脑胶质瘤基因治疗现状和展望
作者：惠国桢
单位：苏州大学附属第一医院神经外科，苏州，215006
关键词：
苏州医学院学报000701 自从1992年，美国NIH批准第1个运用反转录病毒介导HSV-tk/GCV系统治疗脑胶质瘤的临床方案，全球掀起了肿瘤基因治疗的热潮。据Marcel统计，到目前为止，世界上已有232项基因治疗临床试验方案获准进行，其中105项为肿瘤基因治疗，而脑肿瘤基因治疗又是肿瘤基因治疗中的热点，占16项，14项针对恶性脑胶质瘤，另2项针对脑膜肉瘤和颅内转移癌，这其中包括我国一项，国内还有一些单位进行了广泛的实验研究。脑胶质瘤基因治疗的基础和临床研究蓬勃发展，为治疗脑胶质瘤提供了一种崭新的模式。
实现基因治疗的关键在于目的基因的高效转移和表达，目前基因治疗常用的转移方法有非病毒方法和病毒方法。非病毒载体虽然安全性高，但转移效率低，临床应用效果较差，人们的注意力更多地集中于病毒载体。病毒方法是目前应用最广的基因转移方法，常用的病毒载体有反转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺病毒相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)等。反转录病毒载体是较常用的方法，但由于其滴度低，难于纯化，且不稳定，不能感染非分裂细胞，有插入突变的可能，故目前运用更多的是腺病毒载体。最近美国批准的两个治疗脑胶质瘤的临床方案，均是采用腺病毒载体。腺病毒载体宿主范围广、易纯化、滴度高、安全性高、使用方便，能直接原位注射，转移率高达100%，可以感染分裂期和非分裂期的肿瘤细胞。运用腺病毒载体，已成功介导HSV-tk、细胞因子、肿瘤抑制因子等治疗脑胶质瘤，腺病毒载体特别适合脑胶质瘤的基因治疗，还在于中枢神经组织免疫原性相对较低，利于延长腺病毒载体的基因表达时间。许多研究者正在研究构建新一代的腺病毒载体，如微小腺病毒载体、温控型腺病毒载体等，腺病毒载体有可能成为临床应用最有前途的一种。Okada应用腺病毒相关病毒载体，Jia应用单纯疱疹病毒载体，实验性治疗脑胶质瘤都取得了一定效果，但尚无临床应用。各种病毒载体各有其优缺点，目前研究的热点是优化各种病毒载体，构建嵌合性载体、靶向性载体等，以更好地扬长避短，达到外源基因高效靶向性转移、稳定表达的目的。
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脑胶质瘤的发生、发展是多种癌基因和抑癌基因共同作用的结果，且与机体的免疫状态密切相关。针对这些因素，目前常用的基因治疗策略有自杀基因、分子免疫基因、反义基因、抑癌基因治疗。还有最近采用的抑制血管生成及抗肿瘤浸润及转移的基因治疗。
1 自杀基因治疗
所谓的自杀基因治疗，是指应用载体将自杀基因(存在于细菌和病毒中的酶代谢基因，一般哺乳动物不存在此基因)导入到宿主细胞中，给予宿主投以低毒性的细胞毒药物，使其只对基因导入的细胞进行特异杀伤的方法。这种方法不但应用于肿瘤的基因治疗，将来也可应用于AIDS(获得性免疫缺陷综合征)及GVHD(移植物抗宿主反应)[1]。有代表性的是HSV-tk基因与抗病毒药物GCV相结合的自杀基因治疗。到目前为止，针对胶质瘤基因治疗的16个方案中有10个是应用HSV-tk/GCV系统。HSV-tk能将抗病毒药物GCV进行特异的磷酸化，最后成为三磷酸化物。它阻止DNA合成而使细胞死亡。1992年NIH小组应用HSV-tk系统对胶质瘤动物模型进行基因治疗，他们应用反转录病毒作为载体转染鼠纤维母细胞，然后将转染后的纤维母细胞移植于脑肿瘤内，动物全身给予GCV药物治疗。应用此种方法虽然在肿瘤局部获得高水平表达的载体，但仍然不能使100%的肿瘤细胞受转染。虽然如此，实验中的肿瘤几乎完全消失，这种造成肿瘤细胞间接杀伤的机制被称为旁观者效应(bystander effect)[2]。旁观者效应的机制已部分阐明。在体外，基因导入的细胞通过缝隙连接将三磷酸化的GCV传至无基因导入的细胞而引起此细胞的杀伤。在体内可观察到间接的抗肿瘤效果。旁观者效应的另一机制是此种基因治疗导致肿瘤免疫的增强及肿瘤血管的闭塞。HSV-tk/GCV治疗致死的细胞释放出IL-1、IL-6、TNF等细胞因子，进而引起细胞粘附因子之一的ICAM-1及其辅助因子B7等免疫调节因子的活化，诱导杀伤性T淋巴细胞等[3，4]。NIH小组在动物模型的基础上进行临床实验，将HSV-tk转染后的鼠纤维母细胞立体定向注入到人脑肿瘤中，数日后给患者投以GCV。因异种细胞注入脑内引起免疫排斥反应造成局部脑水肿，应用激素减轻此反应。此方法对一部分病例有效[5]。但仍有许多问题尚待解决，一是基因导入的效率不如预想的高；再者，人肿瘤与动物模型相比处于分裂期的细胞比例少；动物实验不应用激素，而人体实验应用激素，降低人体的抗肿瘤免疫能力，因此疗效不如动物模型。Chen等[6]应用腺病毒作为载体对胶质瘤进行自杀基因治疗，其转染效率较高，但其表达不稳定，且载体自身的免疫原性较高，此缺点限制其临床应用。1998年，日本学者夏目与美国学者合作，将腺病毒相关病毒(adenovirus-associated virus,AAV)包装起来进行脑肿瘤动物模型基因治疗，获得显著效果[7]。AVV表达稳定性好，病毒无病原性，是较为理想的载体。
