深Ⅱ度烧伤创面愈合过程中成纤维细胞增殖周期、羟脯氨酸(OHP)含量和Ⅰ/Ⅲ型胶原比值及上皮化过程动态变化规律。
材料与方法
1.实验动物：清洁级Sprague-Dawley大鼠，体重200～250 g，雌雄不拘，上海必凯-西普尔实验动物有限公司供应，数量48只。
, 百拇医药
2.大鼠深Ⅱ度烫伤模型制作:2.5%戊巴比妥钠(30～35 mg /kg)腹腔内注射麻醉后，剪除背部长毛，硫化钡脱毛剂均匀涂于背部，片刻后去除脱毛剂，置室温25 ℃、湿度为50%环境中分笼饲养，自由进食进水。24 h后同样麻醉后将大鼠固定于烫伤板上，背部置于80℃水温中烫6秒，制成10%TBSA深Ⅱ度烧伤模型，经病理证实。伤后立即腹腔内注射乳酸林格氏液5ml进行液体复苏。烧伤创面采用暴露疗法。
3.标本采集时间和方法:伤后3、7、10、14、21 d分别取创面标本，大约3 cm×5 cm，每个时间点各处死8只大鼠，创面组织标本分别置于同位素瓶中，-80℃保存。病理标本固定于40%甲醛标本固定液中。
4.烧伤创面组织真皮细胞增殖周期检测：标本制备采用机械法和胰酶消化法，标本检测采用流式细胞仪测定[1]。
5.烧伤创面OHP含量检测：采用氯胺T氧化法。
, 百拇医药
6.烧伤创面中Ⅰ/Ⅲ型胶原比例检测：标本制备采用乙酸-胃蛋白酶法，标本检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA技术)[2]。
7.烧伤创面组织形态学观察：采用Masson三色染色法和HE染色。
8.统计方法:各组间比较采用多因素方差分析及Student′t检验,所有数据均用±s表示，P<0.05为有显著差异水平。
结果
1.烧伤创面组织成纤维细胞增殖周期百分比变化:如表1。正常皮肤组织成纤维细胞周期各期细胞百分比：G0/G1为(82.88±2.34)%；S为(10.32±1.57)%；G2+M为(1.43%±0.65)%。
表1 烧伤后各时间点成纤维细胞增殖周期各期百分比(%,n=8)
, 百拇医药
项 目
烧伤后时间(天)
10 d
14 d
21 d
G0/G1期百分比
60.7±1.2*
71.2±2.2*
78.7±1.6△
S期细胞百分比
35.6±2.4*
, 百拇医药
25.1±2.9*
14.9±3.3△
G2+M期百分比
3.7±3.3*
3.7±1.4*
6.4±1.8*
注：与正常对照组比较*P<0.05； △P<0.01 伤后3、7 d深Ⅱ度烧伤创面成纤维细胞数很难达到106/ml，且碎片较多无法检测，故资料缺如。
2.烧伤创面组织OHP含量和Ⅰ/Ⅲ型胶原比例变化：见表2。正常大鼠皮肤OHP含量为：15.8±3.2。正常大鼠皮肤Ⅰ/Ⅲ型胶原比例为：4.785±0.432。
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表2 大鼠烧伤后不同时间创面OHP含量(mg/g)和Ⅰ/Ⅲ型胶原比例
项 目
烧伤后时间(d)
3 d
7 d
10 d
14 d
21 d
羟脯氨酸
17.8±2.3
23.4±4.4*
26.0±2.9△
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30.4±3.5△
28.8±3.0△
Ⅰ/Ⅲ型胶原比例
4.7±0.7
4.0±0.6*
2.9±0.4△
2.8±0.2△
2.6±0.3△
注：与正常对照组比较*P<0.05； △P<0.01 3.病理形态学观察：伤后3 d坏死组织与活组织界面可见白细胞浸润带。伤后7 d和10 d坏死组织开始与活组织分离脱落。伤后14 d明显可见表皮细胞从创缘向创面爬行，匍匐在创面表面。伤后21 d大部分创面已被上皮细胞覆盖。
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讨论
深Ⅱ度烧伤修复的过程包括炎症反应、细胞增殖、结缔组织形成、创面收缩和创面重新塑造。浸入创面组织的炎症细胞不仅具有清除坏死组织和异物的功能，同时分泌各种细胞因子，参与细胞分化和增殖过程。本实验在伤后3、7、10 d病理组织切片上明显可见白细胞浸润带，继之坏死组织与活组织分离脱落，为上皮细胞的增殖和迁移作好准备。
细胞DNA周期分析是从细胞水平了解细胞增殖状态，细胞的增殖反映了细胞的修复情况，DNA的合成是细胞增殖的必要过程，发生DNA复制的S期细胞增多意味着细胞增殖增多。烧伤创面愈合是皮肤细胞活化、增殖、分裂的过程。当细胞增殖、分裂时，G0/G1期细胞就不断进入S期。深Ⅱ度烧伤创面不仅有表皮细胞的破坏，还有大量真皮细胞的破坏。伤后10 d S期细胞百分比达峰值显著高于正常对照组，G0/G1期细胞百分比显著低于正常对照组，表明大量处于G1和G0期的静止细胞进入S期，进行DNA复制。真皮细胞中主要是成纤维细胞，通过测定成纤维细胞增殖周期可反映真皮细胞增殖状况，成纤维细胞主要功能是合成胶原蛋白，成纤维细胞大量增殖为新生胶原合成奠定了基础。
