正常小鼠血液中环核苷酸信使的昼夜生理节律
作者：朱金华
单位：吴江市卫生防疫站，江苏吴江，215200
关键词：血液；环磷酸腺苷；环磷酸鸟苷；昼夜节律
苏州医学院学报000712 摘要 目的 从时间生理学的角度，探讨血液中环核苷酸系统的生理节律。方法 将实验动物置人工光照周期的稳定环境中饲养2周后，在昼夜6个不同时点分别取样测定。结果 小鼠血液中cAMP和cGMP含量变化呈现明显的昼夜节律特征，中值分别为104.34和64.70nmol/L，两者相差1.64倍；相位分别位于12∶56和19∶58时，相差近7h。结论 正常小鼠血液中的环核苷酸信使含量具有昼夜变化的特征。
中图法分类号 R331
Circadian Physiological Rhythm of cAMP and cGMP in Mice
, 百拇医药
Zhu Jinhua
(Wujiang Sanition and Anti-epidemic Station,Jiangsu Wujiang,215200)
Abstrat Objective From the chronophysiological point of view,this investigation measures the rhythm of cAMP and cGMP in mice.Methods cAMP and cGMP levels in blood were measured for 6 times in a day.Results Different rhythms of cAMP and cGMP producing were observed in blood of mice.The peak phase of cAMP was at 12∶56 and that of cGMP at 19∶58.Conclusion The concentration rhythms of cAMP and cGMP producing were different in blood of mice.
, 百拇医药
Key words blood;cAMP;cGMP;circadian rhythm
近年来的时间生物学研究表明，动物和人的生理系统具有多种显性节律。昼夜节律是生命系统的重要特征，第二信使系统是普遍存在于包括中枢核团细胞在内的一种细胞信号传递系统，其中cAMP和cGMP为最具代表性的两种，它们在细胞内的含量具有昼夜节律性[1，2]。本文以正常昆明种小鼠血液中cAMP和cGMP含量和cAMP/cGMP比值为指标，观察其含量变化的昼夜节律性改变，以期为时间生物学等基础研究提供依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组与处理 健康雄性昆明种小鼠(由苏州医学院实验动物中心提供)，共36只，体重18～25g，随机分为6组，每组6只。为了使环境信号对动物的整合作用标准化，在正式实验前，先使小鼠在稳定的人工光照周期(14∶00～2∶00光照，2∶00～14∶00黑暗)和室温(20±3℃)条件下自由进食喂养2周。光照期光强度为250～350 lx(鼠笼中央)，黑暗期操作时红灯光强度为15～25 lx。动物光适应2周后，分别于1天中的6个时点04∶00、08∶00、12∶00、16∶00、20∶00、24∶00，用眼球摘除法采集各组小鼠血样，以密度梯度离心法分离血浆，置20℃冰箱保存备用(1周内使用)。
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1.2 cAMP和cGMP测定 采用放射免疫测定法。药盒由上海中医药大学同位素室提供，cAMP和cGMP的提取和测定程序按药盒说明书进行。样品经FJ-2008自动免疫计数器(西安核仪器厂产品)计数cpm值后，结果用Riaoff软件处理换算为血中的cAMP和cGMP量(nmol/L)。
1.3 统计分析 测定结果以
±Sx表示。并对1天中6个不同时点的测定值，用余弦分析法处理[3]，经振幅检验(F检验)确定是否存在昼夜节律，并对节律用余弦方程进行拟合F(t)=M+A×COS(ωt+Φ)，式中M为中值，即涨落变化的中线；A为节律振荡的振幅，表示上下波动的幅度；ω为角速度(360°/24h)；Φ为峰值相位，即振荡到达顶峰的时刻。
2 结果
2.1 小鼠血中cAMP和cGMP含量的昼夜变化 由附表可知，正常雄性昆明种小鼠血液中cAMP和cGMP的含量水平，在1天中的不同时间有所差异，cAMP的含量在1天中的12∶00～16∶00时处于高峰，24∶00时处于低谷；而cGMP含量高峰则相对延迟(20∶00～24∶00时)。由此可见两者在血液中含量高峰出现的时间是不同的。
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附表 正常小鼠血液中cAMP和cGMP含量的昼夜水平
(nmol/L，±Sx) 时间
cAMP
cGMP
cAMP/cGMP
04∶00
82.50±16.32
60.20±11.73
