SLE患者外周血单个核细胞凋亡的研究
作者：陈琦 殷志伟 步鸣
单位：苏州医学院病理生理学教研室，苏州，215007
关键词：系统性红斑狼疮；外周血单个核细胞；凋亡；自身抗体
苏州医学院学报000708 摘要 目的 探讨SLE患者外周血单个核细胞(PBMC)凋亡率异常是否与其自身抗体产生高低有关。方法 采用碘化丙锭(PI)染色法，在流式细胞仪下定量检测20例SLE患者及10名正常人PBMC体外凋亡情况，同时观察了SLE患者自身抗体的表达及与凋亡率的关系。结果 SLE患者PBMC体外培养0、24、48、72h后凋亡率较正常人明显增高(P<0.05)，且活动期SLE高于非活动期(P<0.05)。SLE患者自身抗体产生越多者较自身抗体产生少者的凋亡率明显增高(P<0.01)。结论 SLE患者PBMC的凋亡加速，与其自身抗体产生增高有关，可能在SLE的发病机制中起一定作用。
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中图法分类号 R593.2403
Accelerated Apoptosis of Peripheral Blood Mononuclear Cell from Patients with Systemic Lupus Erythematosus
Chen Qi,Yin Zhiwei,Bu Ming
(Department of Pathophysiology,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To investigate whether there is correlation between abnormal rate of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) apoptosis and autoantibody level.Methods Using flow cytometry and propidium iodide(PI) staining,the rates of apoptosis in different PBMC from patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and from the healthy controls were investigated.The relationship of between the expression of autoantibody and apoptotic rate of PBMC from SLE patients was determined.Results After PBMCs were incubated for 0,24,48,72 hours,the rate of PBMC apoptosis in 20 SLE patients increased significantly compared with that in the 10 healthy controls (P<0.05).And the rate of PBMC apoptosis from active SLE patients were higher than that from inactive SLE patients.The results also showed that the more the production of autoantibodies,the higher the rate of apoptosis (P<0.01).Conclusion The apoptosis of PBMC in SLE accelerates in vitro,by which autoantibodies are produced.The abnormalities of PBMC apoptosis may contribute to the pathogenesis of SLE.
, 百拇医药
Key words systemic lupus erythematosus;peripheral blood mononuclear cell;apoptosis;autoantibody
系统性红斑狼疮(SLE)是一种病因未明的自身免疫性疾病，其特征为淋巴细胞异常，体内存在大量自身抗体[1]。因为细胞凋亡在控制免疫系统的细胞分化、发育和增殖中发挥重要作用，细胞凋亡已成为当前自身免疫性疾病研究的热点之一[2]。我们观察了SLE患者及正常人外周血单个核细胞(PBMC)凋亡情况，以及自身抗体产生与凋亡率间的关系，旨在了解SLE患者PBMC凋亡异常在其发病中的作用。
1 材料和方法
1.1 对象 SLE患者为我院附属一院皮肤科门诊病人，全部符合美国风湿病协会(ARA)1982年修订的诊断标准，活动期及非活动期的判断均参照文献[3]标准。活动期SLE 10例，年龄18～48岁；非活动期SLE 10例，年龄19～60岁；正常对照组10人，年龄20～49岁，为苏州市中心血库健康献血员。以上患者和对照组均为女性。
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1.2 实验方法
1.2.1 正常人及SLE患者PBMC体外凋亡的观察 取5～8ml外周静脉血(每毫升含25U肝素抗凝)，用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液分离出PBMC。将以上PBMC用含10%小牛血清的RPMI 1640配成5×105/ml浓度的细胞悬液，加入24孔培养板(Coster),每孔1ml。细胞置37℃、5%CO2环境下分别培养0、24、48、72h。
1.2.2 凋亡细胞检测[4] 收集细胞，PBS洗2次。70%乙醇500μl固定，4℃过夜。PBS洗2次，去除固定液，加入50μg/ml RNase,37℃,30min。再加碘化丙锭(PI)染液200μl (10μg/ml PI，含0.1% Triton X-100),避光4℃，30min。用流式细胞仪(美国Coulter产品)进行细胞周期分析，亚二倍体区的DNA百分率反映了凋亡细胞的比例。
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1.3 自身抗体检测 在抽血作细胞凋亡检测的同时，用免疫印迹法检测血清自身抗体，包括ANA、抗dsDNA、抗sm、抗RNP、抗ss-A、抗ss-B等。
1.4 统计方法 实验数据以
