实验性局灶性脑缺血再灌注Fos蛋白的表达
作者：卞杰勇 周岱 张世明
单位：苏州医学院附属第一医院神经外科，苏州，215006
关键词：Fos蛋白；局灶性脑缺血；再灌注；大鼠
苏州医学院学报000704 摘要 目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注Fos蛋白表达的意义及其机制。方法 采用免疫组化法观察Fos蛋白在大鼠局灶性脑缺血再灌注后皮层和基底节区的动态变化。结果 Fos蛋白在大脑中动脉阻断1h后，随再灌注时间延长其分布不同。基底节区持续时间长，阳性细胞多，而皮层持续时间短，阳性细胞少。其中再灌注90min,Fos蛋白表达最显著。大脑中动脉供血中心区皮层几无表达。结论 Fos蛋白的表达与神经细胞存活密切相关，出现Fos蛋白表达的区域神经元易于耐受缺血性损害而存活，可能是神经细胞自我保护机制之一，Fos蛋白的表达存在扩散抑制。
中图法分类号 R743.31
, http://www.100md.com
Expression of Fos Protein in Rat after Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion
Bian Jieyong,Zhou Dei,Zhang Shiming
(Department of Neurosurgery,The First Hospital Affliated to Suzhou Medical College,Suzhou,215006)
Abstract Objective To investigate the expression of Fos protein and its implication in rat with focal cerebral ischemia and reperfusion.Methods Immunstaining by using antibody agaist Fos protein was applied.Results After 1h blockage of the middle cerebral artery,there were noted positive neurons in the basal ganglia 30 min after reperfusion,and peaked 90 min after reperfusion;decreased 3h after reperfusion;also a little positive expression in ipsilateral cortex 6h;but nearly no positive neurons in the central area of ischemia.Conclusion It suggests that the distribution and change of Fos protein may protect the ischemic neurons from injuring;spreading depression may involved in the expression of Fos protein.
, 百拇医药
Key words focal cerebral ischemia;reperfusion;Fos protein;rat
Fos蛋白是c-fos原癌基因表达的一种DNA结合蛋白，属于“早期可诱导基因家族”的成员之一，尽管c-fos mRNA在细胞内的基础值很低，但它能在一系列生理或病理刺激因子作用下几分钟内瞬时诱导。近年来发现脑缺血是诱导Fos蛋白表达的强刺激因素。我们研究了Fos蛋白在大鼠局灶性脑缺血再灌注后皮层和基底节区的表达，并探讨其意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠35只，体重250～280g,由苏州医学院实验动物中心提供。随机分为缺血1h未再灌注、缺血1h再灌注30min、再灌注60min、再灌注90min、再灌注3h、再灌注6h、假手术等7组，每组5只。动物模型参照Zea Longa[1]的方法制作，即用戊巴比妥钠麻醉成功后镜下分离左侧颈总、颈内、颈外动脉。从颈外动脉插入头部涂有硅橡胶的尼龙线(直径0.20mm)约17.5～18.5mm，至有轻度阻力感，固定，即制成永久的局灶性脑缺血模型。再灌注时拔出尼龙线使其头端位于颈外动脉，假手术组尼龙线仅插入10mm。不符合判定标准的模型不包括在内。
, 百拇医药
1.2 免疫组化 动物于不同时间点断头处死。10%福尔马林固定后，自额极到枕叶分为A、B、C、D、E等份。取B、C、D脑片常规脱水，石蜡包埋(60℃以下)；切片厚度4～5μm。免疫组化染色用ABC法。Fos兔抗鼠抗体，购自北京中山试剂公司，浓度为1∶40。阴性对照用羊血清代替1抗，余步骤同上。
2 结果
假手术组、缺血1h未再灌注组非缺血侧皮层、缺血再灌注组非缺血侧皮层Fos蛋白零星表达。缺血1h未再灌注组缺血侧基底节区、枕叶皮层Fos蛋白表达明显。缺血再灌注组缺血侧皮层及基底节区Fos蛋白表达水平随时相变化，基底节区(包括尾状核、壳核)、枕叶皮层在整个时相均呈相对高水平表达，再灌注30min已可见表达，再灌注90min表达最明显(见图1)，再灌注3h表达减弱，再灌注6h仅少数神经细胞表达；而大脑中动脉供血皮层区在整个时相均呈相对低水平，且时相变化不明显，大脑中动脉供血中心区皮层几无表达(见图2)；一些皮层下结构如海马亦见Fos蛋白明显表达。
, 百拇医药
图1 再灌注90min枕叶皮层Fos蛋白表达(ABC法，40×)
图2 再灌注90min顶叶皮层Fos蛋白零星表达(ABC法，10×)
3 讨论
