洛士辛对豚鼠心室肌细胞L型钙通道的作用
作者：王嘉陵 姚伟星 牛小群 康华光
单位：王嘉陵 姚伟星(同济医科大学药理教研室武汉 430030)；牛小群 康华光(华中理工大学生物化学与生物物理研究所武汉 430061)
关键词：洛士辛；膜片钳技术；L-型钙电流；单个心室肌细胞
中国现代医学杂志000716 采用膜片钳技术，研究Lot对单个豚鼠心室细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响。Lot1～200μmol/L浓度依赖性地增加ICa-L幅值，EC 50为38μmol/L，Lot30μmol/L使最大峰值电流增加60%。其促 钙 作用无明显使用依赖性，略促进钙通道电流激活，显著地减少钙电流的稳态失活。表明Lot 增加L型钙电流作用主要与减少钙电流的稳态失活有关。
分类号 R33.33
, http://www.100md.com
EFFECTS OF LOTUSINE ON L-TYPE CALCIUM CURRENTS
IN GUINEA PIG VENTRICULAR CELLS
Wang Jialing, et al.
(Department of Pharmacology, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract: Lotusine (Lot), a pure alkaloid extracted from the green seed embry of Nelumbo nucifera Gaertn, was shown to possess positive inotropic effect on myoc ardium. In this paper, patch clamp techniques were used to study the effects of Lot on L-type calcium currents (ICa-L) in single ventricular myocyte of guinea p ig. In whole cell recording mode, Lot 1～200 μmol.L-1 could does-depende ntly in crease the amplitude of ICa-L with ED50 of 38μmol.L-1 and the increment of the peak ICa-L by 60%, but without the change of the potential of the maximum ICa-L . It was found that the effect of Lot possessed use-dependent. Lot 30μmol.L -1 slightly encouraged L-type calcium channel activation. Moreover, it significant ly decreased the channel deactivation. The results suggested that the main manne r of enhancement of L-type calcuim current of Lot may be related to delay of L-t ype calcium channel inactive.
, 百拇医药
Key words: Lotusine; Patch Clamp; L-type Calcium Current; Single Ventricular Myocyte
洛士辛(Lotusine,Lot)系从传统中药莲子心中分离出一种单苄基异喹 类 生物碱单体，波谱及理化测定数据与文献相符[1，2]，Lot明显增加心肌收缩力 且正性肌力作用强度略高于氨力农[3]，延长豚鼠乳头状肌的动作时程，增加犬浦 肯野纤维的慢内向电流。本文旨在研究洛士辛对单个心肌细胞ICa-L及 钙通道动力学过程的影响，以探讨其心肌正性肌力作用产生的机制。
1 材料与方法
1.1 动物、药品与试剂
豚鼠，体重(335±56)g，雌雄兼用，均由同济医科大学实验动物学部提供。Lot由同济医科 大 学药理教研室植化组提供，MP：213～214℃[4]。CsCL、CsOH、MgATP、TEA为Sigma 产品；Bay K8644为德国Bayer药厂赠品；TTX购自湖北省水产研究所；其他均为国产分析纯 剂。标准外液(mmol/L)：NaCl135,KCl 5.4,CaCl2 1.8，MgCl2 1，NaH 2PO4 0.33，Hepes 10,NaOH调节pH为7.2。激活曲线和失活曲线研究时，加入TT X10μmol/L，并以TEA取代NaCl。全细胞钙流内液(mmol/L)：CsCl 120,N aCl 10,CaCl2 1.0，MgATP 5.0,EGTA 11，Hepes 10,KOH调节pH至7.3。
, 百拇医药
1.2 心室肌细胞分离及电生理记录