±s表示，凋亡细胞百分率经平方根反正弦转换后作方差分析、t检验。
2 结果
2.1 正常人、SLE患者PBMC体外凋亡的检测 随着培养时间的延长，3个实验组的细胞凋亡率逐渐升高。活动期及非活动期SLE患者PBMC在体外培养0、24、48、72h后凋亡率均较正常对照组明显增高，在培养24、48h后可达正常的近3倍；且活动期SLE组较非活动期SLE组PBMC凋亡率明显增高。见表1。
表1 正常组及SLE患者PBMC体外凋亡情况 培养时间
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(h)
细胞凋亡率(%)
正常组
非活动期SLE
活动期SLE
0
1.36±
0.74
1.73±
1.04*
2.80±
1.27*Δ
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24
4.35±
1.17
15.16±
4.08**
23.05±
6.35**ΔΔ
48
10.62±
3.24
22.36±
5.87**
, 百拇医药
37.83±
9.28**ΔΔ
72
19.59±
5.74
27.86±
8.56*
44.04±
6.79**ΔΔ
与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01;与非活动期SLE相比，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01
2.2 SLE患者自身抗体产生与凋亡率的关系 如表2所示，SLE患者中2种以上自身抗体阳性者与1种或无自身抗体阳性者比较，PBMC培养0、24、48、72h后凋亡率均明显增高(P<0.01)。
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表2 有2种以上与1种或无自身抗体的SLE患者PBMC
凋亡率比较 培养时间
(h)
凋亡率(%)
≥2种抗体(n=12)
≤1种抗体(n=8)
0
2.86±
1.09**
1.23±
0.40
24
, 百拇医药
22.29±
5.85**
13.81±
4.51
48
35.28±
10.14**
19.22±
3.39
72
42.56±
7.03**
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24.93±
7.38
**与≤1种抗体组比较，P<0.01
3 讨论
研究认为[5]，凋亡与免疫细胞的发育、分化过程密不可分。免疫细胞凋亡的异常会导致免疫系统功能的异常，从而引起自身免疫性疾病或免疫缺陷。本研究采用流式细胞仪检测细胞的DNA变化。凋亡时，DNA发生断裂，造成细胞内DNA含量下降，通过PI直接标记DNA量来检测凋亡。其标志是亚二倍体细胞峰的出现即凋亡峰。凋亡峰的高低表示了凋亡细胞数的多少，可对凋亡作定量研究。结果表明，活动期及非活动期SLE患者PBMC体外凋亡率较正常人明显升高(P<0.05)，且活动期高于非活动期(P<0.05)。在培养24、48、72h后，随着培养时间的延长，SLE患者的凋亡率增加，其增加速度比正常人快。这与国外报道一致[6]。SLE患者PBMC体外凋亡增加的原因目前尚不明，可能是因为淋巴细胞在体内已被激活，培养后则易于凋亡即活化诱导的细胞死亡(AICD)。也有可能是由于淋巴细胞本身与凋亡有关的基因表达异常引起[7]。SLE患者PBMC凋亡率在0h已较正常人明显升高，这反映了SLE患者体内淋巴细胞的凋亡率可能是增高的，且与疾病活动性有关。
, 百拇医药
实验结果还显示SLE患者自身抗体产生越多，凋亡率也越高，这与目前SLE发病机制的新理论[7]相一致：即SLE的细胞凋亡加速，暴露并释放出核抗原，它们作为隐蔽抗原从而激发自身免疫反应，产生大量免疫复合物，从而引起疾病的发生。且随着疾病活动的增加，凋亡更多，出现更多自身抗原及抗体，引起疾病的加重。因此SLE患者体外凋亡的增加可能间接证明了细胞凋亡异常在SLE发生及发展中的作用。
陈琦,硕士研究生
参考文献
1，Dennis MK,J Frederic Mushinski,Masaaki H,et al.Oncogene expression in autoimmune and normal peripheral blood mononuclear cells.J Exp Med,1986,163∶1292
, 百拇医药
2，Nounta JD,Zhou T,Su X,et al.The role of PCD as an emerging new concept for the pathogenesis of autoimmune disease.Clin Immunol and Immunopathol,1996,8∶s2
3，陈家福，殷志伟，冯树一，等.SLE患者白介素6活性的研究.中华皮肤科杂志，1993，26(1)∶32
4，Mccloskey TW,Oyaizn N,Coronesci M,et al.Use on flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes.Clin Immunol and Immunopathol,1994,71∶14
5，赵卫红，寿好长，闫福岭，等.细胞凋亡.郑州∶河南医科大学出版社，1997∶12～14
, 百拇医药
6，Arne N,Nicola J,John C,et al.Interleukin-2 receptor common γ-chain signaling cytokines regulate activated T cell apoptosis in response to growth factor withdrawal∶selective induction of anti-apoptotic (bcl-2,bcl-X1) but not pro-apoptotic (bax,bcl-Xs) gene expression.Eur J Immunol,1996,26∶294
7，Emlen W,Niebur J,Kadera R,et al.Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus.J Immunol,1994,152(7)∶3685
收稿：2000-03-02, 百拇医药
单位：苏州医学院病理生理学教研室，苏州，215007
关键词：系统性红斑狼疮；外周血单个核细胞；凋亡；自身抗体