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另一个自杀系统是使用胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)基因，CD是大肠杆菌代谢旁路中的一种酶，它能将无毒性的抗真菌药物5-氟胞嘧啶(5-FC)转化成高度细胞毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU)，而哺乳动物细胞不含CD，不能将胞嘧啶转化为尿嘧啶，也不能将5-FC代谢成5-FU。5-FC在高度抗微生物活性的浓度下对哺乳动物却无毒性，但5-FU对哺乳动物细胞具有高度细胞毒性并广泛作为抗肿瘤化疗药物应用。5-FU被细胞代谢成5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸，后者抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制DNA合成。此外，它还能掺入RNA，通过阻止尿嘧啶和乳精酸掺入RNA而起抑制RNA合成的作用。徐艶飞等将含大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因的重组逆转录病毒感染大鼠神经胶质瘤C6细胞，转染了CD基因的C6细胞能在极低的5-FC浓度下被杀伤，并且同样具有旁观者效应。旁观者效应有助于弥补逆转录病毒感染效率不高的缺点[8]。
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2 免疫基因治疗(细胞因子基因，反义RNA)
肿瘤是宿主在免疫失衡条件下长出的新生物。如果宿主的肿瘤细胞总数有所减少，宿主具有的免疫能力能将残余的肿瘤细胞消灭。然而由于胶质瘤的一般免疫原性低下，免疫系统缺乏对自身肿瘤进行攻击的情报，因此不能消灭肿瘤。免疫基因治疗的目的是增强肿瘤细胞的免疫原性，增强淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL及lymphokine activated killer,LAK)杀伤肿瘤细胞的能力。应用细胞因子基因导入效应细胞(TIL，LAK)或者肿瘤细胞，激活肿瘤的特异免疫能力，使宿主体内局部肿瘤抗原及高浓度的细胞因子集聚，增强机体局部的抗肿瘤能力。
Sobol等[9]应用反转录病毒载体将IL-2基因导入患者自身的胶质瘤细胞，此种培养细胞经放射线照射后作为肿瘤疫苗反复接种于患者自身皮下，此种方案得到RAC(recombinant DNA advisory committee)的批准，结果患者经过10次疫苗接种后，4个月后复查MRI，可观察到肿瘤明显缩小，末梢血中可查到CD8+ T淋巴细胞。Bozik等提出将IL-4基因导入自身肿瘤细胞的治疗方案。此种免疫基因治疗的出发点是增强患者对肿瘤的免疫监视能力，对防止肿瘤的浸润和转移可能也有效。Trojan等[10]构建了一种特殊的载体，能表达IGF-1反义RNA，可与顺意IGF-mRNA结合，干扰转录，阻止翻译，抑制IGF-1的产生，结果发现转染后的C6胶质瘤细胞失去致瘤性，引起肿瘤的缓解。免疫组化证实，缓解的肿瘤中掺入的主要是CD8+ T细胞，提示IGF-1反义RNA激发的抗瘤作用是CD8+ T细胞介导的免疫排斥反应。Yoshida等[11]向免疫正常的C57 BL/6鼠移植鼠胶质瘤细胞，制作胶质瘤动物模型，再在肿瘤局部注射阳离子脂质体包裹的鼠β-IFN基因，发现肿瘤内有多量的CD+8 T细胞，肿瘤明显缩小。这种抗肿瘤效果包括β-IFN导入的直接抗肿瘤效果(包括其诱导的凋亡)和增强免疫递呈细胞的间接抗肿瘤效果[12]。
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3 抑癌基因，细胞周期调节基因治疗
在脑肿瘤细胞中导入过度表达的癌基因的反义RNA或抑癌基因，是肿瘤基因治疗的另一种研究方向。如针对癌基因ras、IGF-1、端粒酶(telomerase)的反义RNA基因治疗。IGF-1如前所述。端粒酶是一种核糖核蛋白体复合物，它有别于一般DNA聚合酶，是一种专一的逆转录酶，能以自身的RNA组分为模板从头合成端粒，使染色体的末端延长。端粒酶使细胞不死，这种酶在生殖细胞以外的正常细胞几乎没有，即使存在含量也极微。但大多数肿瘤细胞都发现此种酶的过剩[13]。在脑肿瘤中，针对端粒酶RNA用2-5A反义RNA进行基因治疗，2-5A反义RNA激活核酸内切酶RNase L,它使单链RNA降解，端粒酶失活，由此导致细胞凋亡[14]。
另一方面，针对抑癌基因p53、p16、E2F等也可进行基因治疗。p53基因位于17号染色体，编码53kDa的蛋白质，它与细胞周期、DNA损伤应答、细胞分化及血管的产生都密切相关[15]。在多种肿瘤中都存在缺失和突变。成人的胶质瘤中约1/3存在p53基因的缺失及突变[15，16]。p16基因亦与细胞周期循环密切相关，约70%的胶质瘤存在此基因的异常，包括缺失和突变或启动子区域的甲基化。可以针对此种基因进行治疗。Sandig等[17]利用腺病毒作载体同时转染p16和p53基因，对人肝细胞癌裸鼠动物模型进行基因治疗，结果能明显抑制肿瘤的生长。
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4 抑制血管生成的基因治疗
固体肿瘤的生长及增殖，需要新生血管提供足够的血运。因此，抑制肿瘤血管形成成为治疗肿瘤的另一策略。然而，长期全身投以抑制血管生成的药物存在实际上的困难。脑肿瘤位于颅内，由于血脑屏障的存在，肿瘤内很难获得有效的血药浓度。基因治疗可以克服以上的不足之处。近年来，肿瘤新生血管的促进因子与抑制因子的关系已部分阐明。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生长的促进因子。Im等[18]利用腺病毒载体将VEGF cDNA分子转染到胶质瘤细胞中，重组腺病毒载体Ad5 CMV-alpha VEGF携带野生型VEGF 165 cDNA反义编码序列，恶性胶质瘤细胞被其感染后，检测到内源性VEGF mRNA明显减少，相应的VEGF蛋白也明显减少。将Ad5 CMV-alpha VEGF注入到荷胶质瘤裸鼠体表的肿瘤中，明显抑制肿瘤的生长。血管抑素(angiostatin)和血小板因子4等血管生成抑制因子的基因治疗也有报道。血管抑素是33kDa的纤溶酶原片段，在肿瘤原发灶分泌，能抑制转移灶的增殖。其作用机制目前还未完全阐明，只知其有选择地作用于血管内皮细胞，抑制其增殖。对静止期的血管内皮细胞及其他细胞不起作用。将血管抑素基因导入胶质瘤细胞，在体内抑制血管生成，肿瘤细胞凋亡，肿瘤缩小[19]。