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深Ⅱ度烧伤创面修复包括真皮的修复，修复过程中所形成的结缔组织主要成分是成纤维细胞及其产生的胶原蛋白，胶原是皮肤主要结构蛋白，一直作为创面愈合研究的主要对象。胶原蛋白构成烧伤创面基质，为创面上皮化提供一个支架[3]。了解创面愈合过程中胶原代谢状况可反映创面愈合情况，OHP在胶原中所占比例相当恒定，大约12.5%[4]。
定OHP含量可间接反映胶原的含量。烧伤创面OHP含量升高表明烧伤皮肤组织中胶原合成和积累增加。本研究测得的烧伤创面组织OHP含量变化与杨太美[5]、张远贵[6]等在大鼠深Ⅱ度烧伤创面测得的结果相似。与方勇等[7]在大鼠浅Ⅱ度烧伤创面所测得的OHP含量在伤后3 d达高峰，伤后10 d恢复正常的结果不同，而在本研究创面组织OHP含量伤后14 d达高峰，伤后21 d仍显著高于正常皮肤OHP含量，伤后Ⅰ/Ⅲ型胶原比值逐渐降低，伤后21 d仍显著低于正常对照组，提示深Ⅱ度烧伤伤后21 d胶原合成仍然很活跃，真皮的修复过程尚未终止。正常皮肤中主要以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主，Ⅲ型胶原占总胶原的10%～20%。创伤后，皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量不断变化，皮肤切口伤中，早期以Ⅲ型胶原首先增高，在创面愈合过程中逐渐为较成熟的Ⅰ型胶原所取代，最后Ⅰ型胶原占总胶原的80%～90%。Ⅰ型胶原在成熟组织中，而Ⅲ型胶原是一种新合成的胶原，Ⅰ、Ⅲ型胶原比值降低表示在胶原中新生胶原增加。胶原是细胞外基质的主要组成成分，细胞外基质加速重建，可为表皮细胞的迁移和增殖提供一个合适的微环境。
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烧伤创面修复以创面完全上皮化作为创面愈合的终点，因此表皮细胞分化、增殖和迁移是烧伤创面愈合过程中最重要的环节。本实验在病理切片中观察到伤后14 d至21 d深Ⅱ度烧伤创面表皮细胞增殖和迁移最活跃，这与浅Ⅱ度烧伤创面不同[8]。
综上所述，深Ⅱ度烧伤创面愈合过程有其特殊的规律。伤后3～10 d炎症反应明显。伤后10～14 d主要表现为成纤维细胞增殖。伤后14 d胶原代谢最活跃，新生胶原合成最多，持续到伤后21 d。伤后14～21 d表皮细胞增殖和迁移最活跃。
作者单位：陈新龙 441003 襄樊，解放军第四七七医院
余明星 441003 襄樊，解放军第四七七医院
陈文山 441003 襄樊，解放军第四七七医院
许伟石 上海市烧伤研究所
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陆树良 上海市烧伤研究所
史济湘 上海市烧伤研究所
参考文献
[1]宋平根，李素文.流式细胞术的原理和应用.第1版.北京：北京师范大学出版社，1992.
[2]李玉瑞.细胞外间质的生物化学及研究方法. 第1版.北京：人民卫生出版社, 1988.172-232.
[3]Lidblad WJ, Kormos AI. Collagen: a multifunctional family of protains. J Reconstr Microsurg,1991,7:37-43.
[4]Edwards GA, Orien WD. Modified assay for determination of OHP in a tissue hydrolyzate. Clin Chim Acta, 1980,104:161-167.
[5]杨太美，冯世杰. 大鼠深Ⅱ度烧伤皮肤胶原变化的观察.上海第二医科大学学报，1997,17增刊：91-92.
[6]张远贵，许伟石，史济湘.类肝素对大鼠Ⅱ度烫伤创面愈合的影响.中华整形烧伤外科杂志，1998,14：15-17.
[7]方勇，陈玉林，胡云风,等.烧伤创面OHP含量动态变化的实验研究.中华整形烧伤外科杂志，1996,12:48-50.
[8]姚敏，王文奎，密磊,等.大鼠浅Ⅱ烫伤创面表皮细胞周期分析.上海第二医科大学学报，1997,17增刊:88-90., 百拇医药