原癌基因是近10年来生命科学的一项重大发现，当今对原癌基因的研究已远远超出了肿瘤学这一领域。在脑缺血研究中，已发现多种原癌基因的异常表达，如JUN基因族、c-fos基因族、ZIF/268等，它们在脑缺血诱导下具有不同的表达形式，而其中以对c-fos的表达研究最多。
脑缺血和再灌注可诱导c-fos快速而短暂的表达，但所报道的表达时间、部位常不一致。有作者采用大鼠单侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型进行了观察，缺血15min即可见c-fos mRNA出现；缺血时间在1h内者，不论再灌注与否，在病灶同侧的广泛大脑皮层区(超出MCA分布区)见c-fos的大量表达，而缺血中心区c-fos大多呈低水平表达；大鼠MCA近端阻塞时，尾状核、壳核外侧皮层缺血性损害最重，区域选择性c-fos表达可能与不同区域的缺血性损害轻重有关[2～4]。已有证据表明，局灶性脑缺血30min再灌流1h，c-fos mRNA亦主要表达于外侧大脑皮层；永久性缺血时，MCA供血中心区c-fos几乎不表达[5]。本实验结果表明，缺血时大脑中动脉供血中心区Fos蛋白几无表达，周边区有表达；再灌注时，MCA供血区外的广泛大脑皮层出现Fos蛋白大量表达，但随着再灌注时间延长，缺血加重，阳性表达减少，再灌注30min已可见表达，再灌注90min表达最明显，再灌注3h表达减弱，再灌注6h仅少数神经细胞表达。一些非大脑中动脉供血的皮层下结构如海马亦见Fos蛋白明显表达。有研究认为是由于扩散抑制(spreading depression,SD)所致，SD以神经元去极化的回归波和伴随的短暂Ca2+内流为特征，大鼠局灶性脑缺血时存在SD[6]，脑表面高浓度的钾导致SD，同时诱发皮层广泛的Fos蛋白表达。本实验结果说明缺血后蛋白表达存在SD现象。一些作者则认为，皮层神经元的缺血耐受性是由扩展性抑制诱发，诱导Fos蛋白等的表达，并产生适当的反应，增加神经元对第2次缺血的耐受性[7]。结合本实验结果可以认为脑缺血区Fos表达可能是一种对缺血这种应激反应的敏感标记，出现c-fos表达的区域神经元易于耐受缺血性损害而存活。近年来有作者认为轻度缺血再灌流后出现依赖于蛋白质合成的迟发性皮层梗死[8]；且许多研究认为Fos蛋白的表达与细胞的凋亡之间可能存在一定的联系[9]；另有作用认为，非MCA供血区域可出现延迟的神经元坏死现象，这种现象不能以能量衰竭或水肿形成等并发症来解释，这些区域与缺血区之间存在突触联系。推测这种远距离损害是继发的神经元变性。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Zea Longa EL,Weinsteon PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20∶84
2，Soriano MA,Ferrer I,Rodrigue Farre E,et al.Expression of c-fos and inducible hsp-70 mRNA following on the rat brain.Brain Res,1995,670∶317
3，Collaca MY,Aspey BS,de-Bellerache JS,et al.Focal ischemia causes an extensive induction of immediate early genes that are sensitive to MK-801.Stroke,1994,25∶1855
, 百拇医药
4，Kinouchi H,Sharp FR,Chan PH,et al.Induction of c-fos junB,c-jun,and hsp70-mRNA in cortex thalamus basel ganglia,and hippocampus following MCAO.J CerebBlood Flow Metab,1994,14∶808
5，An G Lin,T-N Liu,J-S Xue,et al.Expression of c-fos and c-jun family genes after focal cerebral ischemia.Ann Neurol,1993,33∶457
6，Nedergaarol M,Astrup J.Infarct rim,effect of hyperglycemia on direct current potential and [14C]2-deoxyglucose phosphorylation.J Cereb Blood Flow Metab,1996,16∶607
, http://www.100md.com
7，Du C,Hu R,Csernansky CA,et al.Very delayed infarction after mild focal cerebral ischemia:a role for apoptosis?J Cereb Blood Flow Metab,1996,16(2)∶195
8，Wiessner C,Vogel P,Neumann Haefelin TM,et al.Molecule correlates of delayed neuronal death following transient forebrain ischemia in the rat.Acta Neurochir Suppl Wien,1996,66∶1
9，Akins PT,Liu PK,Hsu CY,et al.Immediate early gene expression in response to cerebral ischemia,Friend or foe?Stroke,1996,27(9)∶1682
收稿：2000-03-09, 百拇医药
单位：苏州医学院附属第一医院神经外科，苏州，215006
关键词：Fos蛋白；局灶性脑缺血；再灌注；大鼠