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p53亦有抑制血管生成的作用，其在血小板反应素(thrombospondin,TSP)诱导下作用于纤维母细胞，抑制血管生成[20]。野生型p53基因有诱导胶质瘤细胞株中血管生成抑制因子GD-AIF(glioma-derived angiogenesis inhibitory factor)的作用[21]。BAI-1(brain-specific angiogenesis inhibitor 1)是GD-AIF中的一种[22]，它与胶质瘤的恶化及进展有关，随着其作用机制的阐明，有希望在临床中应用。
欧美等国家已开始进行胶质瘤基因治疗的临床实验，但效果却不尽人意[5]。对小的肿瘤有效，而对大的肿瘤效果不明显。究其原因，一是载体的基因导入效率比动物实验低，二是肿瘤组织中载体的分布较局限。
针对脑肿瘤的基因治疗目前全世界已施行了2000多例，目前其仅是辅助治疗手段，尚不能凌驾于传统方法之上[1]。然而，随着基础研究的进展，基因治疗的方法也会逐渐完善。基因治疗应对癌组织产生最大的效果，而对正常组织的损害减少到最低限度。为达到以上目标，现正对载体进行改良。第2代载体的开发已有阶段性成果。理想的载体必须具备以下特点：(1)转染率高；(2)分离及纯化容易；(3)对正常组织无损害；(4)生产成本低；(5)能特异地导入。目前常用的两种载体各有其优缺点，反转录病毒载体能高效地将目的基因导入分裂期细胞，且表达稳定，但纯化和浓缩困难。腺病毒载体能有效地转染非分裂期细胞，携带大量的基因序列，可表达大量的基因产物，易纯化和浓缩。主要不足是目的基因表达不稳定，病毒能引起宿主的免疫反应。目前较有希望的病毒载体为AAV，此病毒能感染包括肺及肌肉在内的多种细胞，能将其基因整合到宿主的染色体中。而且，AAV能感染非分裂期细胞且不引起宿主的免疫反应。从此点上看，AAV明显优于反转录病毒及腺病毒。Mark和Kathryn等利用AAV载体对血友病动物进行基因治疗，获得了长期稳定的表达[23]。然而AAV也有其缺陷之处。第一，它只能负载较短的基因序列，这就限制了它的作用。第二，因其随机整合到宿主的染色体中，不能排除诱导癌变的危险。第三，由于制造困难，难以获得足够量的载体。也有学者设法应用多种载体的组合来提高基因的导入效率。日本名古屋大学夏目小组利用腺病毒或AAV与阳离子脂质体组合，将基因的导入率提高10倍[24]。
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各种基因治疗脑胶质瘤的策略都有一定的局限性，如自杀基因疗法中GCV的毒性作用、血脑屏障的阻碍、外源病毒或病毒细胞的排斥反应等；免疫基因治疗由于中枢神经免疫原性较弱，抗肿瘤效果不如外周系统。因此国内外学者最近提出联合基因治疗[25]，这将会是一种较新的策略，也是今后基因治疗的一大发展方向，联合基因治疗有自杀基因与细胞因子基因结合，自杀基因同化疗、放疗结合，细胞因子间联合基因治疗等。随着基因转移系统的逐步完善，选择更好的目的基因，相信基因治疗必将成为常规治疗的有力武器。
参考文献
1，Natsume A,Yoshida J.Gene therapy for glioma.Shinkei Kenkyu no Shinpo (Japanese),1999,43(3)∶359
2，Culver KW，Ram Z,Wallbridge S,et al.In vivo gene transfer with retroviral vector-produce cells for treatment of experimental brain tumors.Science,1992,256∶1550
, http://www.100md.com
3，Freeman SM,Ramesh R,Marrogi AJ.Immune system in suicide-gene therapy.Lancet,1997,349∶2
4，Beltinger C,Fulda S,Kammertoens T,et al.Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir-induced apoptosis involves ligand-independent death receptor aggregation and activation of caspases.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96∶8699
5，Ram Z,Culver KW,Oshiro EM,et al.Therapy of malignant brain tumors by intratumoral implantation of retroviral vector produ-
, 百拇医药
cing cells.Nat Med,1997,3∶1354
6，Chen SH,Shine HD,Goodman JC,et al.Gene therapy for brain tumors:regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91∶3054
7，Mizuno M,Yoshida J,Colosi P,et al.Adeno-associated virus vector containing the herpes simplex virus thymidine kinase gene causes complete regression of intracerebrally implanted human glioma in mice,in conjugation with ganciclovir administration.Jpn J Cancer Res,1998,89∶76