苏州医学院学报000708 摘要 目的 探讨SLE患者外周血单个核细胞(PBMC)凋亡率异常是否与其自身抗体产生高低有关。方法 采用碘化丙锭(PI)染色法，在流式细胞仪下定量检测20例SLE患者及10名正常人PBMC体外凋亡情况，同时观察了SLE患者自身抗体的表达及与凋亡率的关系。结果 SLE患者PBMC体外培养0、24、48、72h后凋亡率较正常人明显增高(P<0.05)，且活动期SLE高于非活动期(P<0.05)。SLE患者自身抗体产生越多者较自身抗体产生少者的凋亡率明显增高(P<0.01)。结论 SLE患者PBMC的凋亡加速，与其自身抗体产生增高有关，可能在SLE的发病机制中起一定作用。
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中图法分类号 R593.2403
Accelerated Apoptosis of Peripheral Blood Mononuclear Cell from Patients with Systemic Lupus Erythematosus
Chen Qi,Yin Zhiwei,Bu Ming
(Department of Pathophysiology,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To investigate whether there is correlation between abnormal rate of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) apoptosis and autoantibody level.Methods Using flow cytometry and propidium iodide(PI) staining,the rates of apoptosis in different PBMC from patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and from the healthy controls were investigated.The relationship of between the expression of autoantibody and apoptotic rate of PBMC from SLE patients was determined.Results After PBMCs were incubated for 0,24,48,72 hours,the rate of PBMC apoptosis in 20 SLE patients increased significantly compared with that in the 10 healthy controls (P<0.05).And the rate of PBMC apoptosis from active SLE patients were higher than that from inactive SLE patients.The results also showed that the more the production of autoantibodies,the higher the rate of apoptosis (P<0.01).Conclusion The apoptosis of PBMC in SLE accelerates in vitro,by which autoantibodies are produced.The abnormalities of PBMC apoptosis may contribute to the pathogenesis of SLE.
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Key words systemic lupus erythematosus;peripheral blood mononuclear cell;apoptosis;autoantibody
系统性红斑狼疮(SLE)是一种病因未明的自身免疫性疾病，其特征为淋巴细胞异常，体内存在大量自身抗体[1]。因为细胞凋亡在控制免疫系统的细胞分化、发育和增殖中发挥重要作用，细胞凋亡已成为当前自身免疫性疾病研究的热点之一[2]。我们观察了SLE患者及正常人外周血单个核细胞(PBMC)凋亡情况，以及自身抗体产生与凋亡率间的关系，旨在了解SLE患者PBMC凋亡异常在其发病中的作用。
1 材料和方法
1.1 对象 SLE患者为我院附属一院皮肤科门诊病人，全部符合美国风湿病协会(ARA)1982年修订的诊断标准，活动期及非活动期的判断均参照文献[3]标准。活动期SLE 10例，年龄18～48岁；非活动期SLE 10例，年龄19～60岁；正常对照组10人，年龄20～49岁，为苏州市中心血库健康献血员。以上患者和对照组均为女性。
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1.2 实验方法
1.2.1 正常人及SLE患者PBMC体外凋亡的观察 取5～8ml外周静脉血(每毫升含25U肝素抗凝)，用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液分离出PBMC。将以上PBMC用含10%小牛血清的RPMI 1640配成5×105/ml浓度的细胞悬液，加入24孔培养板(Coster),每孔1ml。细胞置37℃、5%CO2环境下分别培养0、24、48、72h。
1.2.2 凋亡细胞检测[4] 收集细胞，PBS洗2次。70%乙醇500μl固定，4℃过夜。PBS洗2次，去除固定液，加入50μg/ml RNase,37℃,30min。再加碘化丙锭(PI)染液200μl (10μg/ml PI，含0.1% Triton X-100),避光4℃，30min。用流式细胞仪(美国Coulter产品)进行细胞周期分析，亚二倍体区的DNA百分率反映了凋亡细胞的比例。
, 百拇医药
1.3 自身抗体检测 在抽血作细胞凋亡检测的同时，用免疫印迹法检测血清自身抗体，包括ANA、抗dsDNA、抗sm、抗RNP、抗ss-A、抗ss-B等。
1.4 统计方法 实验数据以
±s表示，凋亡细胞百分率经平方根反正弦转换后作方差分析、t检验。2 结果