豚鼠心室细胞标本制备：采用蛋白酶E-胶原酶合用法分离心室肌细胞[4]。具体分 离步骤及液体同文献[5]。单细胞电流记录采用放大器(PC-Ⅱ型)及数据采集系统( DA-Ⅰ型)(华中理工大学生物物理与生物化学研究所)。玻璃毛胚(GG-17，上海脑生研究所或 G-1.5，Narishige，日本)于PP-83型微电极拉制仪(Narishige，日本)两步拉制成尖端1.5～ 2 .5μm电极，经MF-33抛光仪(Narishige，日本)抛光后立即使用，电极电阻2～3MΩ。实验原 始波形及数据保存于计算机(IBM PC/486)磁盘中，分析打印出结果。实验数据均以x±s表示，采用t检验。
2 结果
2.1 Lot对L型钙电流影响的时效、量效关系及使用依赖性
, 百拇医药
2.1.1 Lot作用的时效过程 保持电位-40mV,频率0.1Hz，持续时间150ms， 幅值0mV的去极化刺激引出L型钙通道电流。稳定观察3～5min，钙电流幅值无明显变化，采 用玻璃微管细胞加药，并记录Lot 30μmol/L对钙电流作用的时效过程，Lot增加ICa-L 作用约在1.5min达峰值，持续约9min。
2.1.2 Lot作用的浓度依赖性 胞外灌流液中给药，药物稳定作用(3～4min )后记录，Lot1～200μmol/L浓度依赖性增加ICa-L幅度。1，3，10，30，100，200μ mol/L分别使ICa-L从加药前的5.0±0.4 ，5.0±0.5，4.8±0.5，5.1±0.5，4.8±0.5，4.7±0.6，pA/pF增大到加药后的5.1±0. 4(n=6,P<0.05)，5.4±0.6，5.3±0.7，6.5±0.6，6.1±0.5，6.9±0.6(n=6，P <0.01)pA/pF。依I=Imax/(EC50/[Lot]+1)式作曲线拟合，Lot作用的EC 50和Imax分别为38μmol/L和增加60%。
, 百拇医药
2.1.3 Lot作用的使用依赖性 研究了Lot对ICa-L作用的使用依赖性[6]。频率0.5Hz和 1Hz，其它同前。给予Lot 30μmol/L后，停止刺激4min，再行与对照组相同的连 续刺激。比较加药前后第1～15个刺激的ICa-L幅值，结果表明，Lot作用无明显 使用依赖性，主要是通过强直作用(tonic action)促钙内流。
2.2 Lot对L型钙电流激活、失活的影响
Lot对ICa-L的Ⅰ～Ⅴ曲线影响研究证实，Lot增加ICa-L，但不改变Ⅰ～Ⅴ曲线 形状，最大激活峰值电流电位为0mV。
2.2.1 Lot对激活曲线的影响 保持电位-50mV给予幅值-40mV～+60mV，持 续时间10ms的阶跃刺激，引出ICa-L然后回复至保持电位，记录每一钳位电压下的尾 电 流，与对照最大尾电流比较衡量L型钙通道的激活程度，并据此绘制加药前后的曲线 。激活曲线依玻尔兹曼分布进行拟合：f=1/{1+exp[(V1/2-V)/k]}，其中V1 / 2表示半数最大激活电位，k为激活曲线斜率常数。结果表明，Lot 30μmol/L略 影响V1/2和k，但不具显著性。激活曲线参数V1/2分别对照的-(15.9±2.6)mV 和(6.9±0.4)mV变为-(17.2±3.1)mV和(7.8±0.5)mV(n=4,P>0.05)。
, 百拇医药
2.2.2 Lot对失活曲线的影响
为了解保持电位是否影响Lot对钙电流的作用，采用“双刺”钳位法研究了Lot对稳态失活曲 线的影响。保证电位-60mV，先给予持续时间1s，幅值-50mV～+20mV的前刺激，然后回复于 保持电位10ms，最后再以持续时间85ms，+10mV的测试刺激(test pulse)引出需要测量的峰 电流。将所测量值与无前刺激所引出的钙电流比较，可绘制加药前后的稳态失活曲线[ 7]。结果显示给Lot 30μmol/L前后的稳态激活曲线，在电位较低的前刺激下 ，Lot显著地减少钙通道的稳态失活，依玻尔兹曼(Boltzmann)分布进行拟合，结果Lot使V 1/2和k分别由对照的-(27.1±1.4)mV和(7.5±0.5)mV变为(-32.6±2.8)mV和(8.4±0.5) mV(n=5,P<0.05)。
3 讨论
, http://www.100md.com 曾证实Lot促进犬浦肯野纤维的慢钙通道内流，本文在单个豚鼠心室肌细胞标 本，再次证明Lot可浓度依赖性地增加ICa-L，因此，促钙经L型通道内流，进而导致 心肌收缩增加[3]是Lot正肌作用发生机制之一。
Lot增加ICa-L作用约在1.5min达峰值，持续约9min。在此时间过程内，钙电流衰减应 不很严重，记录到的数值较为可靠。Lot作用的EC50和Imax分别为38μmol/L和增加60%，这与Lot 30μmol/L使心肌收缩力增加56%～80%相 一致。
Lot促钙内流作用无使用依赖性，不改变Ⅰ～Ⅴ曲线的最大激活峰值电流电位，略促进激活 ；在电位较低的前刺激下，其显著地减少钙通道的稳态失活。表明Lot增加L型钙电流作用机 制主要与钙通道的稳态失活有关[8]，而经L型钙通道流入的Ca++增加可部 分解释其正性肌力作用产生的机制。
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参 考 文 献
1，古川宏，杨蒇雄.莲子心中生物碱成分的研究.第11报.药学杂志(日文)，1965；8 5(5)：472～475
2，王嘉陵，胡学民，蔡宏生，等.莲心碱中生物碱成分的研究.中国中药杂志，1991 ；16(11)：673～675
3，王嘉陵，赵志方，李 明，等.洛士辛对心肌特性的影响.同济医科 大学学报，1999；28(5)：12