, 百拇医药
8，徐舲飞，戈 凯，郑仲承，等.CD自杀基因系统对胶质瘤细胞作用的实验研究.实验生物学报，1996，29(4)∶385
9，Sobol RE,Fakhrai H,Shawler D,et al.Interleukin-2 gene therapy in a patient with glioblastoma.Gene Ther,1995,2∶164
10，Trojan J,Johnson TR,Rudin SD,et al.Treatment and prevention of rat glioblastoma by immunogenic C6 cells expressing antisense insulin-like growth factor 1 RNA.Science,1993,259∶94
11，Yoshida J,Mizuno M,Yagi K.Cytotoxicity of human β-interferon produced in human glioma cells transfected with its gene by means of liposomes.Biochem Int,1992,28∶1055
, 百拇医药
12，Mizuno M,Yoshida J,Sugita K,et al.Growth inhibition of glioma cells transfected with the human β-interferon gene by liposomes coupled with a monoclonal antibody.Cancer Res,1990,50∶7826
13，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994;266∶2011
14，Kondo S,Kondo Y.Li G,et al.Trageted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5 A antisense directed against telomerase RNA.Oncogene,1998,16∶3323
, 百拇医药
15，Bogler O,Huang HJ,Kleihues P,et al.The p53 gene and its role in human brain tumors.Glia,1995,15∶308
16，Sidransky D,Mikkelsen T,Schwechheimer K,et al.Clonal expansion of p53 mutant cells is associated with brain tumour progression.Nature,1992,355∶846
17，Sandig V,Brand K,Herwig S,et al.Adenovirally transferred p16 INK4/CDKN2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death.Nature Med,1997,3∶313
, 百拇医药
18，Im SA,Gomez-Manzano-C,Fueyo J,et al.Antiangiogenesis treatment for gliomas transfer of antisense vascular endothelial growth factor inhibits tumor growth in vivo.Cancer Res,1999,59(4)∶895
19，Tanaka T,Cao Y,Folkman J,et al.Viral vector-targeted antiangiogenic gene therapy utilizing an angiostatin complementary DNA.Cancer Res,1998,58∶3362
20，Dameron KM,Volpert OV,Bouck N.Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1.Science,1994,265∶1582
, http://www.100md.com
21，van Meir EG,Polverini PJ,Chazin VR.Release of an inhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells.Nat Genet,1994,8∶171
22，Nishimori H,Shiratsuchi T,Urano T.A novel brain specific p53-target gene,BAI1,containing thrombospondin type 1 repeats inhibits experimental angiogenesis.Oncogene,1997,15∶2145
23，Kmiec B.Gene therapy.American Scientist,1999,97∶240
24，Mizuno M,Yoshida J.Improvement of transduction efficiency of recombinant adeno-associated virus vector by entrapment in multilamellar liposomes.Jpn J Cancer Res,1998,89∶352
25，李向东，惠国桢，卢大儒，等.腺病毒介导HSV-tk和反义IGF-1联合基因治疗鼠脑胶质瘤.中华神经外科杂志，1999，15(4)∶212
收稿：2000-06-23, 百拇医药