苏州医学院学报000704 摘要 目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注Fos蛋白表达的意义及其机制。方法 采用免疫组化法观察Fos蛋白在大鼠局灶性脑缺血再灌注后皮层和基底节区的动态变化。结果 Fos蛋白在大脑中动脉阻断1h后，随再灌注时间延长其分布不同。基底节区持续时间长，阳性细胞多，而皮层持续时间短，阳性细胞少。其中再灌注90min,Fos蛋白表达最显著。大脑中动脉供血中心区皮层几无表达。结论 Fos蛋白的表达与神经细胞存活密切相关，出现Fos蛋白表达的区域神经元易于耐受缺血性损害而存活，可能是神经细胞自我保护机制之一，Fos蛋白的表达存在扩散抑制。
中图法分类号 R743.31
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Expression of Fos Protein in Rat after Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion
Bian Jieyong,Zhou Dei,Zhang Shiming
(Department of Neurosurgery,The First Hospital Affliated to Suzhou Medical College,Suzhou,215006)
Abstract Objective To investigate the expression of Fos protein and its implication in rat with focal cerebral ischemia and reperfusion.Methods Immunstaining by using antibody agaist Fos protein was applied.Results After 1h blockage of the middle cerebral artery,there were noted positive neurons in the basal ganglia 30 min after reperfusion,and peaked 90 min after reperfusion;decreased 3h after reperfusion;also a little positive expression in ipsilateral cortex 6h;but nearly no positive neurons in the central area of ischemia.Conclusion It suggests that the distribution and change of Fos protein may protect the ischemic neurons from injuring;spreading depression may involved in the expression of Fos protein.
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Key words focal cerebral ischemia;reperfusion;Fos protein;rat
Fos蛋白是c-fos原癌基因表达的一种DNA结合蛋白，属于“早期可诱导基因家族”的成员之一，尽管c-fos mRNA在细胞内的基础值很低，但它能在一系列生理或病理刺激因子作用下几分钟内瞬时诱导。近年来发现脑缺血是诱导Fos蛋白表达的强刺激因素。我们研究了Fos蛋白在大鼠局灶性脑缺血再灌注后皮层和基底节区的表达，并探讨其意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠35只，体重250～280g,由苏州医学院实验动物中心提供。随机分为缺血1h未再灌注、缺血1h再灌注30min、再灌注60min、再灌注90min、再灌注3h、再灌注6h、假手术等7组，每组5只。动物模型参照Zea Longa[1]的方法制作，即用戊巴比妥钠麻醉成功后镜下分离左侧颈总、颈内、颈外动脉。从颈外动脉插入头部涂有硅橡胶的尼龙线(直径0.20mm)约17.5～18.5mm，至有轻度阻力感，固定，即制成永久的局灶性脑缺血模型。再灌注时拔出尼龙线使其头端位于颈外动脉，假手术组尼龙线仅插入10mm。不符合判定标准的模型不包括在内。
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1.2 免疫组化 动物于不同时间点断头处死。10%福尔马林固定后，自额极到枕叶分为A、B、C、D、E等份。取B、C、D脑片常规脱水，石蜡包埋(60℃以下)；切片厚度4～5μm。免疫组化染色用ABC法。Fos兔抗鼠抗体，购自北京中山试剂公司，浓度为1∶40。阴性对照用羊血清代替1抗，余步骤同上。
2 结果
假手术组、缺血1h未再灌注组非缺血侧皮层、缺血再灌注组非缺血侧皮层Fos蛋白零星表达。缺血1h未再灌注组缺血侧基底节区、枕叶皮层Fos蛋白表达明显。缺血再灌注组缺血侧皮层及基底节区Fos蛋白表达水平随时相变化，基底节区(包括尾状核、壳核)、枕叶皮层在整个时相均呈相对高水平表达，再灌注30min已可见表达，再灌注90min表达最明显(见图1)，再灌注3h表达减弱，再灌注6h仅少数神经细胞表达；而大脑中动脉供血皮层区在整个时相均呈相对低水平，且时相变化不明显，大脑中动脉供血中心区皮层几无表达(见图2)；一些皮层下结构如海马亦见Fos蛋白明显表达。
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图1 再灌注90min枕叶皮层Fos蛋白表达(ABC法，40×)
图2 再灌注90min顶叶皮层Fos蛋白零星表达(ABC法，10×)