4，Mitra R,Morad M.A uniform enzymatic method for dissociation sfmyocytes from heart and stomahs of vertebrates.Am Jm Physiol,1985;249:1056～1060
5，Sheng Yan Xin-Hua Li,Wei-Jin xia,Ming-XingJiang,et al.The effect of Be nzytetralhydropalmatime in actiom currentsin guiea pig ventricular myocytes of C hunese Phineses Phinese Pharmaceutical Science,1998;7(4):214～217
, 百拇医药
6，Kamp TJ,Sanguinetti MC,Miller RJ.Voltage-and use-dependent modulation of alcium channels channels by dihydropyridine(+)-202-791.Cire Res,1089;64:338～ 351
7，Valenzuela C,Bennett PB.Voltage-and use-dependent moudulation of calci um channel current in guinea in pig ventricular cells by amiodarone.J Cardiovasc ol,1991;17:894～902
8，McDonaland TF,Pelzer S,Trautwein W,et al.Regullation and modulation of calcium channel in cardiac.skeletal and smooth muscle cells.physiol ReW,1994;74 :365～507, http://www.100md.com
单位：王嘉陵 姚伟星(同济医科大学药理教研室武汉 430030)；牛小群 康华光(华中理工大学生物化学与生物物理研究所武汉 430061)
关键词：洛士辛；膜片钳技术；L-型钙电流；单个心室肌细胞
中国现代医学杂志000716 采用膜片钳技术，研究Lot对单个豚鼠心室细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响。Lot1～200μmol/L浓度依赖性地增加ICa-L幅值，EC 50为38μmol/L，Lot30μmol/L使最大峰值电流增加60%。其促 钙 作用无明显使用依赖性，略促进钙通道电流激活，显著地减少钙电流的稳态失活。表明Lot 增加L型钙电流作用主要与减少钙电流的稳态失活有关。
分类号 R33.33
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EFFECTS OF LOTUSINE ON L-TYPE CALCIUM CURRENTS
IN GUINEA PIG VENTRICULAR CELLS
Wang Jialing, et al.
(Department of Pharmacology, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract: Lotusine (Lot), a pure alkaloid extracted from the green seed embry of Nelumbo nucifera Gaertn, was shown to possess positive inotropic effect on myoc ardium. In this paper, patch clamp techniques were used to study the effects of Lot on L-type calcium currents (ICa-L) in single ventricular myocyte of guinea p ig. In whole cell recording mode, Lot 1～200 μmol.L-1 could does-depende ntly in crease the amplitude of ICa-L with ED50 of 38μmol.L-1 and the increment of the peak ICa-L by 60%, but without the change of the potential of the maximum ICa-L . It was found that the effect of Lot possessed use-dependent. Lot 30μmol.L -1 slightly encouraged L-type calcium channel activation. Moreover, it significant ly decreased the channel deactivation. The results suggested that the main manne r of enhancement of L-type calcuim current of Lot may be related to delay of L-t ype calcium channel inactive.