单位：苏州大学附属第一医院神经外科，苏州，215006
关键词：
苏州医学院学报000701 自从1992年，美国NIH批准第1个运用反转录病毒介导HSV-tk/GCV系统治疗脑胶质瘤的临床方案，全球掀起了肿瘤基因治疗的热潮。据Marcel统计，到目前为止，世界上已有232项基因治疗临床试验方案获准进行，其中105项为肿瘤基因治疗，而脑肿瘤基因治疗又是肿瘤基因治疗中的热点，占16项，14项针对恶性脑胶质瘤，另2项针对脑膜肉瘤和颅内转移癌，这其中包括我国一项，国内还有一些单位进行了广泛的实验研究。脑胶质瘤基因治疗的基础和临床研究蓬勃发展，为治疗脑胶质瘤提供了一种崭新的模式。
实现基因治疗的关键在于目的基因的高效转移和表达，目前基因治疗常用的转移方法有非病毒方法和病毒方法。非病毒载体虽然安全性高，但转移效率低，临床应用效果较差，人们的注意力更多地集中于病毒载体。病毒方法是目前应用最广的基因转移方法，常用的病毒载体有反转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺病毒相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)等。反转录病毒载体是较常用的方法，但由于其滴度低，难于纯化，且不稳定，不能感染非分裂细胞，有插入突变的可能，故目前运用更多的是腺病毒载体。最近美国批准的两个治疗脑胶质瘤的临床方案，均是采用腺病毒载体。腺病毒载体宿主范围广、易纯化、滴度高、安全性高、使用方便，能直接原位注射，转移率高达100%，可以感染分裂期和非分裂期的肿瘤细胞。运用腺病毒载体，已成功介导HSV-tk、细胞因子、肿瘤抑制因子等治疗脑胶质瘤，腺病毒载体特别适合脑胶质瘤的基因治疗，还在于中枢神经组织免疫原性相对较低，利于延长腺病毒载体的基因表达时间。许多研究者正在研究构建新一代的腺病毒载体，如微小腺病毒载体、温控型腺病毒载体等，腺病毒载体有可能成为临床应用最有前途的一种。Okada应用腺病毒相关病毒载体，Jia应用单纯疱疹病毒载体，实验性治疗脑胶质瘤都取得了一定效果，但尚无临床应用。各种病毒载体各有其优缺点，目前研究的热点是优化各种病毒载体，构建嵌合性载体、靶向性载体等，以更好地扬长避短，达到外源基因高效靶向性转移、稳定表达的目的。
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脑胶质瘤的发生、发展是多种癌基因和抑癌基因共同作用的结果，且与机体的免疫状态密切相关。针对这些因素，目前常用的基因治疗策略有自杀基因、分子免疫基因、反义基因、抑癌基因治疗。还有最近采用的抑制血管生成及抗肿瘤浸润及转移的基因治疗。
1 自杀基因治疗
所谓的自杀基因治疗，是指应用载体将自杀基因(存在于细菌和病毒中的酶代谢基因，一般哺乳动物不存在此基因)导入到宿主细胞中，给予宿主投以低毒性的细胞毒药物，使其只对基因导入的细胞进行特异杀伤的方法。这种方法不但应用于肿瘤的基因治疗，将来也可应用于AIDS(获得性免疫缺陷综合征)及GVHD(移植物抗宿主反应)[1]。有代表性的是HSV-tk基因与抗病毒药物GCV相结合的自杀基因治疗。到目前为止，针对胶质瘤基因治疗的16个方案中有10个是应用HSV-tk/GCV系统。HSV-tk能将抗病毒药物GCV进行特异的磷酸化，最后成为三磷酸化物。它阻止DNA合成而使细胞死亡。1992年NIH小组应用HSV-tk系统对胶质瘤动物模型进行基因治疗，他们应用反转录病毒作为载体转染鼠纤维母细胞，然后将转染后的纤维母细胞移植于脑肿瘤内，动物全身给予GCV药物治疗。应用此种方法虽然在肿瘤局部获得高水平表达的载体，但仍然不能使100%的肿瘤细胞受转染。虽然如此，实验中的肿瘤几乎完全消失，这种造成肿瘤细胞间接杀伤的机制被称为旁观者效应(bystander effect)[2]。旁观者效应的机制已部分阐明。在体外，基因导入的细胞通过缝隙连接将三磷酸化的GCV传至无基因导入的细胞而引起此细胞的杀伤。在体内可观察到间接的抗肿瘤效果。旁观者效应的另一机制是此种基因治疗导致肿瘤免疫的增强及肿瘤血管的闭塞。HSV-tk/GCV治疗致死的细胞释放出IL-1、IL-6、TNF等细胞因子，进而引起细胞粘附因子之一的ICAM-1及其辅助因子B7等免疫调节因子的活化，诱导杀伤性T淋巴细胞等[3，4]。NIH小组在动物模型的基础上进行临床实验，将HSV-tk转染后的鼠纤维母细胞立体定向注入到人脑肿瘤中，数日后给患者投以GCV。因异种细胞注入脑内引起免疫排斥反应造成局部脑水肿，应用激素减轻此反应。此方法对一部分病例有效[5]。但仍有许多问题尚待解决，一是基因导入的效率不如预想的高；再者，人肿瘤与动物模型相比处于分裂期的细胞比例少；动物实验不应用激素，而人体实验应用激素，降低人体的抗肿瘤免疫能力，因此疗效不如动物模型。Chen等[6]应用腺病毒作为载体对胶质瘤进行自杀基因治疗，其转染效率较高，但其表达不稳定，且载体自身的免疫原性较高，此缺点限制其临床应用。1998年，日本学者夏目与美国学者合作，将腺病毒相关病毒(adenovirus-associated virus,AAV)包装起来进行脑肿瘤动物模型基因治疗，获得显著效果[7]。AVV表达稳定性好，病毒无病原性，是较为理想的载体。