1.38±0.37
08∶00
, http://www.100md.com
104.80±9.83
55.50±12.46
1.89±0.12
12∶00
48.40±11.27
64.45±10.57
2.30±0.26
16∶00
141.86±16.21
63.80±15.35
2.25±0.51
, 百拇医药 20∶00
82.40±7.35
77.00±7.35
1.07±0.09
24∶00
64.80±7.89
67.80±10.27
0.96±0.07
日平均
104.34±34.11
64.70±7.30
1.64±0.59
, 百拇医药
2.2 小鼠血中cAMP和cGMP含量的昼夜节律 对小鼠血液中cAMP和cGMP含量昼夜变化的水平进行余弦分析，结果发现正常小鼠血液中cAMP的含量变化存在以24h为周期的昼夜节律，峰值相位为12∶56时。血液中1天24h内cGMP含量变化同样呈现出昼夜节律的特征，但峰值位于19∶58时，与cAMP的峰值相位相差将近7h，结果见图1。
图1 小鼠血液中cAMP和cGMP含量的昼夜曲线
曲线议程：Y=(cAMP)=104.34+42.54Cos(wt-194.00)
Y(cGMP)=64.79+8.33Cos(wt-299.50)
2.3 小鼠血中cAMP/cGMP比值的变化 1天24h内cAMP和cGMP含量的波动表现不同的规律，为了综合说明环核苷酸系统的周期性变化，将两者的结果相比，发现正常小鼠血液中cAMP/cGMP比值同样表现出以24h为周期的涨落变化(见附表、图2)。
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图2 小鼠血液中cAMP/cGMP比值的昼夜曲线
曲线议程：Y=1.64+0.73Cos(wt-181.14)
3 讨论
机体的一切生命现象都依赖细胞内外信息的传递和调控。环核苷酸作为生物体细胞内重要的第二信使，不仅参与调节不同的生化代谢和生理功能，而且在病理反应过程中也起介导作用。许多对机体有害的环境因素如辐射可能通过环核苷酸的介导发挥生物效应，近来已有不少这方面的报道。但这些研究结果均是一次瞬时采样测定结果，而未考虑到时间结构因素对生物效应的影响。
本实验结果提示，小鼠血液中cAMP的含量在1天中的不同时刻是有变化的，存在以24h为周期的昼夜节律，中值为104.34nmol/L,峰值时点在12∶56时。而cGMP的浓度变化消长与cAMP浓度变化方向相反，说明两者是一对共轭体系。且正常小鼠血液中cGMP含量变化也呈现出以24h为周期的昼夜振荡，中值为64.70nmol/L，峰值时点在19∶58时，较cAMP相位推迟7h。本实验cAMP/cGMP比值变化同样表现出昼夜节律，中值为1.64，峰值时点在12∶04时，与cAMP的节律变化具有同步性。因此应重视cAMP/cGMP比值的重要性，因为它综合考虑了cAMP和cGMP两者的结果。环核苷酸系统昼夜节律的产生机制，目前尚未完全了解。有学者认为在高等动物体内存在着一个时间机构，由它产生并调节各种生理节律[4]。有研究表明，血液中与cAMP和cGMP代谢有关的酶[腺苷酸环化酶(AC)、鸟苷酸环化酶(GC)和环磷酸腺苷磷酸二酯酶(cAMP-PDE)、环磷酸鸟苷磷酸二酯酶(cGMP-PDE)]的分泌活性有周期性的改变[5，6]。这可能提示cAMP和cGMP含量的昼夜波动正是由于相关酶活性的昼夜变化所致。本次实验结果也提示时间因素确实能影响实验结果判断，提示对某一观察指标的结果判断要考虑到时间因素，应用时间生物学的概念来探讨某些观察指标的昼夜变化更具生物学意义，也为下一步研究辐射时间毒效应打下基础。
, 百拇医药
参考文献
1，许昌泰，王育敏.正常人心钠素环磷酸腺苷环磷酸鸟苷和血压心律的昼夜变化.中华医学杂志(台北)，1992，50(1)∶37
2，许昌泰，张瑞英，陈 睿.紫外线辐射和充氧对体外健康血cAMP、cGMP、IgA和IgG的影响.宁夏医学杂志，1995，17(1)∶19
3，童 建.余弦分析法在生物节律研究中的应用.中国卫生统计，1991，8(1)∶23
4，童 建，朱金华.免疫系统的昼夜生理节律.免疫学杂志，1995，11(2)∶99
5，Schraermyer U,Steieve H,Rack M.Cyclic 3',5'-nucleotide phosphocliesterase∶cytochemical localization in photoreceptor cells of the fly erythrocephala.J Neurocytol,1993,22(10)∶845
6，Bell GM.Diurnal and postural variations in plasma atrialnatriuretic factor,plasma guanosine 3',5'-cyclic monophosphate and sodium excretion.Clin Sci,1990,79∶371
收稿：1999-07-20, 百拇医药