3 讨论
原癌基因是近10年来生命科学的一项重大发现，当今对原癌基因的研究已远远超出了肿瘤学这一领域。在脑缺血研究中，已发现多种原癌基因的异常表达，如JUN基因族、c-fos基因族、ZIF/268等，它们在脑缺血诱导下具有不同的表达形式，而其中以对c-fos的表达研究最多。
脑缺血和再灌注可诱导c-fos快速而短暂的表达，但所报道的表达时间、部位常不一致。有作者采用大鼠单侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型进行了观察，缺血15min即可见c-fos mRNA出现；缺血时间在1h内者，不论再灌注与否，在病灶同侧的广泛大脑皮层区(超出MCA分布区)见c-fos的大量表达，而缺血中心区c-fos大多呈低水平表达；大鼠MCA近端阻塞时，尾状核、壳核外侧皮层缺血性损害最重，区域选择性c-fos表达可能与不同区域的缺血性损害轻重有关[2～4]。已有证据表明，局灶性脑缺血30min再灌流1h，c-fos mRNA亦主要表达于外侧大脑皮层；永久性缺血时，MCA供血中心区c-fos几乎不表达[5]。本实验结果表明，缺血时大脑中动脉供血中心区Fos蛋白几无表达，周边区有表达；再灌注时，MCA供血区外的广泛大脑皮层出现Fos蛋白大量表达，但随着再灌注时间延长，缺血加重，阳性表达减少，再灌注30min已可见表达，再灌注90min表达最明显，再灌注3h表达减弱，再灌注6h仅少数神经细胞表达。一些非大脑中动脉供血的皮层下结构如海马亦见Fos蛋白明显表达。有研究认为是由于扩散抑制(spreading depression,SD)所致，SD以神经元去极化的回归波和伴随的短暂Ca2+内流为特征，大鼠局灶性脑缺血时存在SD[6]，脑表面高浓度的钾导致SD，同时诱发皮层广泛的Fos蛋白表达。本实验结果说明缺血后蛋白表达存在SD现象。一些作者则认为，皮层神经元的缺血耐受性是由扩展性抑制诱发，诱导Fos蛋白等的表达，并产生适当的反应，增加神经元对第2次缺血的耐受性[7]。结合本实验结果可以认为脑缺血区Fos表达可能是一种对缺血这种应激反应的敏感标记，出现c-fos表达的区域神经元易于耐受缺血性损害而存活。近年来有作者认为轻度缺血再灌流后出现依赖于蛋白质合成的迟发性皮层梗死[8]；且许多研究认为Fos蛋白的表达与细胞的凋亡之间可能存在一定的联系[9]；另有作用认为，非MCA供血区域可出现延迟的神经元坏死现象，这种现象不能以能量衰竭或水肿形成等并发症来解释，这些区域与缺血区之间存在突触联系。推测这种远距离损害是继发的神经元变性。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Zea Longa EL,Weinsteon PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20∶84
2，Soriano MA,Ferrer I,Rodrigue Farre E,et al.Expression of c-fos and inducible hsp-70 mRNA following on the rat brain.Brain Res,1995,670∶317
3，Collaca MY,Aspey BS,de-Bellerache JS,et al.Focal ischemia causes an extensive induction of immediate early genes that are sensitive to MK-801.Stroke,1994,25∶1855
, 百拇医药
4，Kinouchi H,Sharp FR,Chan PH,et al.Induction of c-fos junB,c-jun,and hsp70-mRNA in cortex thalamus basel ganglia,and hippocampus following MCAO.J CerebBlood Flow Metab,1994,14∶808
5，An G Lin,T-N Liu,J-S Xue,et al.Expression of c-fos and c-jun family genes after focal cerebral ischemia.Ann Neurol,1993,33∶457
6，Nedergaarol M,Astrup J.Infarct rim,effect of hyperglycemia on direct current potential and [14C]2-deoxyglucose phosphorylation.J Cereb Blood Flow Metab,1996,16∶607
, http://www.100md.com
7，Du C,Hu R,Csernansky CA,et al.Very delayed infarction after mild focal cerebral ischemia:a role for apoptosis?J Cereb Blood Flow Metab,1996,16(2)∶195
8，Wiessner C,Vogel P,Neumann Haefelin TM,et al.Molecule correlates of delayed neuronal death following transient forebrain ischemia in the rat.Acta Neurochir Suppl Wien,1996,66∶1
9，Akins PT,Liu PK,Hsu CY,et al.Immediate early gene expression in response to cerebral ischemia,Friend or foe?Stroke,1996,27(9)∶1682
收稿：2000-03-09, 百拇医药