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另一个自杀系统是使用胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)基因，CD是大肠杆菌代谢旁路中的一种酶，它能将无毒性的抗真菌药物5-氟胞嘧啶(5-FC)转化成高度细胞毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU)，而哺乳动物细胞不含CD，不能将胞嘧啶转化为尿嘧啶，也不能将5-FC代谢成5-FU。5-FC在高度抗微生物活性的浓度下对哺乳动物却无毒性，但5-FU对哺乳动物细胞具有高度细胞毒性并广泛作为抗肿瘤化疗药物应用。5-FU被细胞代谢成5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸，后者抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制DNA合成。此外，它还能掺入RNA，通过阻止尿嘧啶和乳精酸掺入RNA而起抑制RNA合成的作用。徐艶飞等将含大肠肝菌胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因的重组逆转录病毒感染大鼠神经胶质瘤C6细胞，转染了CD基因的C6细胞能在极低的5-FC浓度下被杀伤，并且同样具有旁观者效应。旁观者效应有助于弥补逆转录病毒感染效率不高的缺点[8]。
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2 免疫基因治疗(细胞因子基因，反义RNA)
肿瘤是宿主在免疫失衡条件下长出的新生物。如果宿主的肿瘤细胞总数有所减少，宿主具有的免疫能力能将残余的肿瘤细胞消灭。然而由于胶质瘤的一般免疫原性低下，免疫系统缺乏对自身肿瘤进行攻击的情报，因此不能消灭肿瘤。免疫基因治疗的目的是增强肿瘤细胞的免疫原性，增强淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL及lymphokine activated killer,LAK)杀伤肿瘤细胞的能力。应用细胞因子基因导入效应细胞(TIL，LAK)或者肿瘤细胞，激活肿瘤的特异免疫能力，使宿主体内局部肿瘤抗原及高浓度的细胞因子集聚，增强机体局部的抗肿瘤能力。
Sobol等[9]应用反转录病毒载体将IL-2基因导入患者自身的胶质瘤细胞，此种培养细胞经放射线照射后作为肿瘤疫苗反复接种于患者自身皮下，此种方案得到RAC(recombinant DNA advisory committee)的批准，结果患者经过10次疫苗接种后，4个月后复查MRI，可观察到肿瘤明显缩小，末梢血中可查到CD8+ T淋巴细胞。Bozik等提出将IL-4基因导入自身肿瘤细胞的治疗方案。此种免疫基因治疗的出发点是增强患者对肿瘤的免疫监视能力，对防止肿瘤的浸润和转移可能也有效。Trojan等[10]构建了一种特殊的载体，能表达IGF-1反义RNA，可与顺意IGF-mRNA结合，干扰转录，阻止翻译，抑制IGF-1的产生，结果发现转染后的C6胶质瘤细胞失去致瘤性，引起肿瘤的缓解。免疫组化证实，缓解的肿瘤中掺入的主要是CD8+ T细胞，提示IGF-1反义RNA激发的抗瘤作用是CD8+ T细胞介导的免疫排斥反应。Yoshida等[11]向免疫正常的C57 BL/6鼠移植鼠胶质瘤细胞，制作胶质瘤动物模型，再在肿瘤局部注射阳离子脂质体包裹的鼠β-IFN基因，发现肿瘤内有多量的CD+8 T细胞，肿瘤明显缩小。这种抗肿瘤效果包括β-IFN导入的直接抗肿瘤效果(包括其诱导的凋亡)和增强免疫递呈细胞的间接抗肿瘤效果[12]。
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3 抑癌基因，细胞周期调节基因治疗
在脑肿瘤细胞中导入过度表达的癌基因的反义RNA或抑癌基因，是肿瘤基因治疗的另一种研究方向。如针对癌基因ras、IGF-1、端粒酶(telomerase)的反义RNA基因治疗。IGF-1如前所述。端粒酶是一种核糖核蛋白体复合物，它有别于一般DNA聚合酶，是一种专一的逆转录酶，能以自身的RNA组分为模板从头合成端粒，使染色体的末端延长。端粒酶使细胞不死，这种酶在生殖细胞以外的正常细胞几乎没有，即使存在含量也极微。但大多数肿瘤细胞都发现此种酶的过剩[13]。在脑肿瘤中，针对端粒酶RNA用2-5A反义RNA进行基因治疗，2-5A反义RNA激活核酸内切酶RNase L,它使单链RNA降解，端粒酶失活，由此导致细胞凋亡[14]。
另一方面，针对抑癌基因p53、p16、E2F等也可进行基因治疗。p53基因位于17号染色体，编码53kDa的蛋白质，它与细胞周期、DNA损伤应答、细胞分化及血管的产生都密切相关[15]。在多种肿瘤中都存在缺失和突变。成人的胶质瘤中约1/3存在p53基因的缺失及突变[15，16]。p16基因亦与细胞周期循环密切相关，约70%的胶质瘤存在此基因的异常，包括缺失和突变或启动子区域的甲基化。可以针对此种基因进行治疗。Sandig等[17]利用腺病毒作载体同时转染p16和p53基因，对人肝细胞癌裸鼠动物模型进行基因治疗，结果能明显抑制肿瘤的生长。
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4 抑制血管生成的基因治疗
固体肿瘤的生长及增殖，需要新生血管提供足够的血运。因此，抑制肿瘤血管形成成为治疗肿瘤的另一策略。然而，长期全身投以抑制血管生成的药物存在实际上的困难。脑肿瘤位于颅内，由于血脑屏障的存在，肿瘤内很难获得有效的血药浓度。基因治疗可以克服以上的不足之处。近年来，肿瘤新生血管的促进因子与抑制因子的关系已部分阐明。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生长的促进因子。Im等[18]利用腺病毒载体将VEGF cDNA分子转染到胶质瘤细胞中，重组腺病毒载体Ad5 CMV-alpha VEGF携带野生型VEGF 165 cDNA反义编码序列，恶性胶质瘤细胞被其感染后，检测到内源性VEGF mRNA明显减少，相应的VEGF蛋白也明显减少。将Ad5 CMV-alpha VEGF注入到荷胶质瘤裸鼠体表的肿瘤中，明显抑制肿瘤的生长。血管抑素(angiostatin)和血小板因子4等血管生成抑制因子的基因治疗也有报道。血管抑素是33kDa的纤溶酶原片段，在肿瘤原发灶分泌，能抑制转移灶的增殖。其作用机制目前还未完全阐明，只知其有选择地作用于血管内皮细胞，抑制其增殖。对静止期的血管内皮细胞及其他细胞不起作用。将血管抑素基因导入胶质瘤细胞，在体内抑制血管生成，肿瘤细胞凋亡，肿瘤缩小[19]。