单位：吴江市卫生防疫站，江苏吴江，215200
关键词：血液；环磷酸腺苷；环磷酸鸟苷；昼夜节律
苏州医学院学报000712 摘要 目的 从时间生理学的角度，探讨血液中环核苷酸系统的生理节律。方法 将实验动物置人工光照周期的稳定环境中饲养2周后，在昼夜6个不同时点分别取样测定。结果 小鼠血液中cAMP和cGMP含量变化呈现明显的昼夜节律特征，中值分别为104.34和64.70nmol/L，两者相差1.64倍；相位分别位于12∶56和19∶58时，相差近7h。结论 正常小鼠血液中的环核苷酸信使含量具有昼夜变化的特征。
中图法分类号 R331
Circadian Physiological Rhythm of cAMP and cGMP in Mice
, 百拇医药
Zhu Jinhua
(Wujiang Sanition and Anti-epidemic Station,Jiangsu Wujiang,215200)
Abstrat Objective From the chronophysiological point of view,this investigation measures the rhythm of cAMP and cGMP in mice.Methods cAMP and cGMP levels in blood were measured for 6 times in a day.Results Different rhythms of cAMP and cGMP producing were observed in blood of mice.The peak phase of cAMP was at 12∶56 and that of cGMP at 19∶58.Conclusion The concentration rhythms of cAMP and cGMP producing were different in blood of mice.
, 百拇医药
Key words blood;cAMP;cGMP;circadian rhythm
近年来的时间生物学研究表明，动物和人的生理系统具有多种显性节律。昼夜节律是生命系统的重要特征，第二信使系统是普遍存在于包括中枢核团细胞在内的一种细胞信号传递系统，其中cAMP和cGMP为最具代表性的两种，它们在细胞内的含量具有昼夜节律性[1，2]。本文以正常昆明种小鼠血液中cAMP和cGMP含量和cAMP/cGMP比值为指标，观察其含量变化的昼夜节律性改变，以期为时间生物学等基础研究提供依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组与处理 健康雄性昆明种小鼠(由苏州医学院实验动物中心提供)，共36只，体重18～25g，随机分为6组，每组6只。为了使环境信号对动物的整合作用标准化，在正式实验前，先使小鼠在稳定的人工光照周期(14∶00～2∶00光照，2∶00～14∶00黑暗)和室温(20±3℃)条件下自由进食喂养2周。光照期光强度为250～350 lx(鼠笼中央)，黑暗期操作时红灯光强度为15～25 lx。动物光适应2周后，分别于1天中的6个时点04∶00、08∶00、12∶00、16∶00、20∶00、24∶00，用眼球摘除法采集各组小鼠血样，以密度梯度离心法分离血浆，置20℃冰箱保存备用(1周内使用)。
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1.2 cAMP和cGMP测定 采用放射免疫测定法。药盒由上海中医药大学同位素室提供，cAMP和cGMP的提取和测定程序按药盒说明书进行。样品经FJ-2008自动免疫计数器(西安核仪器厂产品)计数cpm值后，结果用Riaoff软件处理换算为血中的cAMP和cGMP量(nmol/L)。
1.3 统计分析 测定结果以
±Sx表示。并对1天中6个不同时点的测定值，用余弦分析法处理[3]，经振幅检验(F检验)确定是否存在昼夜节律，并对节律用余弦方程进行拟合F(t)=M+A×COS(ωt+Φ)，式中M为中值，即涨落变化的中线；A为节律振荡的振幅，表示上下波动的幅度；ω为角速度(360°/24h)；Φ为峰值相位，即振荡到达顶峰的时刻。2 结果
2.1 小鼠血中cAMP和cGMP含量的昼夜变化 由附表可知，正常雄性昆明种小鼠血液中cAMP和cGMP的含量水平，在1天中的不同时间有所差异，cAMP的含量在1天中的12∶00～16∶00时处于高峰，24∶00时处于低谷；而cGMP含量高峰则相对延迟(20∶00～24∶00时)。由此可见两者在血液中含量高峰出现的时间是不同的。
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附表 正常小鼠血液中cAMP和cGMP含量的昼夜水平
(nmol/L，
±Sx) 时间cAMP
cGMP
cAMP/cGMP
04∶00
82.50±16.32
60.20±11.73
1.38±0.37
08∶00