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Key words: Lotusine; Patch Clamp; L-type Calcium Current; Single Ventricular Myocyte
洛士辛(Lotusine,Lot)系从传统中药莲子心中分离出一种单苄基异喹 类 生物碱单体，波谱及理化测定数据与文献相符[1，2]，Lot明显增加心肌收缩力 且正性肌力作用强度略高于氨力农[3]，延长豚鼠乳头状肌的动作时程，增加犬浦 肯野纤维的慢内向电流。本文旨在研究洛士辛对单个心肌细胞ICa-L及 钙通道动力学过程的影响，以探讨其心肌正性肌力作用产生的机制。
1 材料与方法
1.1 动物、药品与试剂
豚鼠，体重(335±56)g，雌雄兼用，均由同济医科大学实验动物学部提供。Lot由同济医科 大 学药理教研室植化组提供，MP：213～214℃[4]。CsCL、CsOH、MgATP、TEA为Sigma 产品；Bay K8644为德国Bayer药厂赠品；TTX购自湖北省水产研究所；其他均为国产分析纯 剂。标准外液(mmol/L)：NaCl135,KCl 5.4,CaCl2 1.8，MgCl2 1，NaH 2PO4 0.33，Hepes 10,NaOH调节pH为7.2。激活曲线和失活曲线研究时，加入TT X10μmol/L，并以TEA取代NaCl。全细胞钙流内液(mmol/L)：CsCl 120,N aCl 10,CaCl2 1.0，MgATP 5.0,EGTA 11，Hepes 10,KOH调节pH至7.3。
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1.2 心室肌细胞分离及电生理记录
豚鼠心室细胞标本制备：采用蛋白酶E-胶原酶合用法分离心室肌细胞[4]。具体分 离步骤及液体同文献[5]。单细胞电流记录采用放大器(PC-Ⅱ型)及数据采集系统( DA-Ⅰ型)(华中理工大学生物物理与生物化学研究所)。玻璃毛胚(GG-17，上海脑生研究所或 G-1.5，Narishige，日本)于PP-83型微电极拉制仪(Narishige，日本)两步拉制成尖端1.5～ 2 .5μm电极，经MF-33抛光仪(Narishige，日本)抛光后立即使用，电极电阻2～3MΩ。实验原 始波形及数据保存于计算机(IBM PC/486)磁盘中，分析打印出结果。实验数据均以x±s表示，采用t检验。
2 结果
2.1 Lot对L型钙电流影响的时效、量效关系及使用依赖性
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2.1.1 Lot作用的时效过程 保持电位-40mV,频率0.1Hz，持续时间150ms， 幅值0mV的去极化刺激引出L型钙通道电流。稳定观察3～5min，钙电流幅值无明显变化，采 用玻璃微管细胞加药，并记录Lot 30μmol/L对钙电流作用的时效过程，Lot增加ICa-L 作用约在1.5min达峰值，持续约9min。
2.1.2 Lot作用的浓度依赖性 胞外灌流液中给药，药物稳定作用(3～4min )后记录，Lot1～200μmol/L浓度依赖性增加ICa-L幅度。1，3，10，30，100，200μ mol/L分别使ICa-L从加药前的5.0±0.4 ，5.0±0.5，4.8±0.5，5.1±0.5，4.8±0.5，4.7±0.6，pA/pF增大到加药后的5.1±0. 4(n=6,P<0.05)，5.4±0.6，5.3±0.7，6.5±0.6，6.1±0.5，6.9±0.6(n=6，P <0.01)pA/pF。依I=Imax/(EC50/[Lot]+1)式作曲线拟合，Lot作用的EC 50和Imax分别为38μmol/L和增加60%。
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2.1.3 Lot作用的使用依赖性 研究了Lot对ICa-L作用的使用依赖性[6]。频率0.5Hz和 1Hz，其它同前。给予Lot 30μmol/L后，停止刺激4min，再行与对照组相同的连 续刺激。比较加药前后第1～15个刺激的ICa-L幅值，结果表明，Lot作用无明显 使用依赖性，主要是通过强直作用(tonic action)促钙内流。
2.2 Lot对L型钙电流激活、失活的影响
Lot对ICa-L的Ⅰ～Ⅴ曲线影响研究证实，Lot增加ICa-L，但不改变Ⅰ～Ⅴ曲线 形状，最大激活峰值电流电位为0mV。
2.2.1 Lot对激活曲线的影响 保持电位-50mV给予幅值-40mV～+60mV，持 续时间10ms的阶跃刺激，引出ICa-L然后回复至保持电位，记录每一钳位电压下的尾 电 流，与对照最大尾电流比较衡量L型钙通道的激活程度，并据此绘制加药前后的曲线 。激活曲线依玻尔兹曼分布进行拟合：f=1/{1+exp[(V1/2-V)/k]}，其中V1 / 2表示半数最大激活电位，k为激活曲线斜率常数。结果表明，Lot 30μmol/L略 影响V1/2和k，但不具显著性。激活曲线参数V1/2分别对照的-(15.9±2.6)mV 和(6.9±0.4)mV变为-(17.2±3.1)mV和(7.8±0.5)mV(n=4,P>0.05)。