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p53亦有抑制血管生成的作用，其在血小板反应素(thrombospondin,TSP)诱导下作用于纤维母细胞，抑制血管生成[20]。野生型p53基因有诱导胶质瘤细胞株中血管生成抑制因子GD-AIF(glioma-derived angiogenesis inhibitory factor)的作用[21]。BAI-1(brain-specific angiogenesis inhibitor 1)是GD-AIF中的一种[22]，它与胶质瘤的恶化及进展有关，随着其作用机制的阐明，有希望在临床中应用。
欧美等国家已开始进行胶质瘤基因治疗的临床实验，但效果却不尽人意[5]。对小的肿瘤有效，而对大的肿瘤效果不明显。究其原因，一是载体的基因导入效率比动物实验低，二是肿瘤组织中载体的分布较局限。
针对脑肿瘤的基因治疗目前全世界已施行了2000多例，目前其仅是辅助治疗手段，尚不能凌驾于传统方法之上[1]。然而，随着基础研究的进展，基因治疗的方法也会逐渐完善。基因治疗应对癌组织产生最大的效果，而对正常组织的损害减少到最低限度。为达到以上目标，现正对载体进行改良。第2代载体的开发已有阶段性成果。理想的载体必须具备以下特点：(1)转染率高；(2)分离及纯化容易；(3)对正常组织无损害；(4)生产成本低；(5)能特异地导入。目前常用的两种载体各有其优缺点，反转录病毒载体能高效地将目的基因导入分裂期细胞，且表达稳定，但纯化和浓缩困难。腺病毒载体能有效地转染非分裂期细胞，携带大量的基因序列，可表达大量的基因产物，易纯化和浓缩。主要不足是目的基因表达不稳定，病毒能引起宿主的免疫反应。目前较有希望的病毒载体为AAV，此病毒能感染包括肺及肌肉在内的多种细胞，能将其基因整合到宿主的染色体中。而且，AAV能感染非分裂期细胞且不引起宿主的免疫反应。从此点上看，AAV明显优于反转录病毒及腺病毒。Mark和Kathryn等利用AAV载体对血友病动物进行基因治疗，获得了长期稳定的表达[23]。然而AAV也有其缺陷之处。第一，它只能负载较短的基因序列，这就限制了它的作用。第二，因其随机整合到宿主的染色体中，不能排除诱导癌变的危险。第三，由于制造困难，难以获得足够量的载体。也有学者设法应用多种载体的组合来提高基因的导入效率。日本名古屋大学夏目小组利用腺病毒或AAV与阳离子脂质体组合，将基因的导入率提高10倍[24]。
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各种基因治疗脑胶质瘤的策略都有一定的局限性，如自杀基因疗法中GCV的毒性作用、血脑屏障的阻碍、外源病毒或病毒细胞的排斥反应等；免疫基因治疗由于中枢神经免疫原性较弱，抗肿瘤效果不如外周系统。因此国内外学者最近提出联合基因治疗[25]，这将会是一种较新的策略，也是今后基因治疗的一大发展方向，联合基因治疗有自杀基因与细胞因子基因结合，自杀基因同化疗、放疗结合，细胞因子间联合基因治疗等。随着基因转移系统的逐步完善，选择更好的目的基因，相信基因治疗必将成为常规治疗的有力武器。
参考文献
1，Natsume A,Yoshida J.Gene therapy for glioma.Shinkei Kenkyu no Shinpo (Japanese),1999,43(3)∶359
2，Culver KW，Ram Z,Wallbridge S,et al.In vivo gene transfer with retroviral vector-produce cells for treatment of experimental brain tumors.Science,1992,256∶1550
, http://www.100md.com
3，Freeman SM,Ramesh R,Marrogi AJ.Immune system in suicide-gene therapy.Lancet,1997,349∶2
4，Beltinger C,Fulda S,Kammertoens T,et al.Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir-induced apoptosis involves ligand-independent death receptor aggregation and activation of caspases.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96∶8699
5，Ram Z,Culver KW,Oshiro EM,et al.Therapy of malignant brain tumors by intratumoral implantation of retroviral vector produ-
, 百拇医药
cing cells.Nat Med,1997,3∶1354
6，Chen SH,Shine HD,Goodman JC,et al.Gene therapy for brain tumors:regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91∶3054
7，Mizuno M,Yoshida J,Colosi P,et al.Adeno-associated virus vector containing the herpes simplex virus thymidine kinase gene causes complete regression of intracerebrally implanted human glioma in mice,in conjugation with ganciclovir administration.Jpn J Cancer Res,1998,89∶76