2.1 正常人、SLE患者PBMC体外凋亡的检测 随着培养时间的延长，3个实验组的细胞凋亡率逐渐升高。活动期及非活动期SLE患者PBMC在体外培养0、24、48、72h后凋亡率均较正常对照组明显增高，在培养24、48h后可达正常的近3倍；且活动期SLE组较非活动期SLE组PBMC凋亡率明显增高。见表1。
表1 正常组及SLE患者PBMC体外凋亡情况 培养时间
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(h)
细胞凋亡率(%)
正常组
非活动期SLE
活动期SLE
0
1.36±
0.74
1.73±
1.04*
2.80±
1.27*Δ
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24
4.35±
1.17
15.16±
4.08**
23.05±
6.35**ΔΔ
48
10.62±
3.24
22.36±
5.87**
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37.83±
9.28**ΔΔ
72
19.59±
5.74
27.86±
8.56*
44.04±
6.79**ΔΔ
与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01;与非活动期SLE相比，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01
2.2 SLE患者自身抗体产生与凋亡率的关系 如表2所示，SLE患者中2种以上自身抗体阳性者与1种或无自身抗体阳性者比较，PBMC培养0、24、48、72h后凋亡率均明显增高(P<0.01)。
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表2 有2种以上与1种或无自身抗体的SLE患者PBMC
凋亡率比较 培养时间
(h)
凋亡率(%)
≥2种抗体(n=12)
≤1种抗体(n=8)
0
2.86±
1.09**
1.23±
0.40
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22.29±
5.85**
13.81±
4.51
48
35.28±
10.14**
19.22±
3.39
72
42.56±
7.03**
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7.38
**与≤1种抗体组比较，P<0.01
3 讨论
研究认为[5]，凋亡与免疫细胞的发育、分化过程密不可分。免疫细胞凋亡的异常会导致免疫系统功能的异常，从而引起自身免疫性疾病或免疫缺陷。本研究采用流式细胞仪检测细胞的DNA变化。凋亡时，DNA发生断裂，造成细胞内DNA含量下降，通过PI直接标记DNA量来检测凋亡。其标志是亚二倍体细胞峰的出现即凋亡峰。凋亡峰的高低表示了凋亡细胞数的多少，可对凋亡作定量研究。结果表明，活动期及非活动期SLE患者PBMC体外凋亡率较正常人明显升高(P<0.05)，且活动期高于非活动期(P<0.05)。在培养24、48、72h后，随着培养时间的延长，SLE患者的凋亡率增加，其增加速度比正常人快。这与国外报道一致[6]。SLE患者PBMC体外凋亡增加的原因目前尚不明，可能是因为淋巴细胞在体内已被激活，培养后则易于凋亡即活化诱导的细胞死亡(AICD)。也有可能是由于淋巴细胞本身与凋亡有关的基因表达异常引起[7]。SLE患者PBMC凋亡率在0h已较正常人明显升高，这反映了SLE患者体内淋巴细胞的凋亡率可能是增高的，且与疾病活动性有关。
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实验结果还显示SLE患者自身抗体产生越多，凋亡率也越高，这与目前SLE发病机制的新理论[7]相一致：即SLE的细胞凋亡加速，暴露并释放出核抗原，它们作为隐蔽抗原从而激发自身免疫反应，产生大量免疫复合物，从而引起疾病的发生。且随着疾病活动的增加，凋亡更多，出现更多自身抗原及抗体，引起疾病的加重。因此SLE患者体外凋亡的增加可能间接证明了细胞凋亡异常在SLE发生及发展中的作用。
陈琦,硕士研究生
参考文献
1，Dennis MK,J Frederic Mushinski,Masaaki H,et al.Oncogene expression in autoimmune and normal peripheral blood mononuclear cells.J Exp Med,1986,163∶1292
, 百拇医药
2，Nounta JD,Zhou T,Su X,et al.The role of PCD as an emerging new concept for the pathogenesis of autoimmune disease.Clin Immunol and Immunopathol,1996,8∶s2
3，陈家福，殷志伟，冯树一，等.SLE患者白介素6活性的研究.中华皮肤科杂志，1993，26(1)∶32
4，Mccloskey TW,Oyaizn N,Coronesci M,et al.Use on flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes.Clin Immunol and Immunopathol,1994,71∶14
5，赵卫红，寿好长，闫福岭，等.细胞凋亡.郑州∶河南医科大学出版社，1997∶12～14
, 百拇医药
6，Arne N,Nicola J,John C,et al.Interleukin-2 receptor common γ-chain signaling cytokines regulate activated T cell apoptosis in response to growth factor withdrawal∶selective induction of anti-apoptotic (bcl-2,bcl-X1) but not pro-apoptotic (bax,bcl-Xs) gene expression.Eur J Immunol,1996,26∶294
7，Emlen W,Niebur J,Kadera R,et al.Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus.J Immunol,1994,152(7)∶3685
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