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2.2.2 Lot对失活曲线的影响
为了解保持电位是否影响Lot对钙电流的作用，采用“双刺”钳位法研究了Lot对稳态失活曲 线的影响。保证电位-60mV，先给予持续时间1s，幅值-50mV～+20mV的前刺激，然后回复于 保持电位10ms，最后再以持续时间85ms，+10mV的测试刺激(test pulse)引出需要测量的峰 电流。将所测量值与无前刺激所引出的钙电流比较，可绘制加药前后的稳态失活曲线[ 7]。结果显示给Lot 30μmol/L前后的稳态激活曲线，在电位较低的前刺激下 ，Lot显著地减少钙通道的稳态失活，依玻尔兹曼(Boltzmann)分布进行拟合，结果Lot使V 1/2和k分别由对照的-(27.1±1.4)mV和(7.5±0.5)mV变为(-32.6±2.8)mV和(8.4±0.5) mV(n=5,P<0.05)。
3 讨论
, http://www.100md.com 曾证实Lot促进犬浦肯野纤维的慢钙通道内流，本文在单个豚鼠心室肌细胞标 本，再次证明Lot可浓度依赖性地增加ICa-L，因此，促钙经L型通道内流，进而导致 心肌收缩增加[3]是Lot正肌作用发生机制之一。
Lot增加ICa-L作用约在1.5min达峰值，持续约9min。在此时间过程内，钙电流衰减应 不很严重，记录到的数值较为可靠。Lot作用的EC50和Imax分别为38μmol/L和增加60%，这与Lot 30μmol/L使心肌收缩力增加56%～80%相 一致。
Lot促钙内流作用无使用依赖性，不改变Ⅰ～Ⅴ曲线的最大激活峰值电流电位，略促进激活 ；在电位较低的前刺激下，其显著地减少钙通道的稳态失活。表明Lot增加L型钙电流作用机 制主要与钙通道的稳态失活有关[8]，而经L型钙通道流入的Ca++增加可部 分解释其正性肌力作用产生的机制。
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参 考 文 献
1，古川宏，杨蒇雄.莲子心中生物碱成分的研究.第11报.药学杂志(日文)，1965；8 5(5)：472～475
2，王嘉陵，胡学民，蔡宏生，等.莲心碱中生物碱成分的研究.中国中药杂志，1991 ；16(11)：673～675
3，王嘉陵，赵志方，李 明，等.洛士辛对心肌特性的影响.同济医科 大学学报，1999；28(5)：12
4，Mitra R,Morad M.A uniform enzymatic method for dissociation sfmyocytes from heart and stomahs of vertebrates.Am Jm Physiol,1985;249:1056～1060
5，Sheng Yan Xin-Hua Li,Wei-Jin xia,Ming-XingJiang,et al.The effect of Be nzytetralhydropalmatime in actiom currentsin guiea pig ventricular myocytes of C hunese Phineses Phinese Pharmaceutical Science,1998;7(4):214～217
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6，Kamp TJ,Sanguinetti MC,Miller RJ.Voltage-and use-dependent modulation of alcium channels channels by dihydropyridine(+)-202-791.Cire Res,1089;64:338～ 351
7，Valenzuela C,Bennett PB.Voltage-and use-dependent moudulation of calci um channel current in guinea in pig ventricular cells by amiodarone.J Cardiovasc ol,1991;17:894～902
8，McDonaland TF,Pelzer S,Trautwein W,et al.Regullation and modulation of calcium channel in cardiac.skeletal and smooth muscle cells.physiol ReW,1994;74 :365～507, http://www.100md.com