, 百拇医药
8，徐舲飞，戈 凯，郑仲承，等.CD自杀基因系统对胶质瘤细胞作用的实验研究.实验生物学报，1996，29(4)∶385
9，Sobol RE,Fakhrai H,Shawler D,et al.Interleukin-2 gene therapy in a patient with glioblastoma.Gene Ther,1995,2∶164
10，Trojan J,Johnson TR,Rudin SD,et al.Treatment and prevention of rat glioblastoma by immunogenic C6 cells expressing antisense insulin-like growth factor 1 RNA.Science,1993,259∶94
11，Yoshida J,Mizuno M,Yagi K.Cytotoxicity of human β-interferon produced in human glioma cells transfected with its gene by means of liposomes.Biochem Int,1992,28∶1055
, 百拇医药
12，Mizuno M,Yoshida J,Sugita K,et al.Growth inhibition of glioma cells transfected with the human β-interferon gene by liposomes coupled with a monoclonal antibody.Cancer Res,1990,50∶7826
13，Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994;266∶2011
14，Kondo S,Kondo Y.Li G,et al.Trageted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5 A antisense directed against telomerase RNA.Oncogene,1998,16∶3323
, 百拇医药
15，Bogler O,Huang HJ,Kleihues P,et al.The p53 gene and its role in human brain tumors.Glia,1995,15∶308
16，Sidransky D,Mikkelsen T,Schwechheimer K,et al.Clonal expansion of p53 mutant cells is associated with brain tumour progression.Nature,1992,355∶846
17，Sandig V,Brand K,Herwig S,et al.Adenovirally transferred p16 INK4/CDKN2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death.Nature Med,1997,3∶313
, 百拇医药
18，Im SA,Gomez-Manzano-C,Fueyo J,et al.Antiangiogenesis treatment for gliomas transfer of antisense vascular endothelial growth factor inhibits tumor growth in vivo.Cancer Res,1999,59(4)∶895
19，Tanaka T,Cao Y,Folkman J,et al.Viral vector-targeted antiangiogenic gene therapy utilizing an angiostatin complementary DNA.Cancer Res,1998,58∶3362
20，Dameron KM,Volpert OV,Bouck N.Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1.Science,1994,265∶1582
, http://www.100md.com
21，van Meir EG,Polverini PJ,Chazin VR.Release of an inhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells.Nat Genet,1994,8∶171
22，Nishimori H,Shiratsuchi T,Urano T.A novel brain specific p53-target gene,BAI1,containing thrombospondin type 1 repeats inhibits experimental angiogenesis.Oncogene,1997,15∶2145
23，Kmiec B.Gene therapy.American Scientist,1999,97∶240
24，Mizuno M,Yoshida J.Improvement of transduction efficiency of recombinant adeno-associated virus vector by entrapment in multilamellar liposomes.Jpn J Cancer Res,1998,89∶352
25，李向东，惠国桢，卢大儒，等.腺病毒介导HSV-tk和反义IGF-1联合基因治疗鼠脑胶质瘤.中华神经外科杂志，1999，15(4)∶212
收稿：2000-06-23, 百拇医药