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104.80±9.83
55.50±12.46
1.89±0.12
12∶00
48.40±11.27
64.45±10.57
2.30±0.26
16∶00
141.86±16.21
63.80±15.35
2.25±0.51
, 百拇医药 20∶00
82.40±7.35
77.00±7.35
1.07±0.09
24∶00
64.80±7.89
67.80±10.27
0.96±0.07
日平均
104.34±34.11
64.70±7.30
1.64±0.59
, 百拇医药
2.2 小鼠血中cAMP和cGMP含量的昼夜节律 对小鼠血液中cAMP和cGMP含量昼夜变化的水平进行余弦分析，结果发现正常小鼠血液中cAMP的含量变化存在以24h为周期的昼夜节律，峰值相位为12∶56时。血液中1天24h内cGMP含量变化同样呈现出昼夜节律的特征，但峰值位于19∶58时，与cAMP的峰值相位相差将近7h，结果见图1。
图1 小鼠血液中cAMP和cGMP含量的昼夜曲线
曲线议程：Y=(cAMP)=104.34+42.54Cos(wt-194.00)
Y(cGMP)=64.79+8.33Cos(wt-299.50)
2.3 小鼠血中cAMP/cGMP比值的变化 1天24h内cAMP和cGMP含量的波动表现不同的规律，为了综合说明环核苷酸系统的周期性变化，将两者的结果相比，发现正常小鼠血液中cAMP/cGMP比值同样表现出以24h为周期的涨落变化(见附表、图2)。
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图2 小鼠血液中cAMP/cGMP比值的昼夜曲线
曲线议程：Y=1.64+0.73Cos(wt-181.14)
3 讨论
机体的一切生命现象都依赖细胞内外信息的传递和调控。环核苷酸作为生物体细胞内重要的第二信使，不仅参与调节不同的生化代谢和生理功能，而且在病理反应过程中也起介导作用。许多对机体有害的环境因素如辐射可能通过环核苷酸的介导发挥生物效应，近来已有不少这方面的报道。但这些研究结果均是一次瞬时采样测定结果，而未考虑到时间结构因素对生物效应的影响。
本实验结果提示，小鼠血液中cAMP的含量在1天中的不同时刻是有变化的，存在以24h为周期的昼夜节律，中值为104.34nmol/L,峰值时点在12∶56时。而cGMP的浓度变化消长与cAMP浓度变化方向相反，说明两者是一对共轭体系。且正常小鼠血液中cGMP含量变化也呈现出以24h为周期的昼夜振荡，中值为64.70nmol/L，峰值时点在19∶58时，较cAMP相位推迟7h。本实验cAMP/cGMP比值变化同样表现出昼夜节律，中值为1.64，峰值时点在12∶04时，与cAMP的节律变化具有同步性。因此应重视cAMP/cGMP比值的重要性，因为它综合考虑了cAMP和cGMP两者的结果。环核苷酸系统昼夜节律的产生机制，目前尚未完全了解。有学者认为在高等动物体内存在着一个时间机构，由它产生并调节各种生理节律[4]。有研究表明，血液中与cAMP和cGMP代谢有关的酶[腺苷酸环化酶(AC)、鸟苷酸环化酶(GC)和环磷酸腺苷磷酸二酯酶(cAMP-PDE)、环磷酸鸟苷磷酸二酯酶(cGMP-PDE)]的分泌活性有周期性的改变[5，6]。这可能提示cAMP和cGMP含量的昼夜波动正是由于相关酶活性的昼夜变化所致。本次实验结果也提示时间因素确实能影响实验结果判断，提示对某一观察指标的结果判断要考虑到时间因素，应用时间生物学的概念来探讨某些观察指标的昼夜变化更具生物学意义，也为下一步研究辐射时间毒效应打下基础。
, 百拇医药
参考文献
1，许昌泰，王育敏.正常人心钠素环磷酸腺苷环磷酸鸟苷和血压心律的昼夜变化.中华医学杂志(台北)，1992，50(1)∶37
2，许昌泰，张瑞英，陈 睿.紫外线辐射和充氧对体外健康血cAMP、cGMP、IgA和IgG的影响.宁夏医学杂志，1995，17(1)∶19
3，童 建.余弦分析法在生物节律研究中的应用.中国卫生统计，1991，8(1)∶23
4，童 建，朱金华.免疫系统的昼夜生理节律.免疫学杂志，1995，11(2)∶99
5，Schraermyer U,Steieve H,Rack M.Cyclic 3',5'-nucleotide phosphocliesterase∶cytochemical localization in photoreceptor cells of the fly erythrocephala.J Neurocytol,1993,22(10)∶845
6，Bell GM.Diurnal and postural variations in plasma atrialnatriuretic factor,plasma guanosine 3',5'-cyclic monophosphate and sodium excretion.Clin Sci,1990,79∶371
收稿：1999-07-20, 百拇医药